Name: 生产人类CRISPR工程的CAR-T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备靶向CD19的人源CAR-T细胞的方法。该方案支持高效多重基因敲除，适用于临床规模的免疫治疗应用，为癌症及遗传性疾病研究提供可靠的细胞工程策略。

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我们感谢人类免疫学核心实验室提供正常供体T细胞，以及宾夕法尼亚大学流式细胞术核心实验室的支持。

人T细胞由宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室提供，该实验室遵循优良实验室规范原则，具有标准化的样本接收、处理、冻存和分析标准操作程序和/或方案，符合MIATA及宾夕法尼亚大学伦理指南的要求。
1. 慢病毒载体的制备
注意：通过将包装构建体（Rev、gag/pol/RRE、VSVg 和转移质粒）分到四个独立的质粒中，病毒产物已被制成复制缺陷型，从而大大降低了发生重组事件产生具有复制能力病毒的可能性。
<ol>
	<li>转染前一天准备HEK293T细胞。在T150培养容器中接种约6 × 106个细胞，加入30 mL标准培养基（称为R10：RPMI 1640培养基，添加10%胎牛血清、10 mM HEPES、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺），于37 °C孵育过夜。18–24小时后，细胞应达到60–70%融合度，且状态良好（呈现树突状突起，并在培养瓶中均匀分布）。若细胞状态良好，则进行步骤1.2。</li>
	<li>配制转染混合液，其中包含脂质体转染试剂（96 µL）、pTRP gag/pol（批号RR13SEP19A）（18 µg）、pTRP RSV-Rev（批号RR13SEP19B-3）（18 µg）、pTRP VSVG（批号RR13SEP19C）（7 µg）包装质粒以及15 µg表达质粒（CD19bbz scFv克隆至pTRPE中）。
	<ol>
		<li>每项转染反应中，准备一个含有1 mL低血清最低必需培养基及步骤1.2所述四种质粒的离心管，另准备一个含有2 mL低血清最低必需培养基及90 µL脂质体转染试剂的离心管。将1 mL质粒混合液逐滴加入2 mL脂质体转染试剂混合液中。务必通过反复吹打数次充分混匀。室温孵育15分钟。</li>
		<li>在此期间，吸除HEK293T细胞培养瓶中的培养基，用10 mL低血清最低必需培养基轻轻洗涤细胞，再吸除液体。</li>
		<li>使用5 mL移液管将步骤1.2.1中的转染混合液（3 mL）轻柔地加入细胞培养瓶的底部角落。轻轻倾斜培养瓶，使转染混合液均匀覆盖整个培养瓶表面，室温孵育10分钟。注意避免扰动细胞单层。10分钟孵育结束后，加入35 mL R10培养基，将培养瓶放回培养箱继续培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24小时后，收集HEK293T细胞培养瓶中的上清液，转移至50 mL锥形离心管中。向HEK293T细胞中加入新鲜R10培养基，将细胞重新放回培养箱继续培养24小时。将上清液以300 × g离心，去除细胞碎片，并通过0.45 µm滤膜过滤上清液。</li>
	<li>通过高速超速离心（25,000 × g离心2.5小时，或8,000 × g过夜）浓缩步骤1.3所得滤液。将24小时病毒沉淀物在4 °C保存，同时合并48小时的病毒收集物。</li>
	<li>对48小时收集的样本重复步骤1.3–1.4，并将24小时和48小时的病毒收集物合并。48小时收集的沉淀物将包含慢病毒的总收获量。</li>
	<li>用约1 mL冷R10培养基重悬病毒沉淀，分装至100 µL冻存管中。立即使用干冰速冻分装样品，并于-80 °C保存。</li>
