Name: 用于研究宿主-病原体相互作用的高通量转录组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 了解高通量转录组分析方法，用于研究宿主与病原体相互作用。本方案涵盖RNA-seq数据的质量控制、差异表达分析、共表达模块鉴定及功能富集分析，采用Docker容器确保分析流程的可重复性。

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HN 由 FAPESP（资助编号：#2017/50137-3、2012/19278-6、2018/14933-2、2018/21934-5 和 2013/08216-2）和 CNPq（313662/2017-7）资助。
我们特别感谢以下资助项目对研究员的支持：ANAG（FAPESP 项目编号 2019/13880-5）、VEM（FAPESP 项目编号 2019/16418-0）、IMSC（FAPESP 项目编号 2020/05284-0）、APV（FAPESP 项目编号 2019/27146-1）以及 RLTO（CNPq 项目编号 134204/2019-0）。

<ol><li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%2C+Chikungunya%2C+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li>
<li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus%3A+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li>
<li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus-associated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69(2017).</li>
<li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritogenic+alphaviruses-an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li>
<li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li>
<li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862(2018).</li>
<li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880(2019).</li>
<li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059(2020).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li>
<li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155(2017).</li>
<li>Gonçalves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971(2019).</li>
<li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEMiTool%3A+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56(2018).</li>
<li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+differential+expression+analysis%3A+An+extended+review+and+a+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152(2017).</li>
<li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li>
<li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, Article17 (2005).</li>
<li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975(2020).</li>
<li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((webCEMiTool%3A+Co-expression+modular+analysis+made+easy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146(2019).</li>
<li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li>
<li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999(2017).</li>
<li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128(2013).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li>
<li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((g%3AProfiler%3A+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+%282019+update%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li>
<li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq%3A+accounting+for+selection+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14(2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

测序文库的制备是尽可能好地回答生物学问题的关键步骤。研究中感兴趣的转录本类型将决定所选择的测序文库类型，并影响后续的生物信息学分析。例如，在病原体与宿主相互作用的研究中，根据测序类型的不同，有可能同时鉴定出病原体和宿主的转录本序列，或仅鉴定出宿主的转录本序列。
新一代测序设备（例如Illumina平台）会测定测序质量值，该值代表碱基被错误识别的概率。下游分析对低质量序列非常敏感，可能导致基因表达的读取不足或误读。进行正确分析和解释的另一个障碍是接头序列。接头序列有助于文库构建和测序，在大多数情况下，接头本身也会被测序。近期研究发现，比对工具对最终结果的影响较小13。然而，在病原体-宿主研究中，通过测试不同的阈值以尽量减少多位置比对序列的问题，比对过程可能会产生略好的结果。
差异基因表达结果的解读需持一定谨慎态度，尤其是在每组样本数量非常少、且样本来自不同检测实验并受到批次效应干扰的情况下，这会影响差异表达基因（DEGs）的分析结果。这些结果对多个因素较为敏感：（i）所应用的数据过...

登革热病毒、黄热病病毒、基孔肯雅病毒和寨卡病毒等虫媒病毒已广泛与多次地方性暴发相关，并成为近几十年来导致人类感染的主要病原体之一1,2。感染基孔肯雅病毒（CHIKV）的个体常出现发热、头痛、皮疹、多关节痛和关节炎等症状3,4,5。病毒可扰乱细胞的基因表达，并影响多种宿主信号通路。近期，血液转录组研究利用RNA-seq技术，将急性CHIKV感染期与恢复期6或健康对照组7进行比较，以鉴定差异表达基因（DEGs）。感染CHIKV的儿童中，与天然免疫相关的基因表达上调，例如参与病毒RNA细胞感应、JAK/STAT信号通路以及Toll样受体信号通路的基因6。急性感染CHIKV的成人也表现出与天然免疫相关的基因上调，例如与单核细胞和树突状细胞活化以及抗病毒反应相关的基因7。表达下调基因富集的信号通路则包括与适应性免疫相关的通路，例如T细胞活化与分化，以及T细胞和B细胞富集相关的通路7。
有多种方法可用于分析宿主和病原体基因的转录组数据。通常，RNA-seq文库构建始于成熟poly-A转录本的富集。该步骤可去除大部分核糖体RNA（rRNA），在某些情况下也可去除病毒或细菌RNA。然而，当研究问题涉及病原体转录本检测，并且RNA测序不依赖于前述选择步骤时，测序可检测到更多种类的转录本。例如，亚基因组mRNA已被证明是验证疾病严重程度的重要因素8。此外，对于某些病毒（如CHIKV和SARS-CoV-2），即使使用poly-A富集文库，也能产生可用于下游分析的病毒序列读段9,10。当聚焦于宿主转录组分析时，研究人员可探究样本间的生物学扰动，鉴定差异表达基因和富集通路，并构建共表达模块7,11,12。本实验方案重点介绍利用不同生物信息学方法对CHIKV感染患者与健康个体进行转录组分析的过程（图1A）。代表性结果基于一项先前发表的研究数据7生成，该数据包括20名健康个体和39名急性CHIKV感染个体。

