Name: 使用新型机器人系统 Spotiton 进行时间解决研究的低温电子微观网格准备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解如何使用Spotiton机器人系统进行时间分辨冷冻电镜研究，实现90毫秒内快速混合与玻璃化。该方案可捕获亚秒级瞬态分子中间态，为结构生物学研究提供高分辨率动态信息。

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我们感谢美国亚利桑那州Engineering Arts LLC公司的Peter A. Kahn和Terry Rohde对Spotiton系统的初始设计及后续开发工作。感谢纽约结构生物学中心西蒙斯电子显微镜中心的工作人员提供的帮助和技术支持。本文所展示的工作是在位于纽约结构生物学中心的自动化分子显微镜国家资源中心完成的，该中心得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号GM103310）和西蒙斯基金会（Simons Foundation，项目号SF349247）资助的支持。

1. 设置 Spotiton 仪器及软件
<ol>
	<li>准备系统以进行分配（图1).
	<ol>
		<li>打开氮气供应罐的主阀门。确保系统储液罐中装有已脱气的超纯水。开启计算机。通过多功能电源插座开启 Spotiton 系统。</li>
		<li>点击 桌面 图标 (图2A）以打开 Spotiton 软件的用户界面（UI）图2B). 在 工具 菜单，选择 初始化阶段 初始化并校准三轴机器人（网格载台和移液载台）以及旋转分配头组件（theta 载台）。在初始化和校准前，确保分配头尖端朝下。</li>
		<li>在主窗口中，单击 转至安全位置 将机器人移至安全位置（图3). 
		注意：机器人在任意位置移动至安全位置均不会发生碰撞。</li>
		<li>在 吸出 标签，选择 启动 用储液罐中的水反复冲洗分配器头部，持续操作直至&#160; 可以看到两处尖端持续不断地有水流涌出。 
		注意：如果上次关闭系统时用甲醇冲洗进样针尖导致大量空气进入流路，则可能需要重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查分配器性能
	<ol>
		<li>在 检查 标签，将每个吸头送至检测摄像机进行试喷水，比对两个分配器的液滴生成模式图 S1). 
		注意：如果由于存在气泡导致尖端无法点火（图 S2A）或碎屑，请在清洗站清洁尖端（图 S2B) 使用 超声波清洗 在以下位置访问的功能 吸出 表。</li>
		<li>为每个分配器和样品调节点火幅度（无单位），以获得大小一致的离散液滴流。</li>
		<li>通过目视确认两个分配器产生的液滴量相当。
		<ol>
			<li>按压 记录 在上方摄像机监视器中点击按钮，录制Tip 1发射的视频。同时，在右侧监视器中回放Tip 1发射的视频，而在上方摄像机监视器中触发Tip 2的发射。图 S1). 
			注意：每次点火的视频均会被录制并存储。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分配器现已准备就绪，可在网格上进行试射。 
		注意：本方案假设已确认网格和移液台在各自的浸入位置上正确对齐。若未验证正确对齐，可能导致碰撞，从而损坏尖端或机器人。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在网格上试射水流。
	<ol>
		<li>确保机器人处于安全位置。</li>
		<li>使用提供的内六角扳手从网格机器人支架上取下镊子。</li>
		<li>在邻近的实验台面上，将测试网格（纳米线面向上）放置在网格块的边缘。小心抓住网格的边缘，将其正确放入镊子中图 S3），并重新安装镊子。</li>
		<li>在 冷冻 标签，单击 提示至摄像机 将尖端移至上方俯冲路径相机视野范围内（上方摄像头）。确保 活体 在上方摄像头监视器中进行选择，并打开上方摄像头的光源（旋转机器机柜前面的旋钮）图1).</li>
		<li>将镊子安装到网格机器人上。通过在上部摄像头监视器内点击鼠标，调整 Tip 1 的位置。 
		注意：仅提示1将可见，并会移动到点击位置。</li>
		<li>点击 网格到相机 将网格放置在上方相机前方。如有需要，按之前方法调整Tip 1的位置。</li>
		<li>选择其中一项 Tip1, 提示2，或 Tip1 和 Tip2 选择一个或两个分配器进行试运行。 
		注意：单独测试喷嘴发射时，使用鼠标将1号喷嘴在上方摄像头监视器中的网格不同横向位置进行定位。这将在网格上形成由两个喷嘴产生的不重叠的液滴条带，使用户能够确认每个喷嘴均已成功发射。</li>
		<li>在 冷冻 标签，确保 玻璃化冷冻载网 未选中时，单击 队列目标，然后在 浸入. 