	<li>通过将慢病毒上清液进行系列稀释，转导固定数量的经CD3/CD28磁珠活化的人原代T细胞，以流式细胞术在72小时后检测CAR转导效率，计算功能型病毒滴度（转导单位/mL）。
	<ol>
		<li>使用抗FCM63 scFv抗体对靶向CD19的CAR进行染色。对于其他嵌合抗原受体，使用针对CAR scFv特异的荧光标记重组蛋白进行染色。流式细胞术检测显示CAR阳性细胞比例低于20%的病毒稀释度，是计算病毒滴度最准确的稀释点。当CAR阳性细胞比例超过20%时，单个阳性细胞被多次转导的概率增加，导致转导颗粒数量被低估。计算转导单位每毫升（TU/mL）=（转导细胞数 × CAR阳性细胞百分比 × 稀释倍数）/（转导体积，单位为mL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在原代人T细胞中设计sgRNA并进行基因敲除
<ol>
	<li>设计CRISPR sgRNA 
	注意：多个服务器和程序可辅助设计靶向特异性sgRNA。在本方案中，CRISPR sgRNA使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no）以及Broad研究所的gRNA设计门户（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）进行设计。
	<ol>
		<li>针对每个靶基因，设计6至10条sgRNA序列，以靶向早期编码外显子序列。 
		注意：sgRNA应具有较高的靶向效率和较低的脱靶效率。每种用于评估sgRNA效率的机器学习算法略有不同，因此建议比较多种sgRNA设计工具，并筛选出6至10条sgRNA进行后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在原代人T细胞中进行基因敲除
	<ol>
		<li>从健康志愿者供体获取自体外周血单个核细胞（PBMC）。本方案的示意图时间线见图2A，如下所述。</li>
		<li>使用市售的CD4和CD8选择试剂盒分离CD4+和CD8+ T细胞。</li>
		<li>将CD4+和CD8+ T细胞按1:1比例混合，并在R10培养基中以3×106个细胞/mL的密度过夜培养，R10培养基中添加各5 ng/mL的人IL-7（huIL-7）和人IL-15（huIL-15）。建议添加IL-7和IL-15，因为已知它们可促进中央记忆表型的形成，且经IL-7和IL-15扩增的CAR-T细胞相比IL-2扩增的CAR-T细胞具有更优的抗肿瘤效果22,23,24。</li>
		<li>次日，计数T细胞，并以300 × g离心5–10 × 106个细胞5分钟。弃去所有上清液，用低血清最低必需培养基洗涤细胞沉淀。根据制造商说明（材料表），将细胞沉淀重悬于100 µL核转染溶液中。</li>
		<li>在洗涤细胞的同时，通过将10 µg Cas9核酸酶与5 µg sgRNA在室温（RT）孵育10分钟，制备Cas9与gRNA的核糖核蛋白（RNP）复合物。Cas9与sgRNA的摩尔比为1:2.4。建议设置一个对照组（模拟转染对照），其中包含Cas9和电穿孔增强剂，但不含sgRNA。 
		注意：可在本步骤中通过分别为每个靶点制备RNP复合物，并在核转染时将其混合加入细胞，从而实现多重基因编辑。选择合适的试剂组装RNP复合物是获得高效基因敲除的关键。例如，不同供应商的Cas9核酸酶具有不同的脱靶效应，而化学修饰的sgRNA可降低对T细胞的毒性，从而提高基因敲除效率。</li>
		<li>将步骤2.2.4中重悬的细胞与步骤2.2.5中制备的RNP复合物混合，并加入4.2 µL浓度为4 µM的电穿孔增强剂（与人类基因组无同源性的ssDNA寡核苷酸）。充分混匀后转移至电穿孔比色皿中。避免产生气泡，因其会影响电穿孔效率。</li>
