Name: 四重检查板:研究药物组合的三维棋盘的修改 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 了解四重检查板技术，用于微生物学中多药耐药菌的药物组合筛选。该方法可在单次实验中同时测试四种药物的所有可能组合，快速识别协同作用并显著减少实验工作量。

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1. 准备步骤
<ol>
	<li>通过将25 g MH肉汤加入1 L蒸馏水中并混匀来制备穆勒-欣顿肉汤（MHB）。在121 °C下高压灭菌2.5 h。然后将灭菌后的培养基置于室温或冰箱中保存。</li>
	<li>采用四区划线法将待测细菌（产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌，E. coli ESBL）接种至琼脂培养基上，并在37 °C下过夜培养。
	<ol>
		<li>用无菌接种环挑取单个菌落，在麦康凯琼脂平板的前半部分通过密集平行划线方式涂布。</li>
		<li>用接种环从第一区取菌，在第二区进行划线接种。</li>
		<li>从第二区开始，以密集平行划线方式延伸至第三区。</li>
		<li>从第三区取菌，向第四区中心部位划线以接种细菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 面板制备
<ol>
	<li>将四个 96 孔板并排放置，组成一个正方形。使用胶带将它们的底部粘在一起。</li>
	<li>重复此步骤，制备四个面板，每个面板包含 4 个板，并将其命名为 A1、A2、A3 和 A4。</li>
	<li>在四个面板共 16 个 96 孔板的第 2 至第 11 列孔中，每孔加入 50 µL MH 肉汤。</li>
	<li>在四个面板共 16 个 96 孔板中，向作为阴性对照孔的 H12 孔每孔加入 200 µL MH 肉汤。</li>
	<li>在四个面板共 16 个 96 孔板中，向作为阳性对照孔的 A1 和 H1 孔每孔加入 150 µL MH 肉汤。</li>
</ol>
3. 药物1，头孢噻肟，系列稀释
<ol>
	<li>向一个锥形管中加入 15 mL 无菌 dH2O。
	<ol>
		<li>根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物储备液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 15 mL) / C1。 
		注意：在本实验中，头孢噻肟（Cefotaxime）储备液浓度为 105 μg/mL，C2 为 256 μg/mL；因此，V1 = 38.4 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 15 mL 无菌 dH2O 中移除已计算出的体积，然后加入药物。</li>
	<li>将 50 µL 配制好的药物溶液加入每块板第 11 列和第 12 列的每个孔中，但 H12 孔除外。</li>
	<li>开始进行系列稀释：从第 11 列取出 50 µL 加入对应第 10 列的孔中，依次从第 10 列稀释至第 2 列，从第 2 列取出的 50 µL 需弃去。</li>
	<li>对四个面板共 16 块 96 孔板重复步骤 3.4 和 3.5。</li>
</ol>
4. 药物2，阿米卡星，系列稀释
<ol>
	<li>取一个锥形管，加入 10 mL 无菌 dH2O。</li>
	<li>根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物储备液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 10 mL) / C1。 
	注意：本实验中，阿米卡星储备液浓度为 103 μg/mL，C2 为 64 μg/mL，因此 V1 = 64 µL。</li>
	<li>从 10 mL 无菌 dH2O 中移除计算所得体积，然后加入药物。</li>
	<li>取八个独立的 96 孔板。</li>
	<li>向每个孔板中 G 至 B 行的各孔加入 100 µL MHB。</li>
	<li>向每块板 G 行各孔中加入 100 µL 前述配制的药物 2 溶液。</li>
	<li>从 G 行到 B 行进行连续梯度稀释，每次从孔中移取 100 µL，最后将 B 行各孔中的 100 µL 弃去。</li>
	<li>重复步骤 4.5、4.6 和 4.7，制备八块板。</li>
</ol>
5. 将药物2转移至四个面板
<ol>
	<li>从G行至B行的孔中吸取50 µL药物2，加入四个面板中每块板的相应孔内。一块制备好的96孔板中含有100 µL药物2，足以供应一个面板中的两块板。</li>
</ol>
6. 加入药物3，左氧氟沙星
<ol>