		注意：移液台将轻微上升，随后是载网台。网格机器人随后将载网推过喷射分配器以及上下摄像头，最终停在甲板正上方。在用户界面左侧，上方摄像头的成像显示在下方摄像头成像的上方。</li>
		<li>评估上方和下方的图像：每个喷头在被选中时是否成功喷射？当两个喷头同时喷射时，其液体是否完全重叠，形成比单独喷射时明显更粗的条带？
		<ol>
			<li>如果任一探头未能正常激发，应执行一次或多次超声波清洗循环，直至观察到清晰的激发信号。</li>
			<li>如果样品条带未完全重叠，请使用内六角扳手将其中一个分配器的横向调节螺钉旋转四分之一圈，以调整该分配器的横向对准位置，然后进行一次测试下插。重复此操作，直至条带完全重叠。 
			&#8203;注意：如果两个探针均成功按预期发射，则系统已准备好制备样品载网。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备双样本混合载网
<ol>
	<li>更新加速度、减速度和速度值 机器参数 用于获取目标混合时间的 XML 文件。 
	注：已有文献报道过将这些值与混合时间相关联的表格15.</li>
	<li>准备样品和载网。 
	注意：从本步骤开始，制备第一张载网前将有 20–30 分钟的间隔，在此期间样品应保持在适当的温度条件下。
	<ol>
		<li>用适当的缓冲液将两个样品（即蛋白质与配体或其他相互作用伙伴）稀释至所需浓度，理想情况下，两种样品使用相同的缓冲液。 
		注意：Spotiton载网所需的蛋白浓度通常比自动冷冻投入仪所用浓度高1.5至2倍。这可能是由于蛋白在载网表面的薄水层中停留时间极短，在浸入过程中颗粒富集于气-水界面的机会较少所致。</li>
		<li>向低温罐中注入液氮。</li>
		<li>等离子清洗3-4个纳米线网格。以5 W功率、氢气和氧气混合气体、1.5分钟为起始条件。 
		注意：最有效的等离子清洗时长和程序可能因环境温度、湿度以及所用纳米线网格的批次不同而每日有所变化。其他气体混合物或辉光放电器也可能有效，但尚未针对本用途进行测试。由于纳米线对缓冲液中的水和蛋白质的毛细吸附速度通常不同，最佳实践是在使用当天将实际样品滴加于载网后，通过浸入操作评估所用网格的吸附性能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置系统中的湿度水平。 
	注意：除了用于制备和等离子体清洁网格的条件外，湿度是影响纳米线网格毛细扩散速度的另一个主要因素。尽管特定实验批次的目标相对湿度需根据每天和每批网格的经验来确定，但90-95%是一个合适的起始范围。
	<ol>
		<li>确保雾化器内已充分注入超纯水。将雾化器接通电源，观察水蒸气从雾化器盖中央出口逸出。</li>
		<li>观察主窗口中的实时湿度监测器，或打开环境湿度追踪器 报告 | 环境 (图 S4）。检查两个区域的湿度水平： 腔室 和 遮蔽物. 
		注意： 腔室 包括 Spotiton 封闭区域内的所有部分。 遮蔽物 是紧邻该区域的 &#34;在相机处&#34; 网格和分配针头的位置。当打开 enclosure 门以装载网格时，黑色树脂罩可维持设定的湿度水平。</li>
		<li>一旦达到目标湿度值，即可从 湿度 标签。选择 自动控制，并选择一个设定值及阈值，以将设定值维持在所选的阈值范围内。或者，选择 手动控制，并使用两个风扇控制调节湿度水平： 腔室风扇 和 防护罩风扇. 
