多参数灌注对照分离原代大鼠肝细胞

这种大鼠肝细胞分离方案是基于消化前的肝切除方法。该协议引入了用于细胞分离的紧凑便携式集成灌注系统。该技术涉及胶原酶再循环，其减少了胶原酶的使用量，并在延长消化时间方面提供了更大的灵活性，同时确保了高重力产量和肝细胞特异性功能。

把老鼠放在引擎盖上。切开腹部肌肉后，用弯曲的镊子的后部将肠道向右推。用弯曲的镊子尖端打破胆管下方的膜，以将缝合线绕在门静脉和胆管周围。

使用丝外科缝合线在靠近肝脏的门静脉周围形成一个非常松散的结扎，就在静脉分支左右进入不同的肝叶之前。在第一个结扎的上游约两到三厘米处，就在胃静脉从门静脉分支之前，用两对弯曲的镊子的尖端穿过门静脉下方的组织形成一个孔。然后在插管期间拉伸孔以支撑门静脉。

通过将泵速降低到四 RPM，以大约每分钟三毫升的流速，防止肝脏中的压力积聚。并确保从静脉导管流出的无钙缓冲液减少到缓慢滴注。在用镊子轻轻支撑门静脉的同时，握住静脉导管，使针的斜面朝上。

并将针以10至20度角插入门静脉。然后缓慢前进，直到整个斜面在静脉内。正确插入应导致肝脏颜色变白。

将套管向前穿过针头，用食指向后拉动翅膀，同时用拇指和中指握住导管，将针头缩回套管后面。在门静脉下方用静脉夹子将门静脉固定在导管上，以避免灌注血流中断。接下来，切开下腔静脉以防止肝脏中的压力积聚，并观察血液喷出的冲动，以确保正确的切割。

将泵速提高到 38 RPM，流量约为每分钟 33 毫升。用镊子关闭下腔静脉两到三秒钟，然后重新打开肝脏，冲洗肝脏三次。为了灌注所有肝叶，调整套管尖端的位置，并确保将其放置在门静脉分支进入不同肝叶之前。

然后，收紧门静脉周围的松弛结扎，略微上游分支点，并固定门静脉中套管的位置，通过在斜面和侧孔之间的硬针支撑套管的点处打三个结来防止缓冲液的回流。肝切除术后，让肝脏用游离钙缓冲液灌注12分钟。然后，拧紧游离钙缓冲液的辊夹，拧松胶原酶缓冲液的辊夹以更换灌注缓冲液。

胶原酶缓冲液到达肝脏后，通过关闭上下腔静脉两到三秒钟并重新打开它来冲洗肝脏三次。小心地将肝脏移动到烧杯顶部的阶段，通过在支撑导管的同时用镊子握住隔膜来再循环胶原酶缓冲液，注意不要拉导管以防止意外脱落。消化肝脏12分钟，当肝脏失去光滑的棕色质地并变得糊状时，停止灌注。

如有必要，请延长消化时间。肝脏消化后切开门静脉，小心地取出套管。然后将肝脏转移到冷的DMEM中以分离肝细胞。

使用弯曲的镊子的背面轻轻敲击肝脏，以打破并剥离闪光胶囊。并通过在DMEM中轻轻摇动肝脏来释放肝细胞，直到细胞在培养基中完全解离。肝细胞的存活率在88%至94.8%之间，由行程和蓝色计数确定。

重达200至300克的大鼠的肝细胞产量高达每次分离10至8个细胞的五倍。代表性的图像显示未纯化的肝细胞悬浮液和纯化的肝细胞悬浮液。分离的肝细胞的纯度约为96.8%，通过计数白蛋白阳性荧光染色细胞相对于细胞核总数来量化。

在以假彩色显示的代表性图像中，绿色代表白蛋白，蓝色表示具有白蛋白的细胞核。没有白蛋白的细胞核呈红色突出显示。三明治培养物中的肝细胞形成明显的胆汁小管，并具有良好的细胞接触。

如白蛋白，尿素和细胞色素P450测定所示，肝细胞表现出高尿素和白蛋白分泌。第3天，肝细胞对CYP1A2、CYP2B1/2和CYP3B2表现出较高的酶活性。在将针头插入门静脉之前，要做好心理准备。

插入后，外科医生将需要在没有脉搏的情况下继续进行，直到切割IVC后泵速增加。