		<li>使用脉冲代码EH111进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至12孔板中，在含5 ng/mL huIL-7和huIL-15的R10培养基中，以5×106个细胞/mL的密度于30 °C培养48小时。48小时后，继续进行T细胞激活与扩增。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. T细胞激活、慢病毒转导与扩增
注意：在筛选sgRNA时，无需进行CAR构建体的慢病毒转导（步骤3.2）。
<ol>
	<li>计数电穿孔后的T细胞，并用含5 ng/mL人IL-7和人IL-15的预温R10培养基稀释至浓度为1 × 106 个细胞/mL。按每3个磁珠对应1个活T细胞的比例加入抗CD3/抗CD28单克隆抗体包被的磁珠以激活细胞。 
	注意：电穿孔会导致显著的细胞死亡，与未电穿孔细胞相比，存活率约为60% ± 15%。应通过活/死细胞计数确定磁珠的合适用量。将细胞转移至37 °C培养箱中，过夜孵育。</li>
	<li>过夜刺激后，使用步骤1中获得的慢病毒上清液转导CRISPR工程化T细胞。根据步骤1.7中计算的病毒滴度，加入相应体积的病毒液，使感染复数（MOI）达到3，并在37 °C继续孵育72小时。 
	注意：将R10重悬的病毒沉淀直接按细胞浓度、病毒滴度和目标MOI加入细胞中即可。</li>
	<li>72小时后，用含有10 ng/mL人IL-7和人IL-15的R10培养基补充当前培养体积的50%进行换液，并将细胞放回培养箱继续孵育48小时。不要扰动T细胞与磁珠之间形成的细胞团簇。</li>
	<li>48小时后，通过轻轻重悬细胞-磁珠混合物并进行磁性分离去除磁珠。去除磁珠后计数细胞，并用含5 ng/mL人IL-7和人IL-15的R10培养基调整细胞浓度至0.8 × 106 个细胞/mL。去磁珠后，细胞数量应与第1天电穿孔前的细胞计数相近（图2B）。</li>
	<li>24小时后，计数细胞并用R10 + 5 ng/mL人IL-7和人IL-15补充培养基，使细胞浓度维持在1 × 106 个细胞/mL。此后每24小时重复一次，直至细胞的生长动力学和细胞大小表明其已从刺激状态恢复静息。 
	注意：自此阶段起，T细胞大约每24小时倍增一次。T细胞通常经历5–7次群体倍增，静息时细胞体积约为300 ± 50 fL。</li>
	<li>细胞恢复静息后，离心收集CRISPR工程化CAR-T细胞，并用冻存液（1:1的X-Vivo培养基与FBS混合，含10% DMSO）重悬，进行冷冻保存。实验前应将冻存的CAR-T细胞复苏，并在37 °C静置培养16小时。 
	注意：建议保留约10 × 106 个细胞用于检测基因敲除效率和CAR整合情况。扩增过程中的预期群体倍增数和体积变化见图2B、2C。此外，图2D展示了模拟转导（Mock）和基因编辑CAR-T细胞中CAR的表达水平。</li>
</ol>
4. CRISPR 效率
<ol>
	<li>基因组DNA提取与目的基因扩增
	<ol>
		<li>从每个筛选培养物中离心收集3-5 × 106个T细胞。细胞可作为干燥沉淀冷冻保存，也可直接进行基因组DNA提取。在DNA提取时，将沉淀重悬于200 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，并按照制造商说明书，使用标准DNA提取试剂盒从电穿孔后的细胞中提取基因组DNA。
		<ol>
			<li>简而言之，用蛋白酶K裂解细胞，将裂解液上样至DNA结合柱。离心过程中，DNA结合于膜上，而杂质则通过。经过两次洗涤步骤以去除残留杂质和酶抑制剂后，用水洗脱DNA。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用含有DNA聚合酶、辅助蛋白、盐类和dNTPs的标准PCR反应体系，对200-300 ng基因组DNA进行扩增，并加入10 µM的上下游引物，引物应位于预期双链断裂区域的两侧。 
