使用[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描对嵌合抗原受体T细胞进行动态成像
2022年2月17日
该协议描述了非侵入性跟踪T细胞的方法，该T细胞经过基因工程改造，以使用临床可用的平台 在体内 表达嵌合抗原受体。
迄今为止，尚无临床验证的嵌合抗原受体T细胞成像平台。碘化钠共排剂代表了通过PET扫描对Car T细胞进行成像的敏感和临床相关的报告基因。NIS CAR T细胞的TLP PET成像使研究人员能够非侵入性地跟踪体内输注细胞，并有可能预测CAR T细胞疗法的疗效和毒性。
CAR T细胞的有效成像可以评估T细胞的运输和扩增，并允许制定克服局限性的策略。该协议中描述的方法很简单，可以应用于本研究中显示的CAR结构以外的其他CAR结构。首先使用标准密度梯度技术从血液样本中分离外周血单核细胞或PBMC。
为此，将15毫升密度梯度培养基轻轻加入50毫升密度梯度分离管中，避免形成气泡。为避免细胞捕获，以一比一的体积比用含有2%FBS的PBS稀释血液样品，并将稀释的血液轻轻地转移到密度梯度培养基的顶部，而不会破坏两者之间的界面。然后将分离管在室温下以1，200倍G离心10分钟。
将上清液收集到新鲜的50毫升锥形管中，通过填充管至50毫升标记，用含有2%FBS的PBS洗涤细胞，并在室温下以300倍G离心管8分钟。吸出上清液，然后将沉淀的细胞重悬于含有2%FBS的50毫升PBS中。将含有2%FBS的PBS中重悬沉淀的PBMC至浓度为每毫升10至第六个细胞的50倍。
在新鲜的50毫升管中重复洗涤。计算细胞数量，然后在室温下以300倍G离心细胞悬浮液8分钟。对于T细胞分离，将分离的PBMC转移到14毫升聚苯乙烯圆底管中。
然后使用阴性选择磁珠试剂盒，通过将PBMC置于全自动细胞分离器中的阴性选择抗体混合物中来执行T细胞分离。T细胞分离后，计数细胞并在T细胞扩增培养基或TCM中以每毫升10至第六个细胞的浓度培养细胞。接下来，通过旋转将含有抗CD3 / CD28微珠的小瓶混合，并将所需体积的微珠移出到无菌的1.5毫升微量离心管中。
洗涤时，将珠子重悬于一毫升中药中，然后将管子放在磁铁上一分钟并吸出上清液。从磁铁上取下管子后，将洗涤的珠子重悬于一毫升中药中，并重复洗涤两次。将洗涤的珠子重悬于一毫升中药中以将其转移到T细胞培养物中，然后用中药将T细胞珠悬浮液稀释至每毫升10至第六个细胞的浓度，然后将其转移到组织培养处理的六孔板中。
将孔板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。为了随着慢病毒的转导而进展，在4摄氏度下解冻涂层嵌合抗原受体或碘化钠共转子中的冷冻慢病毒。经过24至48小时的T细胞刺激后，混合T细胞以分解簇，并将新鲜解冻的慢病毒以5的多重感染率加入细胞中。
在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育转导的T细胞。在孵育的第3天，第4天和第5天，计数转导的T细胞，并通过加入新鲜的预热中药将细胞浓度调节至每毫升10至第六个细胞的1.0倍。对于携带嘌呤霉素耐药基因的NIS转导T细胞，在第三天，第四天和第五天用每毫升盐酸嘌呤霉素一微克处理细胞。
在第六天，将板放在磁铁上一分钟，分解T细胞簇并从转导的T细胞中取出抗CD3 / CD28珠子。然后将收集的细胞以每毫升10至第六个细胞的浓度放回培养物中。用流动缓冲液洗涤含有50， 000个细胞的T细胞培养物的等分试样，并用50微升流动缓冲液重悬细胞。
为了检测CAR表达，用一微升山羊抗小鼠抗体染色T细胞。为了排除死细胞，加入0.3微升活/死水。在室温下在黑暗中孵育染色的细胞。
15分钟后，用150微升流动缓冲液在650倍G下洗涤细胞，在4摄氏度下洗涤细胞三分钟。为了固定和透化染色的细胞，用100微升的固定培养基在4摄氏度下孵育细胞20分钟。然后用含有细胞透化剂（如皂苷）的100微升缓冲液洗涤细胞两次，然后离心机。
洗涤后，将透化细胞重悬于50微升的透化缓冲液中。然后加入0.3纳克抗人ETNL NIS抗体，在4摄氏度下孵育。孵育一小时后，通过加入150微升流动缓冲液和离心机洗涤细胞，如图所示。
然后用含有2.5微升抗兔二抗的50微升流动缓冲液孵育细胞，在4摄氏度下孵育细胞30分钟。如图所示洗涤T细胞后，将细胞重悬于200微升流动缓冲液中以进行流式细胞术。然后确定细胞的转导效率。
