Name: 多参数灌注对照分离原代大鼠肝细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习使用改进的两步胶原酶灌注法分离原代大鼠肝细胞，该方法采用紧凑型集成灌注系统，通过多参数实时监控和温度控制，确保高细胞存活率（88%-94.8%）和产量（高达5×10⁸个细胞），适用于肝脏疾病研究和体外毒理学测试。

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本工作部分得到以下资助：新加坡教育部学术研究基金（MOE ARC，项目号 MOE2017-T2-1-149）；新加坡国立大学卫生系统创新种子基金 2017（NUHS Innovation Seed Grant 2017，项目号 NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02）；新加坡机械生物学研究所（R-714-106-004-135）；以及新加坡科技研究局（A*STAR）生物医学研究理事会下属生物工程与纳米技术研究所的资助（项目编号：IAF-PP H18/01/a0/014、IAF-PP H18/01/a0/K14 和 MedCaP-LOA-18-02），资助对象为 Hanry Yu。Ng Chan Way 为新加坡国立大学研究学者。谨此感谢共聚焦显微镜单元 &amp;感谢新加坡国立大学流式细胞术单元在肝细胞纯度分析方面提供的帮助与建议。

所有实验操作及动物饲养均按照新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的要求，在协议编号 R15-0027 和 R19-0669 下进行。
1. 溶液和手术器械的准备
<ol>
	<li>使用超纯水配制 表1 中的缓冲液和细胞培养基。</li>
	<li>使用前将无钙缓冲液和胶原酶缓冲液在水浴中预热至 37 °C。</li>
	<li>对以下手术器械和实验设备进行高压灭菌：一对尖钝型手术剪、一对钝-钝型手术剪、一对弯型手术剪、两对齿状组织镊、两对弯型镊子、两个血管夹、一段长 5 cm 的 3-0 丝线手术缝合线、一个 100 µm 尼龙网筛、一个 400 mL 烧杯以及一个载物台（漂浮式微量离心管架）。</li>
</ol>
2. 设置诱导多能干细胞（iPS）体系（见图1）
<ol>
	<li>用70%乙醇擦拭超净工作台表面。用70%乙醇擦拭IPS，并将其移入超净工作台内。进行紫外灭菌处理，持续时间 &gt;开启通风橱前15分钟。 
	警告：暴露于紫外光下可能导致眼睛疼痛和皮肤灼伤。开启紫外灯时，务必确保通风橱的挡板完全关闭。</li>
	<li>将一套新的一次性管路组装到IPS上。将蠕动泵下游的管路用硅胶加热套包裹。在硅胶加热套下游的管路上安装灌注监测仪。</li>
	<li>确保将两根管路入口的滚轴夹完全松开。将每根管路入口连接至一支无菌2 mL吸液巴斯德吸管的锥形末端。将两支吸液巴斯德吸管（入口）和静脉导管（出口）均置于盛有无钙缓冲液的1 L瓶中，以便在后续引液步骤中实现缓冲液的循环流动。</li>
</ol>
<img alt="灌注系统示意图，包含泵、温度、压力、气泡传感器；校准、测试步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62289/62289fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：自检界面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62289/62289fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>开启 IPS。在触摸屏控制面板上执行以下操作。每次启动时，软件将自动执行全面自检。 
	警告：IPS 为连接外部电源的电气设备。液体溅到 IPS 或电源线缆上可能引发电击危险。
	<ol>
		<li>确保屏幕上显示自检状态（图 2）。通过自检的组件将以绿色显示；未通过的将以红色显示。完成故障排除后，点击 测试 图标重新执行自检，或点击 进入系统 图标直接进入操作界面。</li>
		<li>点击屏幕任意位置，登录操作界面。</li>
		<li>在操作界面的左上角（图 3），点击任意一个圆形箭头图标以设置蠕动泵的旋转方向。在界面右侧面板，点击上下箭头图标设置相应参数值。将流速设为恒流模式；加热夹套温度设为 42 °C（需调节以确保灌注液温度维持在 37 °C）；泵转速设为 38 rpm，以实现约 33 mL/min 的流速。</li>
		<li>在操作界面的右下面板，检查气泡报警、灌注停止报警及静音图标的当前状态。</li>
		<li>在左侧面板检查灌注液的温度、压力和流速。通过点击各列上下两端的上下箭头，手动设置报警区间。查看各列中部显示的实时数据数值。当实时数据超出设定范围时，对应列的颜色将由绿色变为红色。</li>