<table><tbody><tr><td>CEMiTool</td><td>计算系统生物学实验室</td><td>1.12.2</td><td>以完全自动化的方式发现和分析共表达基因模块，并生成包含高质量图表的用户友好型 HTML 报告。</td></tr><tr><td>EdgeR</td><td>Bioconductor（维护者：Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au]）</td><td>3.30.3</td><td>对具有生物学重复的 RNA-seq 表达谱进行差异表达分析</td></tr><tr><td>EnhancedVolcano</td><td>Bioconductor（维护者：Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk]）</td><td>1.6.0</td><td>生成适合发表的火山图，具有增强的着色和标签功能</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham 生物信息学中心</td><td>0.11.9</td><td>旨在为来自高通量测序的原始序列数据提供简便的质量控制检查方法</td></tr><tr><td>FeatureCounts</td><td>生物信息学部，沃尔特与伊丽莎·霍尔医学研究所</td><td>2.0.0</td><td>将比对后的测序读段分配到指定的基因组特征区域</td></tr><tr><td>MDP</td><td>计算系统生物学实验室</td><td>1.8.0</td><td>分子扰动程度（Molecular Degree of Perturbation）根据样本相对于对照组的转录组扰动情况计算评分</td></tr><tr><td>R</td><td>R 核心团队</td><td>4.0.3</td><td>用于统计计算和图形展示的编程语言及自由软件环境</td></tr><tr><td>STAR</td><td>生物信息学部，沃尔特与伊丽莎·霍尔医学研究所</td><td>2.7.6a</td><td>一种比对工具，采用可处理剪接比对的策略，专门应对 RNA-seq 数据比对中的诸多挑战</td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>约翰斯·霍普金斯大学</td><td>2.4.2</td><td>一种超快速且内存效率高的工具，用于将测序读段比对至长参考序列</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td>USADEL 实验室</td><td>0.39</td><td>对 Illumina 双端和单端测序数据执行接头序列修剪任务</td></tr><tr><td>Get Docker</td><td>Docker</td><td>20.10.2</td><td>创建可重现且可预测的生物信息学环境（https://docs.docker.com/get-docker/）</td></tr><tr><td>WSL2-Kernel</td><td>Windows</td><td>NA</td><td>https://docs.microsoft.com/zh-cn/windows/wsl/wsl2-kernel</td></tr><tr><td>Get Docker Linux</td><td>Docker</td><td>NA</td><td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td></tr><tr><td>Docker Linux Repository</td><td>Docker</td><td>NA</td><td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td></tr><tr><td>MDP Website</td><td>计算系统生物学实验室</td><td>NA</td><td>https://mdp.sysbio.tools</td></tr><tr><td>Enrichr Website</td><td>MaayanLab</td><td>NA</td><td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td></tr><tr><td>webCEMiTool</td><td>计算系统生物学实验室</td><td>NA</td><td>https://cemitool.sysbio.tools/</td></tr><tr><td>gProfiler</td><td>生物信息学、算法与数据挖掘研究组</td><td>NA</td><td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td></tr><tr><td>goseq</td><td>Bioconductor（维护者：Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk]）</td><td>NA</td><td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td></tr><tr><td>SRA NCBI study</td><td>NCBI</td><td>NA</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td></tr></tbody></table>

