生产人类CRISPR工程的CAR-T细胞
March 15th, 2021
在这里，我们提出了一个协议，在原人类T细胞的基因编辑使用CRISPR卡斯技术来修改CAR-T细胞。
我们的实验室协议使人类基因组编辑与CAR T细胞治疗相结合。实验室程序是与CRISPR-Cas9合作的方法，针对多达三个高效基因。最后，我们的方法能够转化为人体临床试验。
所述方法可应用于其他 CAR 构造和目标基因。这些技术的基础足够牢固，可以转化为更大的规模，并转化为学术和工业合作者，以便进一步发展。首次尝试此协议时，请限制指南 RNA 屏幕上的组数，以便实现准确的孵化时间。
坚持上述培养条件和播种密度已被证明是我们的经验的关键。首先，从健康的志愿者献血者那里获得自体外周血单核细胞（PBMCs），并使用市售的CD4和CD8选择套件分离CD4和CD8阳性T细胞。将CD4正细胞和CD8阳性T细胞以一比一的比例结合，在R10中每毫升孵育300万个细胞，在37摄氏度下每毫升每毫升补充5毫微克。
第二天，用300倍G计算T细胞和离心机5000万到1000万个细胞，5分钟。丢弃所有超高非纳特，用减少的血清最小必需介质清洗细胞颗粒。根据制造商的说明，将颗粒重新悬挂在 100 微升核感性溶液中。
在清洗细胞时，通过在室温下用 5 微克单导 RNA 孵育 10 微克 Cas9 核糖，准备核糖核蛋白或 RNP 复合物，为期 10 分钟。包括一个没有单一导引RNA的模拟控制。将重新悬浮的细胞与RNP复合物相结合，加入4个微摩尔电聚变增强剂的4.2微升。
混合好，并转移到电聚库韦茨。使用脉冲代码EH111对细胞进行电聚，然后以R10每毫升孵育500万个细胞，在12个井板中每毫升人体IL7和人IL15在30摄氏度下再孵育5纳米克，48小时。孵化后，继续进行T细胞激活和扩展。
通过将 PCR 放大器序列输入标准引点设计软件来设计测序引引器。设计软件将建议多个适合桑格测序的入门序列。选择与放大器结合的前进和反向底漆，在 gRNA 切割站点的上游或下游至少 150 个碱基对，以确保在 indels 周围良好的测序质量。
使用 TIDE 分析在基因组水平上检测淘汰效率。该算法从序列轨迹中精确重建了 Indels 的光谱，并计算了 R 方值。激活后，T细胞在培养中扩大，并为未来的研究保存低温。
在扩展期间，在整个协议中跟踪模拟和编辑的 CAR T 单元格的人口翻倍和体积变化。在扩展过程中，未检测到增殖和激活的重大变化。一旦细胞被冷冻保存，CAR表达水平被确定为进一步的功能研究的模拟编辑和淘汰CAR T细胞。
未观察到重大变化。敲击效率可以使用多种技术确定。在这些具有代表性的流细胞学图中，PDCD1 和 TRAC loci 使用单导 RNA 作为目标，显示 PDCD1 单导 RNA 的效率为 90%，在多个健康捐赠者中用于 TRAC 单导 RNA 的效率为 98%。
重要的是要确保Cas9和指南RNA的摩尔比率是准确的。在手术过程中，细胞应始终保持在摄氏四度，而不是长时间留在电聚液中。在CAR保存后，CRISPR设计的CAR T细胞可用于体外和体内功能检测，如细胞毒性检测、细胞因子生产以及合成或异位肿瘤小鼠模型。
我们使用CRISPR Cas9技术的方法现在正应用于临床试验。这种方法既可用于癌症，也可用于非恶性遗传性疾病，如血红蛋白，影响全世界数百万儿童和成人。
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概述
本文介绍了一种利用CRISPR-Cas技术在原代人类T细胞中进行基因编辑的协议，用于修饰CAR-T细胞。该方法允许高效地靶向多个基因，为临床应用铺平了道路。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因编辑
- 免疫治疗
- CRISPR技术
背景
- 人类基因组编辑是一个快速发展的领域。
- CAR-T细胞疗法在治疗多种癌症方面显示出希望。
- CRISPR-Cas9是一种用于精确基因修改的强大工具。
- 结合这些技术可提高治疗效果。
研究目的
- 开发一个用于T细胞基因编辑的稳健协议。
- 使CAR-T细胞的修饰能够提高疗效。
- 促进这些方法转化为临床试验。
使用的方法
- 用于基因靶向的CRISPR-Cas9技术。
- 筛选指导RNA以获得最佳基因编辑。
- 为T细胞修饰量身定制的培养协议。
- 将方法应用于各种CAR构建体。
主要结果
- 同时靶向多达三个基因的高效率。
- 方法适用于不同的CAR构建体。
- 在学术和工业环境中具有可扩展性的潜力。
- 成功的初步结果支持临床试验的准备。
结论
- 该协议为先进的CAR-T细胞疗法提供了基础。
- 稳健的技术可以应用于各种研究背景。
- 未来的研究将专注于优化和验证这些方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
CRISPR-engineered CAR-T cell production enables multiplex gene editing for next-generation adoptive cell therapies, directly addressing biological de-risking and target validation challenges in immuno-oncology pipelines. This protocol supports robust, scalable workflows for functional interrogation of gene targets and CAR constructs, facilitating predictive confidence at key discovery and translational inflection points. Its universal applicability positions it as a reusable platform for both hematological and solid tumor R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional knockout of candidate genes to clarify mechanistic roles in T cell biology.
- Supports multiplexed hypothesis testing for pathway de-risking and target prioritization.
- Facilitates rapid lead gRNA selection and validation for translational continuity.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible CAR-T cell populations for downstream functional assays.
- Provides quantitative knockout efficiency metrics via TIDE analysis and flow cytometry.
- Prepares engineered cells for high-throughput cytotoxicity and cytokine screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered CAR-T cells with in vitro and in vivo disease-relevant models for efficacy testing.
- Enables continuity from gene editing through preclinical validation and functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for clinical translation of novel CAR-T constructs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting iterative target interrogation and functional screening.
- Discovery Biology: Provides a platform for null hypothesis testing and mechanistic de-risking of gene targets in T cells.
- Screening: Standardizes CAR-T cell preparation for reproducible, quantitative assay outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of knockout efficiency and CAR expression for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges engineered cell production with in vivo efficacy and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse CAR constructs and gene targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR-T development.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable gene editing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR-T assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in T cell isolation, CRISPR-Cas9 editing, and flow cytometry analytics.
- Demands access to electroporation instrumentation and validated analytical platforms.
- Necessitates strict adherence to culture conditions and reagent ratios for reproducibility.
- Adaptable to various CAR constructs and gene targets with appropriate gRNA design.
- Practical limitations include cell viability and editing efficiency variability across donors.
