使用肠道器官模型研究猿特异性相互作用的文化方法

这些研究旨在提供强大和可重复的模型系统，以进行肠道上皮的定向特定研究。可大量生成 Apical 器官，并有望进行高吞吐量筛查。单层更容易纵，并提供对尖顶和基底符号的访问。

在开始反转协议之前，请确保器官的大小直径为 150 到 250 微米。小心地从每个含有器官的井中取出和丢弃介质，而不会破坏 ECM 圆顶。在每口井中加入一毫升冰冷分离溶液，并在室温下孵育板材一分钟。

小心地用涂层尖端缓慢地抽水，小心地移出圆顶，注意不要破坏和碎片器官。将有机物悬浮液转移到用抗粘性溶液处理的板上，并将板放在4摄氏度的摇床上30分钟。30 分钟后，取出板，使用涂有防粘液的一毫升移液器尖端轻轻上下移液。

将盘子放在4摄氏度的摇床上再30分钟。取出板，让器官在室温下通过重力沉淀一到两分钟。器官沉降后，取出尽可能多的分离溶液，并加入1.5毫升DMEM F-12清洗。

让器官沉积并去除超高纳特。然后重复洗涤。尽可能多地去除DMEM F-12，并添加0.5毫升肠道器官扩张介质。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育过夜。第二天，通过以 25 到 30 度角倾斜板并沿井壁移除介质，注意不去除悬浮的器官，从而执行部分介质变化。加入0.4毫升肠道器官扩张介质，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育三天。

如果聚合器已经形成，则使用涂有防粘附液的一毫升移液器尖端，通过上下管道上下喷动 20 次来剪切聚合物，同时将尖端的末端压到板底。在重新悬念器官中加入一毫升预热0.05%的试用蛋白-EDTA。并彻底混合，以确保均匀悬挂。

如果大量细胞或大量ECM残留，则加起来将额外一毫升的Trypsin-EDTA。在37摄氏度下孵育5至10分钟，然后与一毫升移液器彻底混合，以破坏器官，使它们完全分离成单个细胞或小片段。要完全分离片段或整个器官，在37摄氏度下继续与Trypsin-EDTA的孵化，再持续三到五分钟。

一旦器官被充分分离，加入同等数量的DMEM F-12和移液器上下彻底混合。通过在细胞中添加 10% FBS 来灭活 Trypsin-EDTA。离心机碎片在200倍G为5分钟，在2至8摄氏度。

如果分离的器官不能通过上下管道和再次离心来彻底混合细胞。小心地去除尽可能多的超高超。只留下细胞颗粒

将细胞重新用肠道器官分化介质的100微升中重新填充，为每口井播种。适当调整体积以适应更大或更小的井大小。从孵化器中取出涂层板，从每口井中取出多余的地下室膜基质溶液。

将100微升细胞悬浮物加入每个细胞培养物插入的上井，将500微升肠道器官分化介质添加到下井。然后在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育。每两到三天更换一次上下井中的介质。

建立ALI培养物，从上井和下井去除介质，并在下井中加入新鲜的肠道器官分化介质，使上井空无一人。肠道器官培养与肠道器官扩张介质表现出囊性形态。当ECM被切除时，一些器官往往在头三天聚集，需要被纯粹地增加器官数量。

在ECM培养的肠道器官继续扩大，并表现出二次萌芽结构的自发形成。在没有细胞外基质的情况下，组织体维持了五天，表现出拉长、囊性和不规则的形式。非典型标记的表达，如维林和ZO-1被检测到暴露在介质的上皮的外侧。

ECM 嵌入的器官染色为核、维林和 ZO-1，显示出一种尖顶基质极性，其中 apical 侧面对器官的流明。一旦单层建立细胞形成紧密的交汇点和汇合层。汇流层还将其含有刷边的紫菜素定向到上皮的尖顶一侧，在细胞之间形成ZO-1多蛋白复合物。

过渡到ALI培养物诱导与更突出的血小板细胞进一步分化，通过染色分泌的粘液蛋白MUC2来可视化，以诱导极性反转，关键是去除所有ECM而不破坏或分裂器官。媒体的变化也应小心，以避免删除任何悬浮的器官。确保有足够的单细胞来建立单层培养物是决定其质量的主要因素。

现在，他可以在适合研究人员需要的相关系统中学习营养吸收或宿主病原体相互作用等特定功能。