高通量转录组分析用于研究宿主-病原体相互作用

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

病原体可引起多种多样的传染性疾病。宿主在感染后所诱导的生物学过程决定了疾病的严重程度。&#160;为了研究这些过程，研究人员可以采用高通量测序技术（RNA-seq），以检测宿主转录组在感染不同阶段、临床结果或疾病严重程度下的动态变化。此类研究有助于更深入地理解疾病机制，并揭示潜在的药物靶点和治疗方法。本文所介绍的方案描述了一个从原始测序数据到功能分析的完整RNA测序数据分析流程。该流程分为五个步骤：（1）数据质量控制；（2）基因比对与注释；（3）统计分析以鉴定差异表达基因和共表达基因；（4）确定样本分子扰动程度；（5）功能分析。第一步旨在去除可能影响下游分析质量的技术性干扰因素。在第二步中，根据标准文库协议对基因进行比对和注释。&#160;第三步的统计分析用于识别感染样本与非感染样本之间差异表达或共表达的基因。第四步采用分子扰动程度方法验证样本变异性和潜在生物学异常值的存在。最后，第五步的功能分析揭示与疾病表型相关的通路。本流程旨在支持研究人员开展宿主-病原体相互作用研究中的RNA-seq数据分析，并推动未来必要的&#160;in vitro 或 in vivo 实验，以深入理解感染的分子机制。

转录组分析的计算环境在 Docker 平台上创建并配置。该方法使 Linux 初学者用户无需预先掌握系统管理知识即可使用 Linux 终端系统。Docker 平台利用宿主操作系统的资源，创建包含特定用户工具的服务容器图1B）。基于 Linux 操作系统 Ubuntu 20.04 发行版创建了一个容器，并已为其完整配置转录组分析环境，该容器可被访问 通过 命令行终端。在此容器中，存在一个预定义的数据集和脚本文件夹结构，该结构是所有流程分析所必需的（图1C）。我们研究团队发表的一项研究7 用于分析，包括20份来自健康个体的样本和39份来自急性CHIKV感染个体的样本（图1D).
全转录组RNA测序过程可能产生读取错误，这些错误可能由含有两个或更多转录本的簇或试剂耗尽所引起。测序平台会生成一组“FASTQ”文件，其中包含每条核苷酸碱基的序列（读段...