		注意：开启腔室风扇会将蒸汽从左侧端口吸入过滤器，防止较大的水滴进入腔室，从而避免环境湿度进一步升高。只要腔室门保持关闭，湿度水平将稳定在设定的百分比。开启罩体风扇会将蒸汽通过右侧端口吸入罩体内，这既能减少蒸汽向腔室的释放，又能提高罩体内部的湿度水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品加入分配器中。
	<ol>
		<li>向每个样品杯中加入 5 µL 样品。 
		注意：为避免产生气泡，应将液体体积小心地沿杯内壁加入，然后振荡使样品完全沉降至杯底。</li>
		<li>将样品杯装入托盘中，Tip 1 的样品置于左侧，Tip 2 的样品置于右侧。将托盘推回仪器内，直至完全就位。</li>
		<li>在 吸出 选择标签，设定每根吸头的吸液体积为 3 µL。确保样本托盘已牢固放置，然后点击 吸出 观察移液工作站如何将分配头移至样本杯中。</li>
		<li>通过移除样品杯并观察液面下降，确认两个样品均成功吸取。</li>
		<li>在 检查 标签，将每个吸头送至检测摄像头处，以确认无阻碍的液体分配。根据需要调整振幅，使每个吸头的液滴形成保持一致（参见第1.2节）。 
		注意：用于 dispensing 蛋白质样品的 tip，其振幅可能需要调高。</li>
		<li>系统现已准备就绪，可进行样品载网的制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻样品载网
	<ol>
		<li>将 freshly plasma 清洁的载网装入镊子中，但暂不安装镊子。确保环境湿度较高，约为 90–95%。填充乙烷杯。</li>
		<li>在检查摄像头前对两个尖端进行最终试喷，确认无任何堵塞。在Cryo选项卡上，点击 提示摄像头.</li>
		<li>填充乙烷杯。若形成乙烷冰，可按需用额外的乙烷气体融化。 
		注意：步骤 2.5.4 和 2.5.5 应尽快完成（&#60;20 秒）以尽量减少：(i) 纳米线在腔室高湿度环境中的饱和；(ii) 发射蛋白质样品的探针尖端堵塞的可能性。</li>
		<li>将带有网格的镊子安装到网格载物台上。在 冷冻 标签，点击 网格到相机确保提示1在上方摄像头监视器中位置正确（参见步骤1.3.4-1.3.5）。</li>
		<li>点击 玻璃化冷冻载网, 队列目标，然后 浸入. 点击 好的 当提示操作时，指挥网格机器人将网格从乙烷中跃迁至液氮，并将其释放到浸没的支架上。 
		注意：镊子随后会回升回腔室。在跳转至液氮后，会出现提示询问载网是否从镊子上脱落。若未脱落，请点击 无，镊子将多次开合以取下载网。</li>
		<li>检查网格的图像（图 S5）以决定其应保留或弃用。</li>
		<li>若保留载网，请将其转移至预冷的载网盒中。或者，可连续点样后续的载网，然后将所有载网一次性转移至载网盒中，注意确保每个载网可通过其在放置区域中的位置进行识别。</li>
		<li>将载网转移至载网盒时，先将尖头镊子预冷，用镊子轻轻夹住载网边缘，将其放入载网盒的槽位中，起始位置为缺口左侧第一个槽位，随后按顺时针方向依次放置。</li>
		<li>当所有载网加载完毕后，将载网盒盖与盖子工具连接，并在液氮中预冷。将盖子拧紧到载网盒上，并使用盖子工具或预冷的螺丝刀拧紧。</li>
		<li>使用大号镊子将闭合的网格盒迅速转移至小型杜瓦瓶中，用于成像或长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估网格对后续电镜成像的适用性。
	<ol>
		<li>观察在网格投入后立即显示在用户界面左侧的上、下投入路径相机的图像。利用这些图像评估毛细吸水速度、两个尖端是否成功击发，以及两个样品条带重叠的程度。</li>
		<li>使用实验查看器，结合浸入时刻的设备设置和湿度测量数据，对上下两个摄像头拍摄的网格图像进行审阅和比较： 报告 | 实验.</li>
		<li>选择在透射电子显微镜下显示出良好毛细渗透迹象的载网进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berriman, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transient+structures+by+cryo-microscopy+combined+with+rapid+mixing+of+spray+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets.</a> Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).</li>
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<li>Mäeots, M. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11 (1), 3465(2020).</li>