		<li>在中间面板查找用于启动、暂停和停止灌注的图标，以及用于在实时数据显示与图表模式之间切换的图标。点击启动图标开始灌注，并用无钙缓冲液预冲管路。系统将创建一个新的日志文件。在弹出窗口中输入文件名和用户名（图 4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="器官灌注系统示意图；温度、压力、流量控制；监测异常信号。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62289/62289fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：操作界面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62289/62289fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示温度、压力和流量监测数据的器官灌注系统界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62289/62289fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：提示输入文件名和用户名的弹出窗口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62289/62289fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>将滴液室填充至一半满。在预充液过程中，确保管路中无残留气泡。</li>
	<li>若气泡过滤器下游管路中出现气泡，可通过轻弹管壁使气泡脱离并随液体冲出。 
	注意：缓冲液经加热套加热时，管路中可能产生气泡。</li>
	<li>取一个 400 mL 烧杯，加入 200 mL 胶原酶缓冲液。将孵育台置于烧杯上方。在不引入空气的前提下，完全夹紧其中一根管路入口的滚压夹，并将该入口的吸液管移入烧杯中。</li>
</ol>
3. 动物实验操作
<ol>
	<li>准备一只体重约200–300 g的年轻成年雄性Wistar大鼠。 
	注意：本实验方案已针对体重约为200–300 g的大鼠进行优化。建议使用雄性大鼠，因为雌性大鼠动情周期中的激素变化会影响肝细胞功能。</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>用1 mL注射器（配27 G针头）分别吸取所需体积的抗凝剂肝素（5,000 IU/mL；0.2 mL/100 g体重）和大鼠麻醉剂氯胺酮/赛拉嗪混合液（37.5 mg/mL氯胺酮，5 mg/mL赛拉嗪；0.2 mL/100 g体重）。 
		警告：麻醉剂和肝素为有害物质。操作锐器时需小心谨慎。</li>
		<li>固定大鼠。在腹部右下象限腹腔注射肝素，随后注射氯胺酮/赛拉嗪混合物。 
		注意：盲肠更可能位于左侧。注射时应避免刺穿盲肠，以降低污染风险。</li>
		<li>10分钟后，通过检测大鼠双侧足部的足底反射来评估麻醉深度。需不时持续检查，直至大鼠对足趾夹捏不再产生反应。必要时可追加麻醉剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大鼠仰卧置于托盘上方覆盖铝箔的聚苯乙烯平台上，四肢伸展。用胶带固定大鼠足部，并用27 G针头将胶带牢固地固定在平台上。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒并浸润胸部和腹部进行消毒。消毒前剃毛为可选步骤。将大鼠放入生物安全柜中。在毛发仍湿润时继续下一步操作。 
	注意：用70%乙醇冲洗也能将皮屑和毛发粉尘降至最低。</li>
	<li>将皮肤与肌肉分离。
	<ol>
		<li>一手持齿镊，提起腹部基部附近的皮肤。另一手持尖-钝手术剪，在另一手中提起的皮肤帐篷处进行剪切。将剪刀的尖端推入皮肤下方，从后肢稍上方至前肢稍下方沿中线剪开皮肤。</li>
		<li>用镊子轻轻提起并拉伸皮肤的同时，剪断胸部和腹部皮肤与肌肉之间连接的结缔组织。为降低污染风险，应防止松散的毛发掉落至肌肉表面。若剪刀上积聚毛发，可用其在皮肤已消毒的外侧擦拭以清除。</li>
		<li>在大鼠后腿稍上方和前腿稍下方，从身体中线向两侧做横向皮肤切口。将皮肤瓣向两侧推开，以暴露肌肉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切开腹肌以暴露器官。
	<ol>
		<li>一手持一把新的齿状组织镊，提起腹部基部附近的肌肉。另一手持钝头-钝头手术剪，小心剪开肌肉，注意不要损伤任何器官。从后肢稍上方沿中线剪至胸骨处。</li>
		<li>在大鼠后肢稍上方及肋骨下方，从正中线向两侧的肌肉做横向切口，注意不要损伤任何器官。将肌肉瓣向两侧推开，以暴露器官。确保皮肤和肌肉的横向切口延伸至大鼠体侧，以便在后续步骤中使腹腔内的血液和缓冲液能够流出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>门静脉插管