本文介绍了一种从原始测序数据到功能分析的完整RNA测序转录组数据分析流程，包括质量控制和预处理步骤，以及高级统计分析方法。

病原体可引起多种多样的传染病。宿主在感染后所诱导的生物学过程决定了疾病的严重程度。

欢迎使用用于研究宿主-病原体相互作用的高通量转录组分析实验方案。本方案分为以下步骤：质量控制，用于过滤低质量的测序读段并去除接头序列；测序与注释，需将测序读段比对至参考基因组，并将读段注释到基因中。统计学与共表达分析，用于鉴定差异表达基因并发现共表达模块。分子扰动程度分析，用于识别潜在的离群样本。最后，进行功能分析以确定差异表达基因的生物学功能。所有利用这些流程的工具均已预先安装在 Linux 系统中，并封装到一个 Docker 容器中。使用这些方案的样本来源于我们课题组发表在 PLOS Pathogens 上的一篇论文。样本包括 20 名健康人群和 39 名感染了基孔肯雅病毒（Chikungunya virus）的患者。采集了血液样本，并进行了RNA测序。要在Windows系统中安装Docker，您需要遵循以下步骤：访问Docker的官方网站，然后点击“Get Started”。查找适用于 Windows 的 Docker Desktop 安装程序。下载该文件。在您的计算机上本地安装。确保选中这两个选项。安装程序后，下载本实验方案所需的 Docker 镜像。进入 Windows 终端。执行命令以下载镜像。下载镜像后，您可以在 Docker Desktop 中看到该文件，并且我们可以基于此镜像启动容器。点击圆形按钮后，您需要展开原始参数和选项，以定义容器的名称，并将本地计算机上的文件夹与 Docker 内部的文件夹进行关联。此后，单击“运行”以启动容器。然后可以访问终端，该终端位于 Docker 内部的 Linux 系统中。输入 bash 命令，即可执行本实验方案中的所有命令。首先，我们需要执行源文件以启用本实验方案中的所有工具。您应进入 scripts 目录。要进行转录组分析，您必须首先下载参考基因组。为此，您需要执行以下命令。基因组下载完成后，您还需要下载基因的注释文件。为此，您需要输入以下命令。接下来，您需要配置 fastq-dump。这将允许您下载示例的测序文件。输入以下命令后，您必须使用 Tab 键进入 Tools 选项，并选中当前目录（currents directory）选项。使用 Tab 按钮保存，然后按 ok。接着快速退出 fastq-dump 工具。现在我们可以通过输入以下命令来启动读段的下载。质量控制包括以图形方式评估测序读段中的错误概率。在此步骤中，你还必须去除接头等技术性序列。要生成质量控制图，需运行 FastQC 程序。为了去除接头序列和低质量序列，您需要输入以下命令。在获得高质量的测序读段后，我们现在需要将这些读段比对到参考基因组上。比对完成后，需根据人类基因对基因进行注释，然后统计比对到每个人类基因上的读段数量。第一步是通过输入以下命令来索引参考基因组。然后输入这些命令，将测序读段比对到人类基因组上。接下来，应运行对读段进行注释的脚本。完成比对和注释后，可进行差异表达分析，即找出在一组中表达水平高于或低于另一组的基因。为了鉴定差异表达基因（DEGs），你需要运行以下命令。完成后，可将Docker中的结果数据传输至本地计算机。为此，请进入终端并输入以下命令，将所有结果保存到本地文件夹中。为了进行后续分析，您还需要将 data 目录中的所有文件复制到本地计算机的某个目录中。在本地计算机上，您将能够查看从 Docker 保存数据的各个目录。如您所见，您可以访问所有文库。您还可以打开包含质量控制报告的 HTML 文件。此外，您还可以访问包含差异表达基因的目录。在此目录中，您将找到火山图，图中显示了某一组相对于另一组上调或下调的基因，在本例中为感染基孔肯雅病毒的患者与健康对照组之间的比较。该实验方案的其余所有步骤都将在浏览器中使用网络工具执行。我们首先从 CEMiTool 开始。转到浏览器并输入以下地址。CEMiTool 可根据用户提供的表达数据集识别共表达模块。在主页面上，您可以进入菜单并点击“运行”按钮。这将打开一个新页面，您可以在其中上传表达文件。该文件位于您本地计算机的 data 目录中。您会看到有三个表达文件，我们将用于 CEMiTool 的是经过 tmm 标准化处理的文件。然后需要选择表型数据文件，同样选择包含蛋白质-蛋白质相互作用的文件，最后上传包含基因集或通路的文件。基因集文件使 CEMiTool 能够对每个共表达模块进行富集分析。接下来，应展开参数部分并点击应用 VST。之后，您只需点击“运行 CEMiTool”。运行 CEMiTool 后，您将看到已鉴定出 12 个共表达模块。通过点击此处，您可以下载这些分析的全部结果。本实验方案中将使用的另一个工具是 MDP（Molecular Degree of Perturbation，分子扰动程度）。只需在浏览器中输入 mdp.sysbio.tools 即可访问。MDP 可计算每个样本相对于一组参考样本（本例中为健康对照组）的分子距离，从而不仅能够识别潜在的离群样本，还能评估各样本相对于该对照组的扰动程度。在运行页面，只需点击按钮并选择文件，即可上传表达数据文件。然后需要上传表型数据文件。接着需定义哪一列包含分组或类别信息，以及哪个类别或分组对应于对照组。此后，即可直接运行 MDP。柱状图中，每个样本以一根柱子表示其分子扰动程度得分，不同颜色代表不同的组别。箱线图则是可视化相同结果的另一种方式，其中每个点代表一个样本，并按两个组别分开显示。为了进行功能分析，我们将使用 Enrichr 工具。为此，您需要选择差异表达的基因列表（包括上调或下调的基因），并将其作为输入基因列表导入 Enrichr 工具中。您会看到该工具包含不同的选项卡。所有结果也可下载到您的本地计算机。转录组分析的计算机环境已部署在 Docker 平台上。该方法使得没有 Linux 系统使用经验的用户也能够使用终端。该容器中包含用于数据集和脚本的预定义文件夹结构，这些文件对于所有分析都是必需的。在分析流程中，用户将使用来自20名健康个体和39名急性感染基孔肯雅病毒患者的血液转录组数据。测序平台会返回一组包含DNA序列的FASTQ文件，即测序读段及其对应每个核苷酸碱基的质量值。Phred质量评分用于表示每个碱基被错误读取的概率。工具可识别并去除样本中的低质量读段，以提高读段比对的成功率。在此步骤中，利用回收的高质量测序读段作为输入，通过比对模块将其与人类参考基因组进行比对。CEMiTool 用于识别和分析共表达模块。同一模块内的基因具有共表达关系，即这些基因在数据集的各个样本中表现出相似的表达模式。网络分析提供了关于连接度最高的基因（即枢纽基因）的信息，这些基因的名称在网络中显示。节点的大小与其连接度成正比。差异表达基因分析的结果以火山图形式进行总结。分子扰动程度分析能够识别来自健康个体和感染个体的扰动样本。MDP 可提示哪些样本可能是生物学上的离群样本。移除这些样本将影响下游分析结果。可使用 AURA 结合 Enrichr 工具进行功能富集分析。这些步骤有助于通过揭示多个差异表达基因的共同功能作用来解读结果。条形图中显示的生物学过程是根据其 p 值排序得出的前 10 个富集基因集。总之，这些实验方案涵盖了 RNA-Seq 分析的全部步骤。该流程已开发并封装到名为 Docker 的非商业系统中，以镜像形式提供，供科学界使用。由于采用了容器系统，所有脚本和工具均处于相同的特定版本下，以确保可重复性。此外，部分生物信息学分析通过免费且用户友好的网络工具完成。