	<li>向四个不同的锥形管中，各加入 14 mL 无菌去离子水（dH2O）。</li>
	<li>根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物原液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 14 mL) / C1。 
	注意：在本实验中，左氧氟沙星由浓度为 5 × 103 μg/mL 的原液配制四种不同浓度： 
	C1 = 2 μg/mL，V1 = 5.6 µL 
	C2 = 4 μg/mL，V1 = 11.2 µL 
	C3 = 8 μg/mL，V1 = 22.4 µL 
	C4 = 16 μg/mL，V1 = 44.8 µL</li>
	<li>从每根含 14 mL 无菌 dH2O 的锥形管中移除已计算出的体积，然后加入相应药物。</li>
	<li>在配制好第三种药物所需浓度后，取 50 µL 加入各面板中对应板的 B 至 G 行、2 至 12 列之间的孔中，其中 C1 对应四个面板中的四个 P1 板，C2 对应四个面板中的四个 P2 板，C3 对应四个面板中的四个 P3 板，C4 对应四个面板中的四个 P4 板。</li>
</ol>
7. 添加药物4，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑
<ol>
	<li>向一个锥形管中加入 14 mL 无菌去离子水（dH2O）。</li>
	<li>根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物储备液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 14 mL) / C1。 
	注：在本实验中，复方新诺明（trimethoprim-sulfamethoxazole）从浓度为 48 × 103 μg/mL 的储备液中配制四种不同浓度： 
	C1 = 512 μg/mL，V1 = 149.33 µL 
	C2 = 1024 μg/mL，V1 = 298.66 µL 
	C3 = 2048 μg/mL，V1 = 597.33 µL 
	C4 = 4096 μg/mL，V1 = 1 194.66 µL</li>
	<li>从每根含 14 mL 无菌 dH2O 的试管中移除已计算出的体积，然后加入相应药物。</li>
	<li>在配制好第四种药物所需的四种浓度后，取 50 µL 加入四块微孔板中对应区域的孔内，加样范围为 B 至 G 行、2 至 12 列。其中，C1 对应第 1 区域，C2 对应第 2 区域，C3 对应第 3 区域，C4 对应第 4 区域。</li>
</ol>
8. 耐超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（E. coli ESBL）菌液的制备与接种
<ol>
	<li>使用无菌接种环，将先前在平板上培养的细菌分离株 E. coli ESBL 的一个菌落转移至 2 mL 无菌 MHB 中，并涡旋混匀。</li>
	<li>使用比浊仪检测浊度，应达到 0.5 麦氏单位。</li>
	<li>向无菌尿杯中加入 80 mL 无菌 MH 肉汤。</li>
	<li>根据公式 C1V1 = C2V2，将 0.5 麦氏浓度的细菌接种液加入尿杯中，其中 V1 = (106 × 80 mL) / 108 = 800 µL。</li>
	<li>除 H12 孔（作为无菌对照孔）外，向其余每孔加入 50 µL 接种液（浓度为 106 CFU/mL）。</li>
	<li>将板条于 37 °C 培养过夜。</li>
	<li>培养结束后，向各孔加入 50 µL 碘硝基四氮唑（Iodotetrazolium）以记录孔内细菌生长情况。</li>
</ol>
9. FIC 模板操作步骤（补充文件）
<ol>
	<li>在面板 A 的黄色单元格中填写药物 1（头孢噻肟）的最高浓度。</li>
	<li>在面板 B 的黄色单元格中填写药物 2（阿米卡星）的最高浓度。</li>
	<li>在面板 C 的黄色单元格中填写药物 3（左氧氟沙星）的最高浓度。</li>
	<li>在面板 D 中填写药物 4（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）的最高浓度。</li>
	<li>通过将有细菌生长的孔用红色高亮标记，描绘出红线（生长/无生长界面）。</li>
	<li>将药物 1 的 MIC 值填入药物 1 的表格中（ATB1）。</li>
	<li>将药物 2 的 MIC 值填入药物 2 的表格中（ATB2）。</li>
	<li>将药物 3 的 MIC 值填入药物 3 的表格中（ATB3）。</li>
	<li>将药物 4 的 MIC 值填入药物 4 的表格中（ATB4）。</li>
	<li>计算 ATB1 的 FIC 值
	<ol>
		<li>确定位于生长/无生长界面上的孔。</li>