		注意：设计PCR引物时，需将gRNA切割位点两侧的参考基因组序列（可通过http://www.ensemble.org查询）输入NCBI引物设计工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）。PCR引物应设计为扩增产物大小在600-700 bp之间。该长度可确保设计出结合于扩增片段内部的测序引物，并与gRNA切割位点保持足够距离（至少150 bp），以保证Cas9诱导的插入缺失（indel）区域测序质量（见4.2.1节）。每个gRNA需要一对特异性引物，除非多个gRNA切割位点彼此靠近。&#160;</li>
		<li>将全部PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并使用标准琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目标扩增片段。 
		注意：确定PCR最佳退火温度的过程可能需要多轮优化。这是因为敲除（KO）序列含有插入缺失，而用于测序的目标基因区域应选择通常无插入缺失的区域，一般位于切割位点上游或下游约100 bp处。由于非同源末端连接（NHEJ）导致的插入缺失具有高度变异性，因此该位置可能差异较大。设计嵌套式测序引物并提高测序模板浓度，可有效解决测序困难问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序与插入缺失检测
	<ol>
		<li>设计可结合于凝胶纯化后扩增片段的测序引物，并将对照组（mock）和敲除组（knockout）的扩增产物送交进行Sanger测序。测序完成后，将测序迹线文件上传至Desktop Genetics软件（tide.deskgen.com, Desktop Genetics）进行TIDE分析。
		<ol>
			<li>设计测序引物时，将PCR扩增片段的序列输入标准引物设计软件（如NCBI、Eurofins或其他公开可用工具），软件将推荐多个适用于Sanger测序的引物序列。</li>
			<li>选择正向和反向测序引物，使其结合位点位于扩增片段内，且距离gRNA切割位点至少150 bp的上游或下游，以确保插入缺失区域的测序质量良好。测序色谱图将用于第4.2节的TIDE分析，因此高质量的测序数据对于准确解析插入缺失谱至关重要（参见Hultquist等人的研究）25。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采用TIDE（通过分解法追踪插入缺失，Tracking of Indels by DEcomposition）分析方法，在基因组水平检测基因敲除（KO）效率26。该算法可从测序迹线中精确重建插入缺失谱型，并计算R2值，反映TIDE软件通过非负线性建模后的拟合优度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>目的蛋白检测
	<ol>
		<li>对于其基因产物在T细胞表面表达的目的基因，取每个筛选培养物中约1 × 105个细胞，使用荧光染料标记的特异性抗体对目标蛋白进行染色。通过流式细胞术比较对照组（mock）与敲除组之间目标蛋白的表达水平，结果如图3A、3B所示。</li>
		<li>对于其基因产物在细胞内表达的目的基因，取每个筛选组约3 × 106&#160;万个细胞，用裂解缓冲液裂解，并按照标准流程进行SDS-PAGE和Western印迹分析。此外，也可采用细胞表面或胞内流式细胞术检测目标蛋白的表达情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用 iGUIDE 监测脱靶效应——文库构建、DNA 测序与分析
注意：iGUIDE 技术可用于检测 Cas9 引导切割的位置，并定量分析这些 DNA 双链断裂的分布情况。
<ol>
	<li>按照 Nobles 等人所述的方法进行 iGUIDE 操作21。Stadtmauer 等人于 2020 年使用 iGUIDE 技术针对 TRAC 位点的 sgRNA 所产生的脱靶效应已有报道13。</li>
</ol>