	<ol>
		<li>用弯钳背面轻柔地将肠管推向右侧。轻柔地翻起肝叶以暴露门静脉。</li>
		<li>使用3-0丝线外科缝合线，在靠近肝脏处的门静脉上打一个非常松的结扎环，位置位于门静脉即将分出左右肝叶分支之前。切勿收紧结扎线，以免影响门静脉内的血流。在胆管下方有一层极薄的膜，需先用弯头镊子的尖端将其刺破，以便缝线能够穿过下方并环绕门静脉（及胆管）。</li>
		<li>使用两把弯头镊子的尖端，在门静脉下方的组织上小心穿刺一个小孔，注意不要损伤门静脉。操作位置位于第一结扎点上游约2-3 cm处，即胃静脉分支从门静脉分出之前的位置。该特定部位的组织较薄。</li>
		<li>用镊子小心地将孔扩大。此孔可在插管过程中使镊子能够支撑门静脉。</li>
		<li>将泵速降低至4 rpm，以获得约3 mL/min的流速。确保静脉导管中无钙缓冲液的流出减缓至缓慢滴注状态。 
		注意：肝脏内压力积聚会导致肝细胞死亡。在后续步骤中，当导管成功插入门静脉后，较低的流速有助于减缓肝脏内压力的积聚。</li>
		<li>用镊子轻轻托起门静脉。另一只手握住静脉留置针，使针头斜面朝上。将针头以10-20° 角度进针并缓慢推进，直至整个斜面完全进入静脉。一旦针头正确插入门静脉，肝脏将开始变白，失去其深红色。 
		注意：必须将针头的整个斜面插入静脉，以形成足够大的孔以便插入导管。但切勿插入过深，以免穿透静脉对侧壁。</li>
		<li>将套管顺着针头推进静脉。然后将针头回撤至比套管末端后退2-3 mm处，确保针尖完全安全地缩入套管内。用拇指和中指固定导管，以食指向下压翼片以回撤针头。</li>
		<li>用静脉夹迅速将门静脉固定在导管上。切勿将夹子直接夹在针头的侧孔处，以免干扰灌注液的流动；应夹在侧孔下方。</li>
		<li>立即切断肝下腔静脉（IVC）以防止肝脏内压力积聚。此时，肝下腔静脉及其邻近血管将被来自门静脉的血液所遮蔽。为确认腔静脉已正确切断，可观察是否有脉冲状喷血；邻近血管仅会缓慢渗血。 
		注意：插管后若花费过长时间切割肝下腔静脉，或未在进入下一步前完成切割，将导致肝细胞死亡。此步骤中，动物在麻醉状态下通过腔静脉切割放血实施安乐死。应在持续失血的情况下继续操作流程。后续步骤中打开胸腔时，可通过肉眼观察心跳和呼吸是否停止来确认动物死亡。</li>
		<li>将泵速增加至 38 rpm，以达到约 33 mL/min 的流速。用镊子夹闭下腔静脉 2–3 秒（但时间不宜过长），然后重新打开，重复此操作冲洗肝脏三次。 
		注意：灌注过程中，肝脏会轻微膨胀，随后恢复至正常状态。灌注有助于灌流液充分渗透整个肝脏。灌注完成后，肝脏应整体呈浅棕色。</li>
		<li>确保将套管尖端置于门静脉分支进入各肝叶之前的部位，以保证所有肝叶的灌注。必要时可松开门静脉夹，调整套管位置，随后重新夹闭。</li>
		<li>在分支点稍上游处收紧门静脉周围松散的结扎线。在软导管被硬金属针支撑的位置、斜面与侧孔之间打三个结。确保结扎固定导管位置，将其牢固连接至门静脉，并防止缓冲液回流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完整切除整个肝脏。
	<ol>
		<li>以约 33 mL/min 的流速用无钙缓冲液灌注肝脏，持续 12 分钟（参见 图 5A）。与此同时，进行肝切除。如有必要可延长灌注时间，但需确保钙离子-free缓冲液不耗尽。</li>
		<li>使用一对弯剪，小心剪开连接门静脉与肠道的肠系膜，将门静脉从肠道分离。操作时避免划伤胃肠道（食管、胃、小肠和大肠），以确保无污染发生。 
		注意：这是为了防止在切除过程中移动肝脏时门静脉撕裂。</li>
		<li>通过剪断连接肝脏与胃肠道的结缔组织、胰腺和肠系膜，将肝脏从胃肠道分离。分离时应始终使用剪刀进行剪切，不得牵拉撕裂。再次强调，避免划伤或剪破胃肠道。</li>
		<li>轻轻翻转肝脏以暴露膈肌。沿肋骨壁剪开膈肌，确保大部分膈肌仍与肝脏相连。注意避免刺破或损伤肝脏。</li>
		<li>打开胸腔后，可见两条管道：左侧为浅白色膈下肝后腔静脉（IVC），右侧为黄白色食管。在膈下肝后腔静脉上方施加夹子，并在夹子上方剪断。夹闭膈下肝后腔静脉为可选步骤，其作用是防止胸腔内灌注。 
		注意：通过肉眼观察心脏跳动和呼吸是否停止，以确认动物死亡。</li>
		<li>食管被膈肌所包围。为将食管与膈肌分离，从右侧向食管方向剪开膈肌。剪断食管和胃与肝脏及膈肌之间残留的任何结缔组织。</li>
		<li>将胃肠道向右侧推开。将静脉夹从肝上腔静脉转移至肝下腔静脉；此时灌注液将从肝上腔静脉流出。 
		注意：灌注过程中，导管和肝下腔静脉将被肝脏覆盖。来自肝上腔静脉的强烈缓冲液流出有助于外科医生排除灌注泄漏。</li>
		<li>剪断肝脏与胸腔之间残留的膈肌组织。剪除肝脏与腹腔相连的结缔组织。注意不要剪到夹子上方的肝下腔静脉，以免将夹子从肝脏上脱落。</li>
		<li>为确保肝脏完全切除，用镊子夹住膈肌并小心抬起肝脏。若肝脏与腹腔之间仍有残留组织相连，应将其切断。若肾脏和脾脏仍与肝脏相连，则需将其分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肝脏灌注与消化