		<li>在 ATB1 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 A 左侧的黄色单元格拖动到第一个选定的孔上。</li>
		<li>对每一个选定的孔重复步骤 9.10.2，其中第一个孔对应 FIC1，第二个孔对应 FIC2，依此类推。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算 ATB2 的 FIC 值
	<ol>
		<li>在 ATB2 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 B 左侧的黄色单元格拖动到第一个预选孔上。</li>
		<li>对每一个预选孔重复步骤 9.11.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算 ATB3 的 FIC 值
	<ol>
		<li>在 ATB3 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 C 左侧的黄色单元格拖动到第一个预选孔上。</li>
		<li>对每一个预选孔重复步骤 9.12.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算 ATB4 的 FIC 值
	<ol>
		<li>在 ATB4 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 D 左侧的黄色单元格拖动到第一个预选孔上。</li>
		<li>对每一个预选孔重复步骤 9.13.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在标注为 ATB1+2+3+4 的表格中，自动计算每种抗生素的 FIC1 总和。其他 FIC 值（FIC2、FIC3 等）也将以相同方式求和。
	<ol>
		<li>在包含 FIC 且以黄色高亮显示的单元格中，双击该单元格并从 ATB1+2+3+4 表格中选择总和 ΣFICs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对代表九块板的九个工作表重复上述步骤。 
	&#8203;注意：在 FIC all 工作表中，表格将显示最终的总和 FIC 值及其对应的解释。</li>
</ol>
10. 采用微量稀释法测定四种药物的最小抑菌浓度
<ol>
	<li>用每种待测药物的缩写标记四行。例如，CTX 代表头孢噻肟（Cefotaxime），AMK 代表阿米卡星（Amikacin），LEVO 代表左氧氟沙星（Levofloxacin），SXT 代表甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（Trimethoprim-sulfamethoxazole）。</li>
	<li>向每行使用的第1孔和第12孔中各加入200 µL无菌的穆勒-欣顿肉汤（Muller Hinton broth）。第12孔将作为阴性对照孔。</li>
	<li>向每行使用的第2至第11孔中各加入100 µL无菌的穆勒-欣顿肉汤。</li>
	<li>使用公式 C1V1 = C2V2 计算每种药物需要添加的体积，即 V1 = (C2 × 4 × V2) / C1。其中 V2 为孔中的终体积（200 µL），C1 为母液浓度，C2 为第一孔中所需初始浓度。 
	注意：本实验中使用以下参数： 
	头孢噻肟（Cefotaxime）：C1 = 105 μg/mL，稀释至104 μg/mL，C2 = 256 μg/mL；因此 V1 = 20.48 µL 
	阿米卡星（Amikacin）：C1 = 103 μg/mL，C2 = 64 μg/mL；因此 V1 = 51.2 µL 
	左氧氟沙星（Levofloxacin）：C1 = 5 × 103 μg/mL，稀释至5 × 102 μg/mL，C2 = 16 μg/mL；因此 V1 = 25.6 µL 
	甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（Trimethoprim-Sulfamethoxazole）：C1 = 48 × 103 μg/mL，C2 = 4096 μg/mL；因此 V1 = 68.26 µL</li>
	<li>从每行对应的第1孔中移除与药物体积相等的肉汤后，加入计算所得的每种药物体积，确保加药后总体积为200 µL。</li>
	<li>进行连续梯度稀释：从第1孔中取出100 µL加入第2孔，依次操作至第10孔，从第10孔中取出的100 µL应弃去。注意第11孔作为阳性对照孔。</li>
	<li>除作为阴性对照的第12孔外，向每行使用的各孔中加入100 µL浓度为106 CFU/mL的细菌接种液。</li>
	<li>在37 °C条件下孵育过夜。</li>
</ol>