在第八天，在4摄氏度下以300倍G计数并旋转T细胞8分钟，然后用浓度为10倍10至每毫升第六个细胞的冷冻培养基重悬细胞沉淀。将一毫升细胞悬浮液转移到每个标记的冷冻小瓶中，在零下80摄氏度的冰箱中储存48小时。48小时后，将T细胞转移到液氮中。
通过称量小鼠并取出金属耳标，准备注射NIS阳性BCMA CAR T细胞的小鼠进行PET / CT成像。然后通过尾静脉注射将新鲜制备的F18四氟硼酸盐的9.25兆贝克勒注射到小鼠体内。在摄取期45分钟后，继续采集麻醉小鼠的静态PET图像15分钟，然后以360度旋转和180次投影采集5分钟的CT图像。
在这项具有代表性的分析中，两种病毒共转导为T细胞产生了NIS阳性BCMA CAR T细胞，其中超过90%的细胞为NIS阳性。对从0天到8天的T细胞生长动力学的分析表明，与未转译的细胞相比，BCMA CAR和NIS的掺入对T细胞的扩增没有显着影响。在OPM-2的流式细胞术分析中，用慢病毒转导的细胞在用嘌呤霉素处理时代表GFP表达。
接受BCMA阳性荧光素酶阳性OPM-2细胞的小鼠进行生物发光成像以确认OPM-2细胞的植入。F18四氟硼酸盐给药小鼠的PET成像显示NIS阳性BCMA CAR T细胞分布在各个器官和骨髓中。此外，从小鼠收获的骨髓细胞显示出OPM-2细胞的移植并将NIS阳性BCMA CAR T细胞递送到骨髓。
对于输注的CAR T细胞的高质量成像，重要的是要遵循NIS CAR T细胞生成方案的步骤，并确认是否存在双NIS和CAR阳性组分。
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概述
本文介绍了一种详细的工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术方案，使其表达钠碘同向转运体（NIS），从而可在临床前模型中利用[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）对CAR T细胞进行高灵敏度且具有临床相关性的成像。该方法可实现对CAR T细胞在体内的迁移、扩增和持久性进行无创追踪，有助于解决CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤中的关键挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫治疗
- 细胞成像
- 血液系统恶性肿瘤
背景
- CAR T细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤方面已显示出显著疗效。
- 由于CAR T细胞在体内的归巢、浸润和持久性较差，其临床应用受到限制。
- 细胞因子释放综合征和神经毒性等危及生命的毒性反应是重要的安全顾虑。
- 对CAR T细胞进行高效成像与追踪，对于评估治疗的有效性和安全性至关重要。
研究目的
- 建立一种将NIS整合到CAR T细胞中的方案，用于基于PET的成像。
- 实现对临床前模型中CAR T细胞的无创、高灵敏度追踪。
- 提供一种适用于多种CAR结构和靶基因的方法学。
使用的方法
- 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 利用抗CD3/CD28磁珠通过阴性筛选磁珠法分离并扩增T细胞。
- 使用携带CAR和NIS结构的慢病毒对T细胞进行转导，并通过嘌呤霉素筛选NIS阳性细胞。
- 采用流式细胞术检测CAR和NIS的表达水平及转导效率。
- 工程化T细胞的冷冻保存。
- 将NIS阳性的CAR T细胞注射至小鼠体内，随后进行[18F]TFB-PET/CT成像以追踪细胞分布情况。
主要结果
- 高效的共转导产生了NIS阳性BCMA CAR T细胞，NIS表达率超过90%。
- 与未转导的对照组相比，NIS和CAR的引入对T细胞扩增未产生不利影响。
- PET成像显示了NIS阳性CAR T细胞在小鼠各器官及骨髓中的分布情况。
- 骨髓分析证实了OPM-2肿瘤细胞的植入以及NIS阳性CAR T细胞的成功递送。
结论
- NIS 可作为 CAR T 细胞 PET 成像的敏感且具有临床相关性的报告基因。
- 该方案可实现对 CAR T 细胞迁移和扩增的无创、活体追踪。
- 该方法可适用于其他 CAR 结构和靶基因，有助于推动其在免疫治疗研究中的更广泛应用。
常见问题
行业重要性概述