<ol>
	<li>如果切除完成较早，需等待肝脏用无钙缓冲液灌注满 12 分钟。</li>
	<li>将灌注缓冲液更换为胶原酶缓冲液。在完全关闭无钙缓冲液的滚压夹之前，先完全松开胶原酶缓冲液的滚压夹（见图 5B）。当胶原酶缓冲液通过管路到达肝脏后，通过关闭肝上腔静脉 2–3 秒再重新打开的方式，冲洗肝脏三次。</li>
	<li>小心将肝脏移至烧杯上方的灌流平台上，以便胶原酶缓冲液循环。操作时用镊子夹住膈肌并同时支撑导管来移动肝脏。避免牵拉导管，以防导管意外脱落。 
	注意：若导管脱落且门静脉损伤严重无法重新插管，可改为插管肝上腔静脉，使缓冲液从门静脉流出。确保肝下腔静脉仍处于夹闭状态。</li>
	<li>消化肝脏 12 分钟。观察肝脏表面是否出现半透明斑点或网状结构，此时肝脏开始失去原有的光滑棕褐色外观。随着消化进行，肝脏会逐渐变大、变软。当肝脏变得松软时，停止灌注。如有需要，可适当延长消化时间。 
	​注意：若格利森氏囊（Glisson's capsule）已破裂，烧杯中的胶原酶缓冲液可能因肝细胞逸出而变得浑浊。</li>
</ol>
5. 肝细胞分离
<ol>
	<li>通过剪断门静脉小心取出套管，小心移除夹子，将肝脏转移至含有 60 mL 冷的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）的 150 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用弯头镊子的背面轻轻敲击肝脏，以破坏并剥离格利森囊。然后在 DMEM 中轻轻左右摇动肝脏，以释放肝细胞。持续操作，直至肝细胞完全解离进入 DMEM 中。 
	​注意：有时整个肝脏或某些肝叶仅部分消化。避免刮擦肝脏，以免强行移除并损伤未解离的肝细胞，这样可以获得更高且更稳定的细胞活力。</li>
	<li>轻轻晃动 150 mm 培养皿，使肝细胞在 DMEM 中均匀分布。为去除组织碎片和细胞团块，将细胞悬液倒入置于新 150 mm 培养皿上的 100 μm 孔径尼龙网筛中。用 30 mL DMEM 冲洗原培养皿，并将冲洗液转移至网筛。轻轻敲击网筛，使滞留的单个肝细胞通过筛孔。</li>
	<li>移除网筛，轻轻晃动新的 150 mm 培养皿，使肝细胞均匀分布。将细胞悬液等量分装至 4 个 50 mL 离心管中。用 30 mL DMEM 冲洗培养皿，并将冲洗液等量分装至上述离心管中。确保每管含有等体积的细胞悬液。</li>
	<li>将 4 个 50 mL 离心管中的细胞悬液在 4 °C 条件下以 50 × g 离心 2 分钟。小心吸除上清液，避免扰动松散的细胞沉淀，弃去上清液。每管加入 20 mL DMEM，轻轻晃动以重悬细胞沉淀。将四个管中的细胞悬液合并至两个管中。</li>
	<li>将 2 个 50 mL 离心管在 4 °C 条件下以 20 × g 离心 2 分钟。吸除并弃去上清液。每管加入 20 mL DMEM，轻轻晃动以重悬细胞沉淀。将两个管中的细胞悬液合并为一管。将细胞置于冰上保存，直至使用。</li>
	<li>通过将 400 μL 1× PBS 与 50 μL 台盼蓝混合配制台盼蓝溶液。取 50 μL 肝细胞悬液加入台盼蓝溶液中。在光学显微镜下使用血细胞计数板计数活细胞与死细胞的数量。</li>
</ol>
6. 肝细胞培养
<ol>
	<li>所有细胞培养步骤均在超净台中进行。向35 mm培养皿中加入1 mL胶原蛋白包被液，孵育4小时。用1×PBS洗涤培养皿三次。</li>
	<li>将肝细胞悬液用肝细胞培养基稀释至浓度为0.8×10⁶个细胞/mL。取1 mL稀释后的肝细胞悬液加入35 mm培养皿中。 
	​注意：肝细胞在移液过程中对剪切力敏感。建议使用宽口移液吸头。</li>
	<li>轻轻晃动培养皿使肝细胞均匀分布。于37 °C、5% CO2条件下孵育3–4小时，使肝细胞贴壁。</li>
	<li>进行三明治培养：
	<ol>
		<li>移除肝细胞培养基。用1 mL肝细胞培养基冲洗一次，以去除未贴壁的细胞。加入1 mL胶原蛋白覆盖液。将胶原蛋白覆盖液沿培养皿壁缓慢加入，避免在溶液中引入气泡。</li>
		<li>于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育，使胶原蛋白凝胶化。</li>
		<li>加入1 mL新鲜肝细胞培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行单层培养：
	<ol>
		<li>完成步骤6.3后，移除肝细胞培养基。用1 mL肝细胞培养基冲洗一次，以去除未贴壁的细胞。</li>
		<li>加入1 mL新鲜肝细胞培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过针对肝细胞特异性标志物的免疫染色及功能检测方法评估肝细胞纯度和功能，具体操作如先前文献所述10,11。</li>
</ol>

