Name: 使用 18F 四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描对嵌合抗原受体T细胞进行动态成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解利用钠碘同向转运体对嵌合抗原受体T细胞进行正电子发射断层扫描成像的方法。该技术可实现CAR-T细胞在体内的无创追踪，用于评估细胞分布与治疗效果，适用于血液恶性肿瘤的免疫治疗研究。

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本工作部分得到了梅奥诊所K2R项目（SSK）、梅奥诊所个体化医学中心（SSK）以及Predolin基金会（RS）的支持。&#160;图1、图2和图4使用BioRender.com制作。

该方案遵循梅奥诊所机构审查委员会、机构生物安全委员会以及梅奥诊所机构动物护理和使用委员会的指导方针。
1. NIS+ BCMA-CAR T 细胞制备
注意：本方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB 17-008762）和机构生物安全委员会（IBC Bios00000006.04）的指南。
<ol>
	<li>编码BCMA-CAR、NIS及荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒的制备 
	注意：合成了第二代BCMA-CAR结构 从头合成 （参见 材料表）并克隆至由延伸因子-1α（EF-1α）启动子调控的第三代慢病毒载体中。BCMA-CAR结构（C11D5.3-41BBz）包含4-1BB共刺激域以及来源于抗人BCMA抗体克隆C11D5.3的单链可变区片段（scFv）33,34NIS 受 EF-1α 启动子调控，并通过自剪切肽（P2A）与嘌呤霉素抗性基因连接。编码荧光素酶-GFP 的慢病毒载体（见下文 材料表)&#160;用于转导肿瘤细胞，使其表达GFP和荧光素酶。
	<ol>
		<li>准备慢病毒载体质粒：pLV-EF1α-BCMA-CAR（15 µg）、pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro（15 µg）和 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro（15 µg）。 
		注意：pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro 和 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro 载体含有嘌呤霉素抗性基因。因此，转导了 NIS 或荧光素酶-GFP 的细胞可使用 1 µg/mL 或 2 µg/mL 嘌呤霉素二盐酸盐进行筛选，具体方法如前所述。14,35.</li>
		<li>接种 20 × 106 293T细胞在T175培养瓶中的培养，并于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时2确认在显微镜下直接观察时，293T细胞在培养瓶中均匀分布，融合度达到70-90%。</li>
		<li>配制主混合液，包含15 µg表达载体（如CAR、NIS或荧光素酶-GFP线性DNA）、7 µg包膜载体（VSV-G）和18 µg包装载体（gag、pol、rev和tat）。将DNA主混合液用4.5 mL转染培养基稀释，然后加入111 µL预复合试剂（混合物A）。</li>
		<li>准备一个新离心管，将129 µL脂质体转染试剂加入4.5 mL转染培养基中混匀（混合物B）。</li>
		<li>将混合物A与B混合，轻轻弹击离心管以混匀内容物。室温（RT）孵育30分钟。</li>
		<li>孵育后，直接吸除细胞上清液而不使细胞脱落，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺的16 mL培养基。随后，将混合物A与混合物B的混合液逐滴加入293T细胞中。最后，将转染后的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24小时。</li>
		<li>转染后第1天和第2天，收集293T细胞的上清液，于900 × g 10分钟，然后通过0.45 µm尼龙滤膜过滤。在24和48小时通过超速离心（112,700 × g 孵育2小时，于-80 °C冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离体 T细胞分离图1) 
	注意：所有细胞培养操作均须在层流柜中进行，并采用无菌技术和个人防护装备。外周血单个核细胞（PBMCs）从健康志愿者经血细胞分离术采集的血液中分离获得。36对本研究中使用的人源细胞进行了病原体筛查。
	<ol>
		<li>采用标准密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
		<ol>
			<li>轻轻将15 mL密度梯度介质（密度为1.077 g/mL）（含α-D-吡喃葡萄糖苷、β-D-呋喃果糖基同多聚物以及3-(乙酰氨基)-5-(乙酰甲氨基)-2,4,6-三碘苯甲酸单钠盐）加入50 mL密度梯度分离管中，避免产生气泡（参见 材料表).</li>
			<li>为避免细胞滞留，将血液样本与含2% FBS的磷酸盐缓冲液（PBS，含0.2 g/L氯化钾、0.2 g/L一水合磷酸二氢钾、8 g/L氯化钠和1.15 g/L磷酸氢二钠）按1:1体积比稀释。轻柔地将稀释后的血液加至密度梯度介质上方，避免破坏两相界面。在1,200 × g 室温下孵育10分钟。 
			注意：可使用50 mL密度梯度分离管分离4–17 mL血液样本。50 mL密度梯度分离管（参见 材料表本方案中使用的）不需要 &#34;折断&#34; 离心过程中。然而，当使用标准的50 mL离心管时，需关闭离心机刹车，且离心时间需30分钟。</li>
			<li>将上清液转移至新的50 mL锥形管中，用PBS + 2% FBS定容至50 mL洗涤，然后在300 × g 室温下持续 8 分钟。</li>
			<li>吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于 50 mL PBS + 2% FBS 中。计数细胞数量，然后在 300 × g 室温下孵育8分钟。重复上一步骤，共洗涤2次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于浓度为 50 × 106 细胞/mL，使用 PBS + 2% FBS</li>
		<li>使用阴性选择磁珠试剂盒从外周血单个核细胞中分离T细胞。 
		注意：理想的阴性分选试剂盒应包含连接有针对非T细胞表面抗原的抗体的磁珠。一种常用的试剂盒含有针对CD15、CD14、CD34、CD36、CD56、CD123、CD235a、CD19和CD16的抗体偶联磁珠（参见 材料表).