high-throughput-transcriptome-analysis-for-investigating-host

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用于研究宿主-病原体相互作用的高通量转录组分析

本文重点介绍利用两种正交方法相结合的策略，鉴定宿主与病原体蛋白质之间高可信度相互作用数据集：酵母双杂交系统，随后进行一种称为高通量哺乳动物细胞相互作用检测（HT-GPCA）的高通量相互作用分析。...

宿主-病原体蛋白质-蛋白质相互作用图谱的比较研究方法

Coxiella burnetii 转座子突变体的构建及多表型高内涵筛选

我们开发了一种快速、灵敏且可重复的病原体基因表达谱分析方案，用于感染过程中的基因表达研究。...

利用数字条形码平台对感染微生物进行基因表达谱分析

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。...

利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

本方案中介绍的共培养相互作用检测方法成本低廉、通量高且操作简便。这些检测可用于观察微生物在共培养条件下的相互作用，识别相互作用模式，并表征目标微生物菌株对人类及环境病原体的抑制潜力。...

高通量共培养实验用于研究微生物相互作用

本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus...

基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

基于表型黏附，利用高通量荧光标记成像结合自动化统计分析方法检测宿主与细菌病原体之间的相互作用，可实现对细菌与宿主细胞潜在相互作用的快速评估。...

自动化高通量细菌黏附宿主细胞检测方法

本文提交的实验方案详细说明了从研究宿主-病原体相互作用的RNA测序转录组数据中预测和功能注释环状RNA所需的完整in...

计算机模拟 宿主-病原体相互作用过程中环状RNA的鉴定与表征

类肠体作为一种新型模型，正在被用于研究组织生理学与病理生理学、药物开发以及再生医学。本文中，我们描述了一种牛源原代细胞二维类肠体衍生培养系统，该系统允许与相关组织细胞类型进行共培养。该模型为胃肠道研究的建模提供了转化应用优势。...

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

基于转录组学的低成本药物筛选

了解高通量转录组分析方法，用于研究宿主与病原体相互作用。本方案涵盖RNA-seq数据的质量控制、差异表达分析、共表达模块鉴定及功能富集分析，采用Docker容器确保分析流程的可重复性。

高通量转录组分析用于研究宿主-病原体相互作用

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