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<li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).</li>
<li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spotiton%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Spotiton: New features and applications.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).</li>
<li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+cryo-EM+using+Spotiton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Time-resolved cryo-EM using Spotiton.</a> Nature Methods. 17, 897-900 (2020).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+%22self-wicking%22+nanowire+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing "self-wicking" nanowire grids.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).</li>
<li>Ravelli, R. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11 (1), 2563(2020).</li>
</ol>

B.C./C.S.P. 与 SPT Labtech 公司存在商业合作关系，该公司生产一种基于 Spotiton 原型的商用仪器 chameleon。

本方案概述了使用 Spotiton 机器人系统制备冷冻电镜成像用载网的流程，该载网上含有两种样品——通常为目标蛋白及其激活配体——两者混合时间为 90–500 毫秒。尽管工作流程较为直接，但用户仍需注意若干事项，以确保载网制备过程顺利进行。首先，压电分配喷头中的一个发生堵塞或阻塞而无法正常喷射的情况并不少见，这将导致在上部或下部相机拍摄的图像中观察到的液流条带明显比两个喷头均正常喷射时更窄。喷头堵塞可能由气泡滞留在喷头内干扰液滴形成所致，也可能因蛋白样品干涸并封闭了喷头狭窄的孔口引起。尽管在此过程中吸入的样品会损失，但上述两种问题均可通过超声清洗喷头并重新吸入样品来解决。为防止后续再次堵塞并减少样品浪费，关键在于样品吸入前必须充分预启动（冲洗）流体管路，并在腔室和防护罩内维持高且稳定的湿度水平。此外，即使湿度保持良好，浓度过高的蛋白样品仍可能影响喷头正常喷射。虽然在 Inspect 选项卡&#160;中提高喷射振幅可在一定程度上补偿因蛋白浓度过高导致的喷射无力，但将样品至少稀释至 1:2 比例将更有效地改善喷头喷射性能并避免堵塞。
其次，要实现理想的毛细渗透速度以生成适合目标混合时长的最佳冰层厚度，可能较为困难。通常情况下，较短的混合时间需要较快的毛细渗透，而较长的混合时间则需要较慢的毛细渗透。对于理想的毛细渗透载网，在上部相机图像中应能清晰分辨出一条液体条带，而在下部相机图像中，仅在条带位置处可见载网栅条有轻微增厚。下部相机图像中出现深色条带表明渗透过慢，通常会导致冰层过厚而不适合成像。若两幅图像中均无条带，则表明渗透过快，可能导致孔洞中已无残留水分（图S5）。多种因素可能影响毛细渗透速度，包括纳米线密度、等离子清洗的参数与持续时间、以及载网暴露于湿度环境的时间和腔室湿度设定水平。渗透不良（过慢）可能是由于载网上纳米线涂层稀疏所致。通过略微稀释纳米线溶液并延长其暴露时间16，可提高载网栅条上纳米线的密度和覆盖度，从而促进更快的毛细渗透。若纳米线密度已足够，提高等离子清洗的功率或延长处理时间也可改善渗透效果。本文推荐的参数为相对低功率、长时间处理，但可根据需要进行调整。
然而，如果特定批次的载网和等离子清洗参数在之前的实验中表现良好，则润湿性能下降可能是由于纳米线在腔室内长时间暴露于高湿度环境中，导致其吸湿饱和，从而降低了持液能力。可通过缩短镊子装载到载网浸入之间的时间间隔，或在浸入前降低系统内的湿度水平，来减轻腔室湿度对载网的饱和效应。但需要注意的是，后者会增加装载蛋白样品的枪头堵塞的风险。为降低该风险，可将枪头保留在维持高湿度的保护罩内，从而延长装载新载网的镊子的操作时间。最后需要指出的是，缩短浸入时间（通过提高载网加速度和/或最大速度实现）可在不改变载网润湿特性的前提下获得更薄的冰层。然而，由于两种样品的混合时间也会随之缩短，因此浸入时间通常不作为调节润湿过慢的主要参数。对于润湿过快导致载网孔中冰层过薄或缺失的情况，可采取与上述措施相反的方法予以解决。