<ol><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).</li>
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<li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283(2020).</li>
<li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542(2019).</li>
<li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).</li>
<li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029(2015).</li>
</ol>

周艳和余汉瑞声明存在利益冲突，因为他们持有Vasinfuse公司的股权，该公司生产并销售集成灌注系统。余汉瑞还持有Histoindex、Invitrocue、Osteopore、Pishon Biomedical、Ants Innovate和Synally Futuristech公司的股权，这些公司与本文所报告的信息不存在利益冲突。

对于一般的两步胶原酶灌注操作，有几个要点需要特别注意。首先，在切除肝脏时必须格外小心，确保不损伤胃肠道，以免内容物泄漏导致细菌污染。此外，在动物手术过程中应避免损伤覆盖肝脏表面的格利森囊（Glisson's capsule）。如果撕裂过大，可能导致解离的肝细胞提前释放到胶原酶缓冲液中。其次，不同批次的胶原酶在消化肝脏组织的同时维持良好肝细胞活性的能力可能存在差异，因此每次使用新的胶原酶批次时都必须优化其用量5。建议在批量采购前先测试若干批次胶原酶，并选择效果最佳者。务必确保所用水为超纯水且pH值正确，水中杂质（如亚铁离子和铁离子）以及不正确的pH值可能影响胶原酶活性，从而显著影响所分离细胞的质量。尽管本方案中胶原酶缓冲液的循环使用是可选步骤，但并不推荐，因为所需胶原酶缓冲液的体积将增加至&#62;400 mL。最后，灌注压力和流速应保持在适当范围内：过高的压力和流速会导致肝细胞死亡，而过低的压力和流速则会导致缓冲液无法充分流经较小的血管10。在无钙缓冲液灌注初期，压力会有所上升；但在转入胶原酶缓冲液灌注后，随着胶原酶对组织的消化作用降低了流动...