		<ol>
			<li>将PBMC转移至14 mL聚苯乙烯圆底管中。随后，将PBMC与阴性选择抗体混合物一同放入全自动细胞分离仪，按照制造商提供的方案进行T细胞分离。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T细胞刺激与T细胞扩增（图1)
	<ol>
		<li>为了培养分离的T细胞，需制备T细胞扩增培养基（TCM），该培养基由无血清造血细胞培养基添加10%人血清白蛋白和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺组成。14分离T细胞后，计数细胞并以2 × 10⁶个/mL的浓度进行培养。6 细胞/mL，用 TCM。</li>
		<li>用TCM将抗CD3/CD28磁珠洗涤三次，然后与T细胞共培养。
		<ol>
			<li>轻轻旋转混匀含有磁珠的小管。然后，用移液器吸取所需体积的磁珠（磁珠与细胞比例为3:1）（例如，当刺激1.0 × 10⁶个细胞时，加入3.0 × 10⁶个磁珠）6 T细胞的细胞数，使用3.0 × 106 将抗CD3/CD28磁珠加入无菌微量离心管（1.5 mL）中，用1 mL TCM重悬。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将含有珠子的微量离心管置于磁力架上1分钟，吸除上清液。从磁力架上取下离心管，将洗涤后的珠子重悬于1 mL TCM中。重复上述两个步骤，共洗涤3次。</li>
		<li>将磁珠重悬于1 mL TCM中，并转移至T细胞。随后，将T细胞稀释至终浓度为1.0 × 106 细胞/mL）重悬细胞。将T细胞/磁珠悬液转移至经组织培养处理的6孔板中，放入培养箱（37 °C，5% CO₂）培养。2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒滴定图2)
	<ol>
		<li>准备用于滴定实验的T细胞。确保细胞数量约为1.0 × 106 可用于滴定一种病毒的细胞。</li>
		<li>按照第1.3.2节所述刺激T细胞。</li>
		<li>接种 1.0 × 105 在96孔板（滴定板）中培养刺激后的T细胞，并于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24 小时（图2A). 按照第1.2节所述方法分离并刺激T细胞。</li>
		<li>通过向指定列的孔和未转导对照孔中加入 100 µL TCM，制备稀释板（96 孔板）图2B).</li>
		<li>将一管慢病毒颗粒置于冰上解冻，轻轻吹打混匀。取50 µL病毒上清液加入96孔板第6列的各孔中（稀释度3）图2B用移液器上下吹打混匀。</li>
		<li>进行连续稀释（2倍系列稀释）：将50 µL从A6孔转移至B6孔，再从B6孔转移50 µL至C6孔；依此类推，直至G6孔。然后，向滴定板中加入50 µL稀释后的病毒液图2B).</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育滴定板2 孵育48小时，通过流式细胞术检测CAR阳性、NIS阳性或GFP阳性细胞的百分比（图2C).