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<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4%2B+T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
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作者无披露信息。

本文介绍了利用CRISPR Cas9技术对CAR-T细胞进行基因编辑并制备产品以进一步测试其功能和有效性的方法。上述方案已针对在原代人T细胞中进行CRISPR基因编辑并同时通过嵌合抗原受体对T细胞进行工程化改造进行了优化。该方案可实现高效的基因敲除，并显著减少供体间差异。利用CRISPR进行基因修饰可通过消除抑制T细胞功能的受体以及制备异体CAR-T细胞，从而提高CAR-T细胞的有效性和安全性。
对于小规模扩增方案，以每组106个细胞起始，在健康正常供体中可获得约5×108个CAR-T细胞，平均经历6次群体倍增。然而，这一结果可能因目的基因是否影响T细胞的活化、转导和增殖而有所差异。五亿个细胞足以用于验证基因敲除效率、体外实验和体内实验。该方案存在多种变体，其中CRISPR编辑可在活化及CAR转导之前或之后进行。Ren等人描述了一种变体，即细胞在磁珠刺激及CAR转导后再进行编辑15。在磁珠刺激前进行CRISPR编辑的优势在于，由于T细胞尚未增殖，需要编辑的细胞数量较少，从而使操作更节省时间且...

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法彻底改变了过继性细胞治疗和癌症免疫治疗领域。CAR-T细胞是经过基因工程改造的T细胞，可表达一种合成的免疫受体，该受体将抗原特异性的单链抗体片段与来源于TCRzeta链的信号传导结构域以及T细胞活化和共刺激所必需且充分的共刺激结构域相结合1,2,3,4。CAR-T细胞的制备始于提取患者自身的T细胞，随后通过体外病毒转导将CAR模块导入，并利用作为人工抗原呈递细胞的磁珠扩增CAR-T细胞产品5。扩增后的CAR-T细胞被重新回输至患者体内，可在体内定植，清除靶向肿瘤细胞，甚至在输注后持续存在多年6,7,8。尽管CAR-T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中取得了显著的应答率，但其在实体瘤中的临床成功仍面临多种因素的挑战，包括T细胞浸润不足9、免疫抑制性肿瘤微环境10、抗原覆盖范围与特异性，以及CAR-T细胞功能障碍11,12。当前CAR-T细胞疗法的另一局限性在于使用自体T细胞。经过多轮化疗和高肿瘤负荷后，所获得的CAR-T细胞质量可能较差，与来自健康供体的同种异体CAR-T产品相比存在劣势，此外自体CAR-T细胞的制备还伴随着时间和成本上的高昂投入。利用CRISPR/Cas9对CAR-T细胞产品进行基因编辑，代表了一种克服当前CAR-T细胞局限性的新策略13,14,15,16,17。
CRISPR/Cas9 是一种由两个组分构成的系统，可用于哺乳动物细胞中的靶向基因组编辑18,19。CRISPR 相关的内切酶 Cas9 可在小RNA的引导下，通过与靶DNA序列的碱基配对，诱导产生位点特异性的双链断裂20。在缺乏修复模板的情况下，双链断裂将通过易错的非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，导致插入和缺失突变（INDELs），从而引起移码突变或提前出现终止密码子19,20,21。CRISPR/Cas9 因其高效性、操作简便、成本效益高以及能够实现多重基因组编辑，已成为增强自体和异体CAR-T细胞疗效与安全性的强大工具。该方法还可通过将CAR结构替换为TCR，用于编辑TCR导向的T细胞。此外，通过对TCR、b2m和HLA基因座进行基因编辑，还可制备出引发移植物抗宿主病风险较低的异体CAR-T细胞。
在本实验方案中，我们展示了如何将T细胞的CRISPR基因编辑技术与病毒载体介导的CAR转基因递送相结合，以生成基因组编辑的CAR-T细胞产品，从而提高其有效性和安全性。图1展示了整个流程的示意图。利用该方法，我们已在原代人源CAR-T细胞中实现了高效的基因敲除。图2A详细描述了T细胞编辑和制备过程中各步骤的时间线。本文还讨论了向导RNA设计及敲除验证的策略，以便将该方法应用于不同的靶基因。

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofactor 核心单元</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofactor X-单元</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime Pfx Supermix</td><td>ThermoFisher</td><td>12344040</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima XPN 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 抗人 CD3 抗体</td><td>Biolegend</td><td>317322</td><td>克隆 OKT3</td></tr><tr><td>BV711 抗人 PD1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>克隆 EH12.2H7</td></tr><tr><td>Cas9 电穿孔增强剂</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T 细胞分离试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CD8+ T 细胞分离试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>Corning 0.45 微米真空滤器/瓶</td><td>Corning</td><td>430768</td><td></td></tr><tr><td>Corning T150 细胞培养瓶</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNAeasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 磁力架</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 补充剂</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>huIL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>huIL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 凝胶与 PCR 纯化试剂盒</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pTRPE 表达质粒</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠 FMC63 scFv 单克隆抗体 (R19M), PE</td><td>CytoArt</td><td>200105</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>ThermoFisher</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spy Fi Cas9</td><td>Aldevron</td><td>9214</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>病毒包装混合物</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 培养基</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