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</ol>

四重&#160;棋盘法在实验步骤上类似于棋盘法和三维棋盘法。然而，必须考虑某些关键步骤，以避免实验过程中出现错误。
在开始实验方案之前，务必检测每种药物对受试菌株的最低抑菌浓度（MIC），以确定药物1和药物2在进行系列稀释时所需的起始浓度。对于药物3和药物4，也应已知其MIC，以便计算需要测试的浓度（即1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC和MIC）。测定MIC的方法有多种，但最佳方法是采用微量稀释法，因为Q棋盘法实验方案同样使用微量稀释法进行系列稀释。
第一步，在粘贴培养板时，确保实验台面清洁，并用无菌盖覆盖培养板以避免污染。需要注意的是，本实验方案可使用四块96孔板来完成，分别代表四个面板，每块板分为四个较小的象限。然而，第一种和第二种药物的稀释次数将减少。此外，也可使用深孔384孔板代替将四块板粘合在一起的方式。但在我们进行实验时，该类板不可用。请注意，在选择所用培养板时，务必确认每个孔的容量，因为孔内的最终体积为250 µL。
此外，每个面板中的平板数量以...

由于抗生素的过度使用和滥用导致耐药性不断增强1,2，开发新型药物和治疗细菌感染的制剂已变得至关重要。开发新药等新策略对于应对耐药性危机具有重要意义。然而，制药行业对开发新型抗菌制剂缺乏兴趣。此外，即使开发出新药，细菌仍将持续进化并对其产生耐药性3,4。因此，耐药性问题无法从根本上解决，必须探索并研究其他替代策略以应对细菌耐药性。 
药物联合使用是治疗细菌感染的一个非常重要的概念，尤其是针对由多重耐药病原体引起的感染5,6。它可缩短治疗周期、降低给药剂量，从而减少药物的毒性，有助于降低耐药性的产生速率，并在一定程度上使细菌对给定药物重新敏感，这在共线敏感性（collateral sensitivity）概念中已有描述5,7,8,9。
对一种药物产生耐药性仅需单个突变；然而，针对多条通路的联合用药则需要多个独立突变才能产生耐药性，而这种联合用药可显著延缓耐药性的发生。联合治疗降低耐药性的一个实例是结核分枝杆菌对利福平的耐药率在联合用药时降低10。另一个例子是Gribble等人开展的一项研究，结果显示单独使用哌拉西林的患者中耐药菌株出现的速率高于使用羧苄青霉素与氨基糖苷类药物联合治疗的患者10。研究表明，进化中的细菌对氨基糖苷类药物产生耐药性的同时，会使这些菌株对多种其他药物变得敏感5。β-内酰胺类药物阿莫西林与β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸联用，在治疗耐药性细菌菌株方面已显示出良好疗效8。
缩短治疗时间是药物联合使用带来的一项显著优势。例如，青霉素或头孢曲松与庆大霉素联合治疗2周，其疗效与单独使用青霉素或头孢曲松治疗4周相当11。药物联合使用使得可以采用单独使用时无效的较低剂量药物，例如亚最低抑菌浓度（Sub-MICs）。以磺胺类药物为例，使用三种磺胺类药物联合方案可在较低剂量下减少毒性反应，从而避免在高剂量使用难溶性磺胺类药物时产生的结晶形成或结晶尿等不良反应12。
因此，降低给药剂量和治疗时间最终会减少药物对机体的毒性。建立评估联合用药相互作用的方法具有重要意义。在一项研究中，结果表明联合疗法对耐药性的Acinetobacter和P. aeruginosa8的治疗更为有效。
联合用药 
研究药物组合的方法有多种，例如棋盘法、时间-杀菌曲线法和E-test法13。棋盘法可在一次实验中研究两种目标药物之间的所有可能组合。此外，该方法已被扩展用于研究三种药物的联合应用14。目前，我们进一步将其拓展用于研究四种药物的联合，主要用于多重耐药病原体的治疗。
时间-杀菌曲线实验通常用于检测某种药物的杀菌效果，也可用于评估多种药物在特定浓度下联合使用时的作用效果。本实验方案需要准备多个无菌试管或培养杯，向每个培养杯中加入肉汤培养基、药物组合以及所需的细菌菌株。在不同时间点孵育并记录光密度值后，将所得结果与所用菌株的正常生长速率进行比较，以判断其生长速率是增加、降低还是未发生变化13。
E-test 方法通常用于检测最低抑菌浓度（MIC），该方法将含有待测药物浓度梯度的试条放置于已接种的平板上。该方法也可用于检测两种药物的联合效应，此时将两条试条以相互垂直的方式置于平板上，使其在各自的 MIC 处相交13。
根据文献，目前尚无定义和研究协同作用的金标准；因此，很难评估用于研究药物组合的各种方法中哪一种更优，以及哪一种能产生更好且更可靠的结果13。然而，时间-杀菌试验（Time-kill assay） labor intensive、耗时且成本较高15,16，而E-test法仅适用于研究两种药物之间的组合。棋盘法（Checkerboard）可研究两种受试药物之间的所有可能组合，因此本研究选择该技术进行开发。