原代肝细胞是肝脏相关基础研究、疾病治疗及药物测试等应用的重要工具。目前，原代肝细胞分离的金标准方法是两步胶原酶灌注法。1,2,3 由Seglen在20世纪70年代提出4然而，该操作在技术上具有较高难度，初学者外科医生进行时失败率较高。即使灌注被认为成功，肝细胞的活力（通常为60%–95%）和产量（0.5–5 × 108 在不同分离过程中，每200–300 g大鼠的肝细胞产量可能存在差异，这会影响后续实验的质量和规模。除技术操作外，用于分离的灌注装置（无论是商业产品还是自行组装）也是影响因素之一。必须重视灌注装置的组装、优化和维护。本方案的目的是通过对两步胶原酶灌注法的技术操作和灌注装置进行多参数灌注控制，提高原代大鼠肝细胞分离的成功率和实验间稳定性。
从技术角度来看，该操作过程中最困难的步骤是门静脉插管。至于其他步骤，只要遵循良好的操作规范并采取常规预防措施，即可提高分离的稳定性。因此，理解每一步骤的原理至关重要，以便术者能够应对操作过程中可能出现的各种变量。
已有多种关于从大鼠和小鼠中分离肝细胞及肝脏非实质细胞的实验方案发表1,2,5,6,7,8,9。这些方案所使用的灌注装置存在若干缺点，包括灌注管路的重复使用、温度控制困难、需要常规优化灌注参数，和/或使用了不适合门静脉插管的静脉（IV）导管类型。重复使用灌注管路会增加污染风险，尤其是当管路未被彻底清洁和消毒时。若不进行定期更换而持续重复使用管路，还会使灌注系统面临诸如管路或接头漏液、气泡捕集器堵塞以及管路受压变窄等问题，这些均会显著降低灌注液的压力和流速，从而影响肝脏消化效率。某些装置缺乏恒定热源以实现温度控制，预热的缓冲液会随时间逐渐冷却，导致胶原酶活性降低，消化不充分。尽管其他装置采用连接至水循环器的夹套式玻璃冷凝器来加热缓冲液，但这类装置体积庞大且需要仔细清洗。在开始细胞分离前，必须测量并优化从导管流出的缓冲液的温度、压力和流速，以确保稳定的灌注条件。即使经过优化，在分离过程中，由于操作者的操作仍可能导致参数在中途发生变化，从而引起灌注和消化效果不理想。大多数类型的静脉导管不适合用于门静脉插管，因为它们无法在插管过程中实现持续灌注，也不能在插管成功时立即向术者提供反馈。此外，在不使血管变形的情况下，将门静脉牢固固定在柔软的导管上也具有挑战性。
本文中，我们采用标准化的一次性无菌管路、用于精确且稳定温度控制的硅胶加热套、具备数据存储与管理功能的实时监测与报警系统，以及一种特殊的静脉导管，该导管可在插管过程中穿刺门静脉的同时实现持续灌注，从而解决上述问题。据我们所知，我们是首个将上述所有功能整合到一个紧凑型集成灌注系统（IPS）中的研究团队，该系统具有高度便携性，可放入层流罩内，以确保无菌操作。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料/设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Nipro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 针头</td><td>Nipro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色编织丝线，不可吸收、非无菌外科缝合线</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>Bochem 18/10 不锈钢镊子，尖端带弯曲圆头</td><td>Bochem</td><td>10333511</td><td></td></tr><tr><td>一次性灌流装置</td><td>Vasinfuse</td><td>BPF-112</td><td></td></tr><tr><td>漂浮式圆形 1.5 mL 微量离心管架</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3133</td><td></td></tr><tr><td>德国标准组织镊，带齿 / 1&amp;times;2 齿，14.5 cm</td><td>Walentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Cellstar 吸液移液管</td><td>Merck</td><td>GN710183</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>集成灌流系统</td><td>Vasinfuse</td><td>IPS-001</td><td></td></tr><tr><td>弯头虹膜剪，不锈钢，11 cm</td><td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td><td>CVD</td><td></td></tr><tr><td>配备 10X 物镜的光学显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100&amp;micro;M 尼龙网片</td><td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td><td>06630-75</td><td></td></tr><tr><td>手术剪，BL/BL，13 cm</td><td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td><td>STR &amp;ndash; BL/BL</td><td></td></tr><tr><td>手术剪，SH/BL，13 cm</td><td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td><td>STR &amp;ndash; SH/BL</td><td></td></tr><tr><td>反向止血夹</td><td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td><td>XEC230</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9056</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck</td><td>137101</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>TCI</td><td>D1961</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1-9278</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26764.298</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>亚油酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>I 型牛胶原蛋白</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-100ml</td><td></td></tr><tr><td>William&amp;rsquo;s E 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W1878</td><td></td></tr></tbody></table>