人源crispr基因编辑car-t细胞的制备

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

利用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的过继性细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效，目前正被用于多种实体瘤的研究。CAR-T细胞的制备是通过从患者血液中分离T细胞，并对其进行基因改造，使其表达一种合成的免疫受体，从而引导T细胞识别并清除靶向肿瘤细胞。对CAR-T细胞进行基因编辑有望提高现有CAR-T细胞治疗的安全性，并进一步增强其治疗效果。本文描述了人源CRISPR编辑的靶向CD19的CAR-T细胞的活化、扩增及表征方法。该方法包括CAR慢病毒载体的转导，以及利用单导向RNA（sgRNA）和Cas9核酸酶靶向T细胞中特定目的基因。本方案所述方法可广泛适用于其他CAR结构及除本研究使用的基因之外的靶基因。此外，本方案还讨论了gRNA设计、先导gRNA筛选以及靶基因敲除验证的策略，以可重复地实现高效、多重的CRISPR-Cas9技术对临床级人T细胞的基因工程改造。

本文介绍一种对T细胞进行基因工程改造的实验方案，可用于生成自体和同种异体的CAR-T细胞，以及TCR重定向T细胞。
图1详细描述了制造CRISPR编辑T细胞过程中所涉及的各个阶段。该过程首先针对目标基因设计sgRNA。一旦sgRNA被设计并合成，便将其与相应的Cas蛋白形成RNP复合物。T细胞从健康供体或患者单采血液中分离获得，随后通过电穿孔或核转染将RNP复合物递送至细胞内。编辑完成后，T细胞被激活，并转导携带CAR或TCR结构编码的慢病毒载体。激活后，T细胞在体外培养中扩增，并冷冻保存以供后续研究使用。实验室所遵循的详细实验方案见图2。在扩增过程中，全程监测细胞群体倍增情况和培养体积变化，图2B和C分别展示了模拟处理组和编辑后CAR-T细胞的示例。图2B、C显示，目标基因的敲除在扩增期间未引起细胞增殖和激活的...

本文介绍了一种利用CRISPR Cas技术对原代人T细胞进行基因编辑以修饰CAR-T细胞的实验方案。

人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

采用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的过继性细胞治疗在患有……的患者中已显示出显著的临床疗效