<table><tbody><tr><td>1000 &amp;micro;L 吸头</td><td>Citotest</td><td>4330000402</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>Citotest</td><td>4330-0013-17</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>corning</td><td>430828</td><td>用于药物 3 和 4 的配制</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>用于制备 0.5 麦氏浓度的细菌接种液</td></tr><tr><td>90 mm 培养皿</td><td>JRZ Plastilab</td><td></td><td>作为多通道移液器加液时的承载平台</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>corning</td><td>3596</td><td>用于系列稀释及药物组合</td></tr><tr><td>Bactrim 200, 40 mg（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）</td><td>法国 Fontenay-sous-Bois CRNEXI SAS 公司</td><td>10177403</td><td>药物 4</td></tr><tr><td>Ceforane, 1 g（头孢噻肟）</td><td>PHARCO 制药公司</td><td>24750/2006</td><td>药物 1</td></tr><tr><td>比浊仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌（E. Coli ESBL 菌株）</td><td>来自黎巴嫩圣乔治医院的临床菌株</td><td></td><td>细菌菌株</td></tr><tr><td>麦康凯琼脂加结晶紫</td><td>BIO-RAD</td><td>64169508</td><td>用于制备亚培养所用的琼脂平板</td></tr><tr><td>Miacin 500 mg/2 mL（阿米卡星）</td><td>HIKMA 制药公司</td><td>2BXMIA56N-AEF</td><td>药物 2</td></tr><tr><td>穆勒-欣顿肉汤（Muller-Hinton Broth）</td><td>BIO-RAD</td><td>69444</td><td>用于制备细菌培养基</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>GJ54761</td><td>用于系列稀释以及培养基、细菌和药物的添加</td></tr><tr><td>封口膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>OH19855 HH40868</td><td>用于添加培养基、细菌和药物</td></tr><tr><td>Tavanic, 500 mg（左氧氟沙星）</td><td>赛诺菲安万特（sanofi aventis）</td><td>221937/2009</td><td>药物 3</td></tr></tbody></table>

四重棋盘法：一种用于药物组合研究的三维棋盘法改良技术

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

药物联合治疗的概念正变得越来越重要，主要原因是药物耐药性急剧增加。四联&#160;棋盘法（也称为Q-棋盘法）旨在通过一次实验最大化四种药物之间可能获得的组合数量，从而减少使用其他方案达到相同结果所需的时间和工作量。该方案基于简单的微量稀释技术，将药物在多个96孔板中进行稀释并相互组合。
在第一组96孔板中，加入Muller-Hinton肉汤，随后加入第一种所需药物（例如，此处为头孢噻肟），进行系列稀释。完成第一步后，使用另一组96孔板对第二种药物（例如，阿米卡星）进行稀释，通过移取特定体积的药物2，加入至第一组96孔板中对应含有药物1的孔中。第三步是将第三种药物（例如，左氧氟沙星）所需浓度加入至初始组中已含有药物1和药物2组合的适当孔板中。第四步是将第四种药物（例如，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）所需浓度加入至第一组中的相应孔板中。随后，制备并加入产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌（E. coli）菌液接种物。
该方法对于评估所有可能的组合具有重要意义，并为进一步测试提供了更广泛的可能性 体内 检测。尽管该技术较为耗时且需要高度集中注意力，但其结果显著且节省时间，可在单次实验中测试大量组合。

图2A展示了头孢噻肟与阿米卡星联合特定浓度的左氧氟沙星及甲氧苄啶-磺胺甲噁唑所得的实验结果。图中左侧显示了四个平板，右侧以示意图形式标出了各药物的浓度。箭头指示的是生长/无生长界面处的孔位。有颜色的孔表示含有细菌生长的孔。我们注意到，第四个平板中包含药物组合的象限内无细菌生长，这是因为在该平板中，左氧氟沙星的浓度达到了其最低抑菌浓度（MIC），从而抑制了细菌生长。从本图可见，头孢噻肟的MIC出现在A8孔，为32 μg/mL；阿米卡星的MIC出现在E1孔，为16 μg/mL。此外，在含有1/2 MIC阿米卡星（D行）以及多种亚抑菌浓度（subMIC）的头孢噻肟和左氧氟沙星，同时联合1/8 MIC甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的孔中，也观察到了抑制效应。这些含有亚抑菌浓度药物的孔中出现的细菌生长抑制现象，可能提示这四种药物在相应浓度下存在某种协同作用。
图2B展示了将头孢噻肟和阿米卡星与特定浓度的左氧氟沙星及甲氧苄啶-磺胺甲噁唑联合使用所获得的结果。在图的左侧部分，可以看到四个平板，其...