与用于亚秒级时间分辨研究的其他技术相比，Spotiton 具有一些优势和局限性。由于混合样品条带中每个分配器仅含有 2–4 nL 液体，因此每种样品仅需 3 µL 的单次分装量即可制备大量载网——当样品量有限时，这一优势尤为突出。此外，通过集成摄像头观察样品沉积过程（尽管该功能并非 Spotiton 独有17），但其他混合装置通常不具备此功能，这使得浸入式载网可进行初步的合格/不合格评估，从而显著缩短筛选时间。该系统的一个主要局限是最低混合时间为 90 ms，受限于机械部件的物理限制，导致无法研究更快的生物反应过程。相比之下，现有的微流控系统通常可实现低于 10 ms 的时间分辨率。在基于 Spotiton 的商业化变色龙（chameleon）系统中，通过设计和结构改进，已将最低浸入时间缩短至 54 ms，并且未来若增加第二个分配器，可能实现比当前 Spotiton 更快的混合时间。
迄今为止，已利用 Spotiton 开展了一系列实验，用于研究早期且短暂存在的分子状态，包括 70S 核糖体的组装、钙离子触发的跨膜离子通道构象变化，以及动力蛋白在 GTP 水解作用下的收缩过程15。自这些研究成果发表以来，该系统已进行了多项改进，以提高 Spotiton 网格制备过程的通量、可重复性及数据报告能力。这些改进包括双区域自动湿度监测与控制系统、实验查看功能、并排喷头检测功能，以及用户界面的若干项小幅升级。升级后的系统将更有效地支持未来类似于此前报道的双样品混合实验，以及小分子药物与其靶标蛋白之间的快速结合分析，甚至抗体-抗原复合物形成的实验。尽管目前及未来涉及两个相互作用组分的时间分辨实验仍将持续进行，但增加第三个压电分配器及相关硬件可进一步拓展可能开展的实验范围。例如，可先沉积去垢剂，再沉积目标蛋白，最后加入相互作用或激活配体，从而消除蛋白长时间暴露于去垢剂可能带来的不利影响——这种去垢剂处理通常对于防止常见的成像缺陷（如优势取向）是必要的。鉴于已有发表的研究成果及潜在的未来应用，Spotiton 已成为冷冻电镜领域的重要工具，有助于推动亚秒级时间分辨研究的开展。

多个研究团队已实现利用冷冻电镜（cryo-EM）在亚秒时间尺度上捕获并揭示蛋白质瞬时构象状态的潜力（即时间分辨冷冻电镜），该领域的工作始于Berriman和Unwin1，其技术建立在Dubochet为制备冷冻电镜载网而开发的标准 plunge freezing 方法基础之上2。他们在冷冻剂杯上方增加了一个雾化器，利用压缩氮气将第二种样品喷成细雾，使其与已施加并用滤纸吸至形成薄水层的第一种样品的EM载网进行混合。尽管该系统可实现低至1毫秒的混合时间，但仍需用户手动对第一种样品进行滤纸吸液——这是一项技术上具有挑战性的操作——并且需要相对大量的第二种样品。此外，在实际操作中难以确定两种样品混合的具体位置，因此需要在混合样品中使用铁蛋白纳米颗粒作为定位标记物。随后，Howard White及其同事通过引入计算机控制滤纸吸液和喷雾步骤，提高了该喷雾混合方法的控制性和可重复性3,4。为解决样品混合程度及混合位置的问题，同一研究团队5及其他研究者6,7,8,9,10转而采用混合-喷雾方法11，即在注射泵压力作用下的狭窄毛细管中，或在由氮气驱动的微加工微流控芯片中预先混合两种样品。这些预混合系统不仅确保了样品的充分混合，还可精确调节混合时间，从而提高时间分辨研究的分辨率。
在Spotiton系统中引入压电分配器作为将样品施加到电镜载网的替代方法，不仅实现了对样品沉积位置的精确定位，还显著减少了制备载网所需的样品体积12。随后，纳米线载网的使用以及“飞行中”样品施加（&#34;on-the-fly&#34; spotting）技术消除了 blotting 步骤的需求，并缩短了从样品施加到玻璃化冷冻的时间13,14。对于本文所描述的新型时间分辨冷冻电镜方法，Spotiton系统新增了第二个分配器，并对相应的控制硬件和软件进行了升级，从而能够在第一个样品沉积后几乎立即向移动的纳米线载网上施加第二个样品15。当两个重叠的样品被纳米线迅速吸入形成一层薄水层并进入玻璃化前时，它们在载网上混合。混合时间可短至90 ms。本实验方案旨在提供利用压电分配技术和纳米线载网开展时间分辨实验的实用操作信息。此外，随着硬件和软件不断改进以提升易用性、一致性和通量，本方案也对先前报道的方法15进行了更新和详细说明。