我们的实验室方案能够将人类基因组编辑与CAR T细胞治疗相结合。该实验流程采用CRISPR-Cas9技术，可高效靶向多达三个基因。最后，我们的方法可转化为人体临床试验。所述方法可应用于其他CAR结构和靶基因。该技术的基础具有足够的稳健性，可扩展至更大规模，并可供学术界和工业界合作者进一步开发。首次尝试本方案时，应限制向导RNA筛选中的组数，以确保准确的孵育时间。根据我们的经验，遵循所述的培养条件和接种密度至关重要。首先，从健康志愿者供体获取自体外周血单个核细胞（PBMC），并使用商业化CD4和CD8分选试剂盒分离CD4阳性与CD8阳性T细胞。将CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞按1:1比例混合，以每毫升300万个细胞的密度在R10培养基中孵育，添加人IL7和人IL15各5纳克/毫升，于37摄氏度过夜培养。第二天，计数T细胞，并将500万至1000万个细胞在300 × g条件下离心5分钟。弃去所有上清液，用低血清最低必需培养基洗涤细胞沉淀。根据生产商说明书，将沉淀重悬于100微升核转染溶液中。在洗涤细胞的同时，通过将10微克Cas9核酸酶与5微克单链向导RNA在室温下孵育10分钟，制备核糖核蛋白（RNP）复合物。设置不含单链向导RNA的模拟对照组。将重悬的细胞与RNP复合物混合，并加入4.2微升4微摩尔的电穿孔增强剂。充分混匀后转移至电穿孔比色皿中。使用脉冲程序EH111对细胞进行电穿孔，随后将5×10⁶个细胞/毫升置于R10培养基中，添加10 ng/mL人IL7和10 ng/mL人IL15，于12孔板中30 °C孵育48小时。孵育结束后，进行T细胞激活与扩增。通过将PCR扩增子序列输入标准引物设计软件中来设计测序引物。该设计软件将推荐多个适用于Sanger测序的引物序列。选择正向和反向引物时，应确保其结合位点位于gRNA切割位点上游或下游至少150个碱基对处，以保证在插入缺失（indels）区域获得良好的测序质量。使用 TIDE 分析在基因组水平检测敲除效率。该算法可从测序痕迹中准确重建插入缺失突变谱，并计算 R 平方值。激活后，T 细胞在培养中扩增并冷冻保存，以用于后续研究。在扩增过程中，对模拟转导和基因编辑的CAR T细胞在整个实验流程中均追踪其群体倍增次数和体积变化。在扩增期间，细胞的增殖和活化未检测到显著变化。细胞冻存后，对模拟编辑和基因敲除的CAR T细胞均检测了CAR表达水平，以用于后续功能研究。未观察到显著变化。敲除效率可通过多种技术进行测定。在这些具有代表性的流式细胞术图谱中，使用单导向RNA靶向PDCD1和TRAC基因座，结果显示，在多个健康供体中，PDCD1单导向RNA的敲除效率为90%，TRAC单导向RNA的敲除效率为98%。确保Cas9与向导RNA的摩尔比准确非常重要。在操作过程中，细胞应始终保存在4摄氏度，并避免长时间置于电穿孔溶液中。CAR保存后，经CRISPR编辑的CAR T细胞可用于体外和体内功能检测，例如细胞毒性检测、细胞因子产生检测以及同系或异种移植肿瘤小鼠模型。我们采用CRISPR Cas9技术的方法目前正应用于临床试验。该方法既可用于癌症治疗，也可用于非恶性遗传性疾病，例如影响全球数百万儿童和成年人的血红蛋白病。

production-of-human-crispr-engineered-car-t-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

生产人类CRISPR工程的CAR-T细胞

该视频概述了通过CRISPR-Cas9系统制备基因修饰CAR T细胞的流程。将CRISPR和CAR慢病毒共同感染T细胞，可实现对目标基因的修饰，并合成嵌合抗原受体（CAR），最终生成基因修饰的CAR...

使用 CRISPR-Cas9 系统基因改造 CAR T 细胞

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA...

一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

本视频演示了一种通过逆转录病毒转导生成抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将活化的小鼠CD8+...

一种生成抗原特异性CAR T细胞的技术

在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping...

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

化疗和放疗作为标准治疗手段，具有淋巴清除和免疫调节作用，可被用于增强T细胞免疫治疗的抗肿瘤疗效。本文概述了一种生成针对EGFRvIII特异性的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并介绍了在胶质母细胞瘤标准治疗背景下给予该细胞的实施方案。...

在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的CAR T细胞的制备

本文介绍了一种通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑的实验方案。...

使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 细胞中敲除 GM-CSF

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

本方案描述了原代T细胞培养的关键步骤，包括其分离、活化、扩增以及通过mRNA电穿孔进行的瞬时转染。此外，还提出了一套用于流式细胞术分析表型、活化标志物、细胞活力以及嵌合抗原受体（CAR）表达的实验流程和抗体组合。...

分离、培养及瞬时转染人原代T细胞以生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

学习利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备靶向CD19的人源CAR-T细胞的方法。该方案支持高效多重基因敲除，适用于临床规模的免疫治疗应用，为癌症及遗传性疾病研究提供可靠的细胞工程策略。

人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

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