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

原代肝细胞被广泛应用于肝脏疾病的基础研究以及体外毒性检测。in vitro 原代肝细胞分离的两步胶原酶灌注法在技术上具有挑战性，尤其是在门静脉插管环节。此外，由于灌注装置的组装、优化或维护存在困难，该过程还容易出现偶然污染以及灌注条件的波动。本文介绍了一种经过改进的、具备多参数灌注控制的两步胶原酶灌注法的详细操作流程。通过在关键步骤采取必要的技术措施，并采用特殊的静脉留置针、标准化的一次性无菌管路、温度控制以及实时监测与报警系统，显著降低了操作难度并减少了灌注参数的变异性，从而实现了大鼠原代肝细胞的高效且稳定的分离。所获得的原代大鼠肝细胞 consistently 具有较高的细胞活力（85%–95%）、得率（每只200–300 g大鼠可获得2–5 × 108 个细胞）以及功能活性（白蛋白、尿素及CYP酶活性）。该方法配套使用了一套集成化灌注系统，结构紧凑，可在超净工作台内完成安装，确保无菌操作。

外科医生可以通过观察某些步骤后的结果来判断肝脏灌注是否顺利进行。第一个结果可在插管、切断肝下腔静脉并恢复灌注流速后观察到。肝脏的颜色应已完全由深红色变为棕色，同时保持其体积不变。如果肝脏看起来略微塌陷，并带有红色色调或出现红色斑块，则表明灌注流速设置不当（过低），或门静脉插管不正确。如果肝脏不仅变为棕色，而且变得肿胀且僵硬，则表明灌注流速设置过高，或肝下腔静脉未被正确切断。如果仅有少数肝叶灌注不良，说明导管插入过深，仅灌注了门静脉的一个分支。第二个结果可在切除并夹闭肝下腔静脉后观察到。若肝上腔静脉的流出速度缓慢且微弱，可能意味着导管在切除过程中脱落，或肝下腔静脉未被妥善夹闭。第三个结果可在消化过程中观察到。在呈棕色的肝脏表面，应出现透明斑点或网状结构，并逐渐扩大。肝脏应失去原有的弹性，变得柔软且呈糊状。我们优化了胶原酶的浓度，以确保在12分钟内达到此状态。当试用新的一批胶原酶时，应延长消化时间，直至达到该状态为止。第四个结果可在肝细胞释放时观察到。当细胞被释放后，培养基应呈现浑浊外观。如果观察到大量颗粒状物质，则可能表明肝脏消化不充分。若消化完全，仅应残留白色网状血管结构。即使消化不完全(<strong class="x...