<table><tbody><tr><td>缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜载网储存盒</td><td>EMS（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh 300 目 EM 载网</td><td>EMS（Hatfield，宾夕法尼亚州；美国）</td><td>EMS300-Cu-Rh</td><td>经处理以纳米线包被，方法如前所述（Wei et al, 2018）</td></tr><tr><td>乙烷气体</td><td>TW Smith 公司（美国纽约州布鲁克林）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>网格镊</td><td>EMS（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）</td><td>78320-5B</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Airgas, Inc.（美国宾夕法尼亚州拉德诺）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>液氮储存罐配黄铜乙烷杯（来自 FEI Vitrobot）</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>皮系统</td><td>Hydro System and Supplies（达勒姆，北卡罗来纳州；美国）</td><td>N/A</td><td>水纯化系统</td></tr><tr><td>蛋白质/其他样品</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solarus 950 等离子清洗仪</td><td>Gatan, Inc.（普莱森顿，加利福尼亚州；美国）</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

使用新型机器人系统spotiton进行时间分辨研究的冷冻电子显微镜载网制备

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

通过两个或多个相互作用的粒子在初始相遇时触发捕获短寿命分子状态，一直是冷冻电子显微镜（cryo-EM）领域备受关注的实验挑战。目前已开发出若干方法学策略以支持此类&#34;时间分辨&#34;研究，其中一种名为Spotiton的新型机器人系统，能够以精确的时间和空间控制，分配皮升级别的样品液滴。时间分辨的Spotiton工作流程提供了一种独特高效的手段，可利用极少量样品探究早期结构重排。该系统通过独立控制的压电分配器发射两种样品，使其在纳米线电镜载网上快速混合，随后载网迅速浸入冷冻剂中。仅需数微升样品，即可在短时间内连续制备潜在数百个载网。本文提供Spotiton系统操作的详细分步方案，并重点讨论载网制备过程中可能出现的具体问题及其解决方案。

图4 展示了在单次时间分辨的 Spotiton 实验中，RNA 聚合酶与一段携带启动子序列的 105 bp DNA 寡核苷酸混合 150 ms 后进行玻璃化冷冻所制备的载网图像15。图中显示的是在样品施加后的两个时间点，由两台高速相机拍摄的六张载网图像。这些相机在浸入式冷冻设备中独具特色，可让用户立即根据纳米线吸液程度以及液体样品是否被吸入适合电镜成像的足够薄的水层，来判断是否保留或弃用某张载网。尽管单张载网即可提供完整数据集所需的冰层，但在达到最佳条件后，通常会制备多张载网以备不时之需，以防其中一张或多张丢失或污染。在本次实验制备的六张载网中，图像显示仅有一张存在吸液不理想的情况（图4F）。
图中所示的载网是在1小时的准备时间后，连续用时40分钟完成制备的（步骤2.5.1至2.5.8），以按照方案中的描述准备好样品和仪器（步骤1.1.1至2.4.6）。在六个载网中，有两个用于数据采集，其余则保存以备后续分析之需。玻璃态冰在载网上的分布模式（图5C）与上部相机图像中观察到的液滴沉积模式高度一致（图5B）。混合样品的有效吸除效果可通过下部相机图像中无明显液带体现（图5A），该过程主要沿覆盖有纳米线的载网条带进行，样品极少溢入其初始落点以外的相邻方格。在充满冰的方格内，冰层通常在方格中心区域的孔洞中最厚，而靠近载网条带的孔洞中冰层逐渐变薄（图5E）。由于紧邻纳米线，靠近载网条带的孔洞常常为空（图5F）。
<img alt="用于监测站、机柜和压力气瓶的气体吸附光谱装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：时间分辨的Spotiton系统。 1. 操作员工作站；2. 环境控制舱；3. 氮气供应；4. 乙烷供应；5. 上部浸入路径相机的背光控制；6. 压电分配控制器；7. 注射泵；8. 真空泵；9. 清洗水供应及废液瓶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于冷冻电镜样品制备的 Spotiton 装置示意图；使用微流控装置形成液滴。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：Spotiton 软件用户界面。（A）桌面图标和启动画面。（B）主界面由六个区域组成：1. 上部浸入路径（“上部”）和针尖检测摄像头的显示区域；2. 下部浸入路径（“下部”）摄像头的显示区域；3. 针尖检测视频的回放区域；4. 多功能选项卡区域；5. 实时湿度监测器；6. 实时系统日志文件。