无创、定量的CAR T细胞迁移和存续成像技术通过实现对体内行为的实时评估，解决了细胞治疗开发中的一个关键瓶颈。基于NIS的PET/CT成像技术的整合，为细胞分布、扩增及植入提供了具有可操作性的洞察，支持在关键的发现和转化转折点上建立预测信心。该能力增强了下一代免疫疗法在风险调整基础上的决策制定和项目优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在临床前模型中直接可视化CAR T细胞的迁移和肿瘤浸润过程。
- 通过确认工程化构建体在体内的持续存在和扩增，支持其功能验证。
- 通过将细胞定位与治疗效果相关联，有助于阐明作用机制并降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 为评估针对多个靶点的CAR T细胞构建体提供标准化的成像读出。
- 实现对细胞分布和扩增的可重复定量，用于比较筛选。
- 支持在转化工作流程中进行细胞追踪和生物分布研究的检测方法开发。
转化与临床前研究
- 将临床前成像结果与细胞治疗项目的转化生物标志物策略相整合。
- 通过在体追踪细胞命运，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供疗效和潜在毒性的早期指标，为风险调整后的推进决策提供依据。
流程与工作流整合
该成像方法通过实现对体内工程化细胞治疗的无创、定量追踪，连接了早期发现、先导优化和临床前验证阶段。
- 发现生物学：支持对CAR T细胞的转运、存续及肿瘤靶向性的假设验证。
- 筛选：提供定量、可重复的成像结果，用于CAR结构的比较与优化。
- 分析：基于PET/CT提供细胞定位与扩增的测量数据，支持数据驱动的决策制定。
- 转化研究：将临床前成像数据与细胞治疗项目的临床生物标志物策略相衔接。
- 企业级复用：提供模块化成像平台，可适配多种CAR结构及靶基因。
运营与企业影响
- 科学价值：通过实现体内实时追踪，提高对细胞治疗有效性和安全性的预测可信度。
- 操作价值：标准化成像工作流程，确保在不同项目间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提供早期可操作的读数，从而优化决策流程和资本配置。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的细胞治疗候选项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备基因工程、细胞培养和PET/CT成像技术方面的专业知识。
- 需要具备放射化学设施以进行[18F]TFB的制备，以及相应的成像设施。
- 需要建立标准化的细胞工程和成像操作流程，以确保实验的可重复性。
- 可根据需要调整实验方案，适用于多种CAR结构和靶基因。
- 依赖于临床前模型的适用性以及针对特定研究问题的成像灵敏度。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:02
Ex Vivo T Cell Isolation from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
2:47
T Cell Stimulation and T Cell Expansion
3:54
Transduction of Lentiviruses on Stimulated T Cells
5:10
Surface Staining of B Cell Maturation Antigen (BCMA)-CAR Using Goat Anti-Mouse IgG (H+L) and Intracellular Staining of NIS Using Anti-Human ETNL NIS
7:18
NIS+BCMA-CAR T Cell In Vivo Imaging Using BCMA+OPM-2 Xenograft Mouse Model
7:57
Results: T Cell Growth Kinetics and In Vivo Cell Trafficking Assay
9:08
Conclusion
![自动放射化学合成[ 18 F] 3F4AP:一种用于成像脱髓鞘疾病的新型PET示踪剂](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55537.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.884Z&w=384&q=75)
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