本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。

原代肝细胞广泛用于肝脏疾病的基础研究以及体外毒性检测。两步胶原酶灌注法……

本大鼠肝细胞分离方案基于消化前肝脏切除的方法。该方案介绍了一种紧凑且便携的一体化灌注系统用于细胞分离。该技术采用胶原酶循环利用，减少了胶原酶的使用量，同时在确保高重力沉降得率和肝细胞特异性功能的前提下，提供了更灵活的消化时间延长空间。将大鼠放入通风橱中。剪开腹肌后，用弯头镊子的背面将肠道向右侧推移。用弯头镊子的尖端刺破胆管下方的膜，以便将缝线环绕门静脉和胆管。使用丝线外科缝合线在门静脉接近肝脏处（即门静脉即将分支进入左右不同肝叶的位置）做一条非常松的结扎线。在第一条结扎线上游约2至3厘米处，即胃静脉即将从门静脉分出的位置，用两把弯头镊子的尖端在门静脉下方的组织上穿出一个小孔。随后将小孔扩大，以便在插管过程中支撑门静脉。通过将泵速降低至每分钟四转，使流速约为每分钟三毫升，以防止肝脏内压力积聚。同时确保静脉导管流出的无钙缓冲液减少至缓慢滴注状态。用镊子轻轻支撑门静脉，同时持住静脉导管，使针头斜面朝上。以10至20度的角度将针插入门静脉，然后缓慢推进，直至整个针尖斜面进入静脉内。正确插入后，肝脏颜色应出现变浅。将套管沿针头推进，同时用食指向后拉动翼片，在拇指和中指固定导管的情况下将针头回撤至套管内。使用血管夹将门静脉固定在导管上，并在门静脉下方再夹闭一处，以避免灌注过程中血流中断。接着，剪断肝下腔静脉以防止肝脏内压力积聚，并观察是否有血液喷涌脉冲，以确认切割位置正确。将泵速增加至38 RPM，以实现约33毫升/分钟的流速。用镊子夹闭肝下腔静脉2至3秒，然后重新打开，重复此操作三次，以冲洗肝脏。为了灌注所有肝叶，需调整导管尖端的位置，并确保其位于门静脉分支进入各个肝叶之前的部位。然后，在门静脉分支点稍上游处收紧门静脉周围的松紧结扎线，并在硬针支撑导管处（斜面与侧孔之间）打三个结，固定导管在门静脉中的位置，以防止缓冲液反流。肝脏切除后，用无钙缓冲液灌注肝脏12分钟。随后，夹紧无钙缓冲液的滚压夹，松开胶原酶缓冲液的滚压夹，更换灌注缓冲液。当胶原酶缓冲液到达肝脏后，关闭肝上腔静脉2到3秒，然后重新打开，重复此操作三次以冲洗肝脏。用镊子夹住膈肌并支撑导管，小心地将肝脏移至烧杯上方的平台上，以便胶原酶缓冲液循环。注意不要牵拉导管，以防意外脱落。消化肝脏12分钟，当肝脏失去光滑的棕褐色外观并变得松软时，停止灌注。如有必要，可延长消化时间。肝脏消化完成后，小心切断门静脉并移除插管，然后将肝脏转移至冷的 DMEM 中以分离肝细胞。使用弯头镊子的背面轻轻敲击肝脏，以破碎并剥离光泽的包膜。通过在DMEM中轻轻摇动肝脏，使肝细胞释放，直至细胞完全分散于培养基中。通过台盼蓝染色计数法测定，肝细胞的活力介于88%至94.8%之间。从体重为200至300克的大鼠中分离得到的肝细胞产量可达每次分离5×10⁸个细胞。图中所示为未纯化的肝细胞悬液和纯化后的肝细胞悬液的代表性图像。通过计数白蛋白阳性荧光染色细胞占细胞核总数的比例，测定分离肝细胞的纯度约为96.8%。在所示的假彩色图像中，绿色代表白蛋白，蓝色表示含有白蛋白的细胞核。不含白蛋白的细胞核以红色突出显示。采用三明治培养的肝细胞形成了清晰的胆小管结构，并具有良好的细胞间接触。如白蛋白、尿素和细胞色素P450检测所示，肝细胞表现出高水平的尿素和白蛋白分泌。在第3天，肝细胞表现出较高的CYP1A2、CYP2B1/2和CYP3A2酶活性。在将针头插入门静脉之前，请做好心理准备。插入后，外科医生需在切断下腔静脉后、泵速提高前持续操作而无脉搏。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

多参数灌注对照分离原代大鼠肝细胞

一种从大鼠肝脏分离门静脉成纤维细胞的技术。肝脏经灌注并消化处理 原位 用胶原酶处理，随后 离体...

大鼠门静脉成纤维细胞的分离 原位 肝脏灌注

原代肝细胞为在生理相关的实验体系中评估生化、分子及代谢功能提供了有价值的工具。本文描述了一种可靠的大鼠原位肝脏灌注方案，该方法可稳定地从每次制备中获得高达 1.0 × 108 个细胞的肝细胞，细胞活力维持在 88 ~ 96%...

大鼠肝细胞的分离与原代培养

本文描述了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离人肝细胞。该方法也可应用于其他哺乳动物肝脏。所获得的肝细胞产量高、活性好，是肝脏再生、药代动力学和毒理学等科学研究领域的理想模型。...

通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。...

小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

原代肝细胞是研究肝脏反应和代谢的有力工具...

一种改进的小鼠原代肝细胞分离的省时高效方案

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。...

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

在此，我们介绍一种可靠的实验方法 原位...

利用灌流小鼠肝脏模型定量测定肝葡萄糖生成、尿素生成及脂解作用

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习使用改进的两步胶原酶灌注法分离原代大鼠肝细胞，该方法采用紧凑型集成灌注系统，通过多参数实时监控和温度控制，确保高细胞存活率（88%-94.8%）和产量（高达5×10⁸个细胞），适用于肝脏疾病研究和体外毒理学测试。

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

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