缩写：UI = 用户界面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光谱系统静态平衡实验装置；光激发分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：Spotiton腔室内部视图（机器人位于安全位置）。1. 网格机器人（红色）；2. 分液机器人（黄色）；3. 上部浸入路径相机（粉红色）；4. 下部浸入路径相机（浅蓝色）；5. 吸头检测相机（橙色）；6. 湿度屏蔽罩（绿色）；7. 样品托盘；8. 雾化器组件（深蓝色）；9. 系统储液罐及水管线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="透射电子显微镜网格图像，展示表面晶格图案分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：Spotiton 网格制备过程中时间分辨的系统相机图像。（A-F） 使用 Spotiton 点样 RNA 聚合酶和启动子 DNA 序列的六个网格的上部（左）和下部（右）浸入路径相机图像。比例尺 = 500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜载网制备；蛋白质载网图像；结构生物学；载网表征分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5Spotiton 制备载网上冰沉积的模式 （的若干部分A）下部和（B）上方相机图像和（C所示网格的图谱 图4F样品沉积与混合后形成的冰的大致位置以淡紫色标示。黄色箭头所标记方框内的区域被成像于 (E-G）。所示区域为 (E) 用黄色标出的框内D）。代表性方格（E），孔（F），以及（G) 从所示网格中采集的曝光图像A-D）方框区域在方形和孔洞图像中分别对应于孔洞图像和曝光图像。比例尺 = 100 µm (A-D), 5 µm (E), 2 µm (F），100 nm（G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
图 S1：尖端放电的检测。 在用户界面左侧的上部摄像头监视器中可观察到尖端 2 的实时放电情况，而右侧视频回放区域则循环播放先前记录的尖端 1 放电视频，用于对比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S1.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
图S2：分配头尖端的超声清洗。 尖端中的气泡会干扰液滴形成，并阻止尖端喷射。（A）尖端内的气泡。（B）将尖端浸入超声清洗站的水中，以去除气泡或清除堵塞尖端孔口的干燥蛋白质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S2.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
图S3：镊子中加载载网。 （A）将载网有纳米线的一面朝上放置在载网盒边缘。（B）将载网正确放入自闭合镊子中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S3.jpg" target="_blank">请点击此处下载本文件。</a>
图S4：湿度追踪图。 在一次典型的载网制备过程中，记录到的腔室（深蓝色）和外罩（浅蓝色）内的相对湿度百分比。图中同时标出了载网浸入液氮的时间点（绿色方块）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S4.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
图S5：浸入过程中纳米线网格上的毛细渗透。 纳米线网格在浸入过程中毛细渗透过慢（A, B）、理想（C, D）和过快（E, F）的典型上部（A, C, E）和下部（B, D, F）路径相机图像。轻微增厚区域（白色箭头）表示已被样品浸润的带纳米线的网格条。这些区域内的方格通常含有适合电子显微成像的适当厚度的冰。比例尺 = 500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S5.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文所述方案介绍了一种新型机器人系统Spotiton的使用方法，该系统可将两种待测样品递送至自吸液纳米线网格上，在液态冷冻剂中玻璃化之前，样品混合时间不少于90毫秒。

使用新型机器人系统Spotiton进行时间分辨研究的冷冻电子显微镜载网制备

由两个或多个相互作用粒子早期相遇所触发的短寿命分子态的捕获，仍是实验上的一大挑战。