本方案描述了如何在一个单一实验中研究四种药物之间所有可能的组合。该方法基于标准的96孔板微量稀释法，并通过计算部分抑制浓度（FICs）来评估结果。

药物联合治疗的概念正变得愈发重要，主要原因是药物耐药性急剧增加。

四重棋盘法是一种研究通过联合使用四种药物所能获得的所有可能组合的技术，对于寻找耐药微生物（主要是多重耐药菌，即 MDRs）的治疗方法具有重要意义。该技术不耗费大量人力，结果可在次日或培养期结束后获得。此外，该方法能够在一次实验中同时研究所有可能的药物组合，而不仅限于某些特定且极为有限的组合方式。此外，该技术可应用于多个学科领域，而不仅限于微生物学。它可用于研究不同抗菌剂之间的所有可能组合，而不仅限于抗菌药物。除了微生物学领域外，该技术还可用于研究抗癌药物之间的组合、植物提取物与药物之间的组合，甚至分子水平有效治疗方案组合之间的相互作用。将4个96孔板并排放置，形成一个正方形，并用胶带将它们的底部粘在一起。重复此步骤，制备四个面板，每个面板包含四个孔板，并将其命名为A1、A2、A3和A4。加入50 µL Mueller。在四个面板的1696孔板中，向第2列至第11列的孔内加入提示液和肉汤。向H12孔加入200微升Mueller Hinton肉汤，作为阴性对照。在四个面板的1696孔板中，向A1孔和H1孔各加入50微升Mueller Hinton肉汤，作为阳性对照孔。在四个面板的1696孔板中，将药物一（头孢噻肟）进行系列稀释后加入15毫升锥形管中。无菌蒸馏水。根据公式 C₁V₁ = C₂V₂ 计算需从药物储备液中取出的体积。从 15 ml 无菌蒸馏水中移除计算所得体积，并向锥形管中加入等体积的药物储备液。将配制好的药物溶液各 50 微升移入第 11 列和第 12 列的每孔中（H12 孔除外）。从第 11 列取 50 微升加入对应第 10 列的孔中，开始进行系列稀释，依次从第 10 列稀释至第 2 列，从第 2 列取出的 50 微升溶液将被弃去。对四块面板中的每一块 1696 孔板重复上述系列稀释操作。将药物二阿米卡稀释液逐级稀释后加入一个10 ml的锥形管中。使用无菌蒸馏水。计算需从药物储备液中移除的体积。从10 ml无菌蒸馏水中移除计算好的体积，并向锥形管中加入等体积的药物储备液。另取一块96孔板，在G行至B行的各孔中加入100微升无菌Mueller Hinton肉汤。在此板中，将先前配制的药物2溶液100微升加入G行各孔中。从G行到B行进行系列稀释，每次从G行各孔中吸取100微升转移至下一孔，依次操作，最终从B行各孔中弃去100微升。重复上述步骤，制备八块独立的96孔板；将药物2转移至四个板块时，使用移液器将50微升药物2从G行至B行的各孔中转移至每个板块对应孔中，一块已制备的96孔板中含有100微升药物2。这足以用于一个面板中的两块平板药物实验。将三份腰肌组织分别加入四个不同的锥形管中，每管加入14 ml无菌蒸馏水。计算需从药物储备液中移除的体积。从每支试管中移除计算好的体积的14 ml无菌蒸馏水，并加入相应体积的药物。在配制好第三种药物所需浓度后，取50微升加入对应板中B至G行、第2至第12列的相应孔中。每个面板中，C1对应四个P1板，四个面板C2对应四个P2板，四个面板C3对应四个P3板，四个面板C4对应四个P4板。对于第四种药物甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的添加，向一个锥形管中加入14 ml。使用蒸馏水。计算需从药物储备液中移除的体积。从每支试管的14 ml无菌蒸馏水中移除计算好的体积，并加入所需体积的药物。配制好第四种药物所需浓度后，取 50 微升加入 B 至 G 行、2 至 12 列之间的相应孔中。在对应的四个板中，C1 对应第一块板，C2 对应第二块板，C3 对应第三块板，C4 对应第四块板。使用无菌接种环转移，制备并加入等量 I-E-S-B-L 细菌接种物。一个细菌分离株的单个菌落等同于先前在平板上培养的菌落，将其加入2 ml无菌的Mueller-Hinton肉汤中，并涡旋混匀。通过浊度检测，调整至0.5麦氏浓度标准，使用密度计。将适量无菌Mueller-Hinton肉汤加入无菌尿杯中，然后根据公式C₁V₁ = C₂V₂，将0.5麦氏浓度的细菌接种物加入尿杯，其中V₁为800微升。除H12孔（作为无菌对照）外，向其余各孔每孔加入50微升接种液。将微孔板于37摄氏度培养过夜。本图显示的是A1板。颜色变化的孔表示含有细菌生长的孔，黑色箭头指示有细菌生长的孔位。第一、第二和第三块平板中均无生长界面。我们可以观察到，在第四块平板中，D行含有阿米卡星最低抑菌浓度（MIC）的八分之一，以及头孢噻肟和左氧氟沙星的多个亚MIC浓度，同时还含有甲氧苄啶-磺胺甲噁唑MIC的八分之一，该区域出现抑制现象。我们注意到，在含有该联合药物的象限中未见细菌生长。这是因为在该孔板中，左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）能够完全抑制细菌生长。图一B代表第二组。在该组中，我们可以观察到在RD中也出现了细菌生长抑制现象，其中含有头孢噻肟和左氧氟沙星的亚抑制浓度，以及八分之一MIC的阿米卡星和四分之一MIC的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑。图一C代表第三组A。在该图中，我们可以观察到在含有头孢噻肟和左氧氟沙星的多个亚最低抑菌浓度（sub-MIC）以及添加了甲氧苄啶-磺胺甲噁唑半量最低抑菌浓度（½ MIC）的C行和D行中，细菌生长受到抑制。其中，C行还含有阿米卡星的¼ MIC，D行含有阿米卡星的½ MIC。图1D代表面板A4。在该面板中，我们使用了1个最低抑菌浓度（1 MIC）的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，联合不同浓度的头孢噻肟、阿米卡星和左氧氟沙星。在该图中，我们可以看到，在包含该联合方案的象限中，细菌生长被完全抑制，这种抑制效应归因于1 MIC的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，在Excel文件的FIC指数表中均有体现。该表格将显示最终的抑菌联合分数（FIC），并提供对所得数值的解释。总之，Q棋盘法可在一次实验中研究四种药物之间的所有可能组合。结果于次日获得，并可通过Excel模板以简便快速的方式进行解读。