		<ol>
			<li>以650 × g离心滴定板两次，洗涤各孔 g 4 °C 下 3 分钟</li>
			<li>按照步骤1.5.3至1.5.9所述方法对转导的T细胞进行染色。</li>
			<li>根据 CAR、NIS 或 GFP 阳性细胞的百分比，使用公式计算滴度1): 
			滴度 = BCMA-CAR 的百分比+ 或 NIS+ T细胞 × 转导时的T细胞计数 × 特定稀释倍数/体积（1)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒转导与NIS+BCMA-CAR T细胞扩增
	<ol>
		<li>T细胞刺激后24至48小时，对已刺激的T细胞进行慢病毒转导（T细胞应形成细胞簇）。
		<ol>
			<li>在4 °C下解冻编码CAR或NIS的慢病毒。</li>
			<li>充分混匀刺激后的T细胞以分散细胞团块，然后直接加入新解冻的病毒，感染复数（MOI）为5.0（当转导1.0 × 10⁶个细胞时）。6 T细胞，使用5.0 × 106 慢病毒颗粒）在37 °C、5% CO₂条件下培养转导后的细胞2.</li>
			<li>在第3、4、5天，使用血细胞计数板对转导的T细胞进行计数37&#160;或全自动细胞计数仪38&#160;并调整细胞浓度至 1.0 × 106 细胞/mL，通过添加新鲜的预温TCM实现。对于转导了NIS并携带嘌呤霉素抗性基因的T细胞，在第3、4、5天以1 µg/mL的盐酸嘌呤霉素处理细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第6天，通过充分混匀以打散T细胞聚集体，并将细胞置于磁铁中1分钟，从而去除转导T细胞（来自步骤1.3.4）中的抗CD3/CD28磁珠。随后，将收集的转导T细胞重新置于培养中，细胞浓度为1.0 × 106 细胞/mL。从T细胞中去除磁珠后，通过流式细胞术检测CAR和NIS的表达水平。 
		注意：由于BCMA-CAR的单链可变区片段来源于小鼠，因此可使用与Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG（H+L）进行染色。NIS可通过抗人ETNL抗体进行检测［该抗体针对对应于氨基酸625-643（SWTPCVGHDGGRDQQETNL）的合成肽段］。该抗体识别NIS的胞质C末端，因此在与抗人NIS抗体孵育前必须对T细胞进行透化处理。</li>
		<li>使用山羊抗小鼠IgG（H+L）对BCMA-CAR进行表面染色。
		<ol>
			<li>取一份培养物（例如50,000个T细胞），用流式缓冲液（PBS、1% FBS和1%叠氮化钠）洗涤。随后，将细胞重悬于50 µL流式缓冲液中，加入1 µL羊抗小鼠抗体以检测CAR表达，并加入0.3 µL活死染料Aqua用于排除死细胞。</li>
			<li>在室温避光孵育15分钟，加入150 µL流式缓冲液洗涤细胞，然后以650 × g 4 °C 下持续 3 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>表面CAR染色后，加入100 µL固定液（含4.21%甲醛的PBS），在4 °C孵育20分钟，以固定并透化细胞。使用含皂苷等细胞透化剂的缓冲液各100 µL，洗涤细胞两次（650 × g 4 °C下离心3分钟。</li>
		<li>将固定和透化的细胞重悬于50 µL透化缓冲液中。然后加入50 µL流式缓冲液中的0.3 ng抗人ETNL NIS抗体，在4 °C孵育1小时。</li>
		<li>加入150 µL流动缓冲液，以650 × g离心细胞 g 4 °C下离心3分钟。在50 µL流式缓冲液中加入2.5 µL抗兔二抗，4 °C孵育细胞30分钟，加入150 µL流式缓冲液洗涤细胞，然后以650 × g 4 °C下持续3分钟</li>
		<li>最后，用200 µL流式缓冲液重悬细胞，进行流式细胞术检测以确定转导效率（图3A，B).</li>
		<li>第8天，计数T细胞并在300 × g 4 °C 下孵育 8 分钟。用冻存液（90% FBS + 10% 二甲基亚砜 [DMSO]）重悬 T 细胞，细胞浓度为 10 × 106/mL，然后将1 mL分别转移至已标记的冻存管中。</li>
		<li>将小瓶置于 -80 °C 超低温冰箱中保存 48 小时。48 小时后（并在第 10 天前），将 T 细胞转移至液氮中保存。 
		注意：参见 图1 NIS 概述+ CAR T细胞制备 图3D 代表……的示例 离体 来自三位不同供体的T细胞扩增</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用[&#160;18F]TFB-PET扫描对NIS+ BCMA-CAR T细胞进行成像
注意：本方案遵循梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC A00001767-16）、机构审查委员会（IRB）和机构生物安全委员会（IBC（Bios00000006.04））的指南。OPM-2 是一种 BCMA+ 多发性骨髓瘤细胞系，常被用作 BCMA-CAR T 细胞的靶细胞系39,40。
<ol>
	<li>建立荧光素酶+ BCMA+ OPM-2 细胞
	<ol>
		<li>在经组织培养处理的24孔板中接种500,000个OPM-2细胞。在4 °C条件下解冻编码荧光素酶-GFP的慢病毒。</li>
		<li>以 3.0 的感染复数（MOI）将新鲜解冻的病毒加入 OPM-2 细胞中，用移液器轻轻吹打混匀。将培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）2).</li>
		<li>转导48小时后，加入2 µg/mL嘌呤霉素以筛选转导成功的细胞。转导四天后，通过流式细胞术检测GFP阳性细胞（即荧光素酶阳性细胞）。图3E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立 BCMA+ OPM-2 异种移植小鼠模型（图4).