利用 Spotiton 机器人系统，可在电子显微镜载网上以快至 90 毫秒的速度将目标蛋白与其相互作用伙伴混合并玻璃化。该方案能够捕获那些因存在时间过短而无法通过标准载网制备技术捕捉的蛋白质中间构象。时间分辨的 Spotiton 技术可用于研究亚秒级的生物学或生物化学过程，例如膜通道的激活、DNA 或 RNA 的合成，以及药物或抗体与其靶蛋白的早期相互作用。用户必须同时管理多个直接影响载网质量的组件。在使用前需充分了解系统，并在制备载网时保持耐心。首先，打开氮气供应罐的主阀门，并确保系统储液罐中已充满脱气的超纯水。打开计算机和多插座电源板上的 Spotiton 系统。单击桌面图标以启动 Spotiton 软件的用户界面。在“工具”菜单中，选择“初始化平台”以初始化并归位三轴机器人及旋转分配头组件，在初始化和归位前需确保分配头的尖端朝下。在主菜单中，单击“转至安全位置”以将机器人移至安全位置。在“吸液”选项卡中，选择“预冲洗”以用储液槽中的水多次冲洗分配头。持续操作，直至观察到从吸头末端流出两股连续不断的水流。在“检查”选项卡中，将探针一移至检查摄像头下方，进行水液滴喷射测试，并调节振幅直至产生离散的液滴。按下上方摄像头监视器中的“录制”按钮，记录探针一喷射过程的视频。将探针二移至检查摄像头下方。在右侧显示器中回放第一个喷嘴喷射的视频，同时在上方摄像头显示器中触发第二个喷嘴，使两个分配器的液滴生成模式相匹配。使用提供的内六角扳手，从网格机器人支架上取下镊子。在附近的实验台面上，将一块测试网格的纳米线面向上放置在网格块的边缘处。小心抓住载网边缘，将其正确放置在镊子中，然后重新安装镊子。在 Cryo 选项卡中，点击“Tip to Camera”以将尖端一移至上方浸入路径相机的视野中，并确保上方相机监视器中已选择“Live”模式。打开并调节上方摄像头的光源。通过在显示器内单击鼠标，将尖端一调整至上方摄像头视野中可见的位置。单击“Grid to Camera”以将网格置于上方摄像头前方，然后根据需要再次调整尖端一的位置。在“Cryo”选项卡中，确保未选中“Vitrified Grid”，然后依次点击“Queue Target”和“Plunge”。通过评估上方和下方的图像，确认分配器工作正常。使用适当的缓冲液将两个样品稀释至所需浓度，理想情况下对两者使用相同的缓冲液，并用液氮填充冷冻剂杯。使用5瓦的氢气和氧气，以1.5分钟为起始点，对三到四个纳米线网格进行等离子清洗。插入雾化器，并观察蒸汽从雾化器帽的中心孔排出。在主窗口中观察实时湿度监测器，或在“报告”和“环境”下打开环境湿度追踪器。检查腔室和防护区的湿度水平。将每个样本的五微升加入样本杯中。将样本杯装入承载托盘，左侧为用于探针一的样本，右侧为用于探针二的样本。然后将托盘推回仪器内直至到位。在“吸液”选项卡中，设置每个吸头的吸液体积为三微升。确保样本托盘已牢固放置，点击“吸液”，观察移液装置将分配头移入样本杯中。通过取下样本杯并观察液面下降，确认两个样本均成功吸取。在“检查”选项卡中，将每个吸头送至检测摄像头，以确认吸头无堵塞且能够正常排液。根据需要调整振幅，使每个吸头的液滴形成情况保持一致。将一块新近经等离子清洗的载网装入镊子中，但暂不安装镊子。确保湿度水平升高至约 90% 至 95%。填充乙烷杯，并在检查相机前方对两个喷射尖端进行最后一次试喷，确认无任何堵塞。在“Cryo”选项卡中，单击“Tip to Camera”。检查乙烷杯。若已形成乙烷冰，可根据需要使用额外的乙烷气体将其融化。将载有载网的镊子安装到载网台上。在“Cryo”选项卡中，单击“Grid to Camera”，确保尖端一在上方相机监视器中位置正确。然后依次单击“Vitrified Grid”、“Queue Target”和“Plunge”。当系统提示时，单击“OK”，以命令网格机器人将网格从乙烷转移至液氮中，并释放到浸没的支架上。检查载网图像，以确定是否应保留或弃用。若需保留载网，请预冷尖头镊子，轻轻夹住载网边缘，将其放入载网盒的槽位中，从缺口左侧的第一个槽位开始，按顺时针方向依次放置。通过选择“报告”和“实验”，使用实验查看器回顾和比较上、下摄像头拍摄的载网图像，以及在 plunge 时的仪器设置和湿度测量数据。此处展示了在单次时间分辨 Spotiton 实验中，将 RNA 聚合酶与一段含有启动子序列的 105 碱基对 DNA 寡核苷酸混合 150 毫秒后迅速玻璃化冷冻所制备的网格图像。在六个网格中，仅有一个显示出欠佳的吸滤效果。玻璃化网格上的冰沉积模式与上部相机图像中观察到的液滴沉积模式高度一致。混合样品在覆盖纳米线的网格条上能有效爬升，样品很少溢出到其所在方格相邻的方格中。在充满冰的方格中，冰的厚度通常在方格中心区域的孔洞中最厚，而靠近网格条的孔洞中则逐渐变薄。由于紧邻纳米线，紧靠网格条的孔洞通常为空。 正确制备和处理纳米线载网将确保在混合样品载网上形成良好的冰层厚度。Spotiton 系统还允许用户将两种样品分别沉积在同一载网上，从而在同一次载网维护过程中采集未混合的对照样品。Spotiton 已助力实现了对细菌基因表达过程中首批中间态的实时捕获。由于它们在亚秒级时间尺度上形成，其结构至今一直未知。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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