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科研

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Biology

生物学

四重检查板:研究药物组合的三维棋盘的修改

能够正常化细胞结构的黏附性微图案可用于提高药物效应检测的灵敏度，改善实验重复性，并简化自动图像采集与分析。该技术将有助于在传统细胞培养支持物上进行的药物/siRNA筛选实验，此类实验通常因细胞间变异性过大而受限。...

利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

本文介绍了用于建立和验证定量荧光检测方法以测量内向整流钾（Kir）通道活性，进而用于高通量化合物筛选的技术方案。...

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抗菌药物协同作用测试用于评估两种或多种抗生素联合使用的效果，通常采用以下两种方法之一进行：棋盘格稀释法或时间-杀菌试验。本文介绍了一种基于自动喷墨打印机辅助的棋盘格稀释法协同作用技术，以及一种经典的时间-杀菌协同作用研究方法。...

通过喷墨打印机辅助的自动化棋盘阵列法与手工时间-杀菌法进行抗菌协同作用测试

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一种用于识别靶向合成致死相互作用药物组合的数据整合工作流程

双--3-氯哌啶类化合物（B-CePs）是用于识别和表征DNA模板中G-四链体结构的有效化学探针 体外本方案详细描述了使用 B-CePs...

体外利用双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构进行化学图谱分析

我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。...

基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

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