	<ol>
		<li>计数荧光素酶+ OPM-2 细胞离心两次，以彻底去除细胞培养基。将 OPM-2 细胞重悬于浓度为 10 × 106 细胞/mL，用PBS悬浮。</li>
		<li>在第 -21 天，注射 100 µL（1.0 × 106 荧光素酶的细胞+ 将OPM-2细胞注入8至12周龄免疫缺陷型NOD小鼠的尾部scid IL2rγnull (NSG) 小鼠 (图4).</li>
		<li>在OPM-2细胞注射后第20天（CAR T细胞注射前第1天），通过生物发光成像（BLI）检测肿瘤负荷（图4). 
		注意：OPM-2 细胞形成的肿瘤生长缓慢，通常需要 2–3 周才能成功植入。</li>
		<li>通过腹腔（IP）注射，按 10 µL/g 剂量给予 OPM-2 异种移植小鼠 D-荧光素。注射 10 分钟后，在 2% 异氟烷气体麻醉下对小鼠进行生物发光成像（BLI）图5A在确认肿瘤移植成功后，根据肿瘤负荷将小鼠随机分组。</li>
		<li>在CAR T细胞注射前第1天，解冻NIS+BCMA-CAR T 细胞，并通过离心（300 × g，8 分钟，4 °C）。随后，用 TCM 重悬细胞至 2.0 × 106 细胞/mL，37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2).</li>
		<li>第0天，计数并离心NIS+BCMA-CAR T 细胞（300 × g，8 分钟，4 °C）。重悬 NIS+BCMA-CAR T 细胞，50 × 106 细胞/mL，用PBS悬浮。</li>
		<li>注射 100 µL（5.0 × 106 NIS 的细胞+通过尾静脉注射将BCMA-CAR T细胞注入OPM-2异种移植小鼠。在第7天和第15天，使用PET扫描对小鼠进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NIS+BCMA-CAR T细胞 体内 使用BCMA进行成像+OPM-2 异种移植小鼠模型
	<ol>
		<li>在成像前称量小鼠体重，并移除任何金属耳标以消除与金属相关的伪影。</li>
		<li>制备[18F]TFB，方法同前41. 
		注意：[18F]TFB 必须在使用当天制备。放射化学纯度应 &#62;99% 和摩尔活度 &#62;5 GBq/mmol</li>
		<li>注射 9.25 MBq [18通过尾静脉注射将[F]TFB经静脉注入。给予约40分钟的摄取期，使放射性示踪剂在体内分布并清除血液中的残留。</li>
		<li>使用异氟烷吸入（2%）对小鼠进行麻醉。 
		注意：异氟烷是首选的吸入性麻醉剂，因其起效迅速且可靠，恢复也较快。</li>
		<li>在麻醉小鼠之前，使用消毒清洁剂清洁麻醉机的所有表面。</li>
		<li>将小鼠放入诱导室中。将蒸发器旋钮调至2%，等待1-2分钟，直至小鼠呈侧卧且无反应状态。</li>
		<li>监测小鼠以避免麻醉不足或呼吸功能过度抑制。简言之，可通过捏足趾确认是否存在麻醉不足。 
		注：正常呼吸频率最高可达180次/分钟，可接受的下降率为50%。</li>
		<li>涂抹眼膏以防止角膜干燥和损伤。</li>
		<li>注射后45分钟，在麻醉状态下使用小动物PET/CT成像工作站获取小鼠的PET/CT图像（参见 材料表然后，采集15分钟静态PET图像，随后以360°旋转、180个投影、500 µA、80 keV和200 ms曝光条件采集5分钟CT图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析获取的成像数据
	<ol>
		<li>使用 PET 图像处理软件分析图像（图5B 和 补充视频 S1).</li>
		<li>定义感兴趣区域（VOI）。</li>
		<li>使用公式计算标准化摄取值（SUV）2). 
		VOI 中的 SUV = VOI 内放射活性浓度（MBq/mL）× 体重（g）/ 注射剂量（MBq）&#160; (2)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NIS 的确认+BCMA-CAR T细胞通过流式细胞术检测向肿瘤部位的迁移
	<ol>
		<li>之后[18F]TFB-PET 成像后，将小鼠放回笼中。麻醉停止后，需监测动物直至其恢复有目的的运动，并确保其能够获取食物和水。</li>
		<li>监测小鼠，直至注射的[18F]TFB。一旦放射性同位素无法被检测到，使用CO₂处死小鼠2.</li>
		<li>实施安乐死时，将小鼠放入笼中（每笼不超过5只小鼠）。</li>
		<li>将小鼠暴露于CO2 直至呼吸完全停止，大约需要5-10分钟。 
		注意：此安乐死方法必须符合《美国兽医协会动物安乐死指南》（2020年版）。</li>
		<li>为确保小鼠死亡，应通过抓住动物头部后方和尾根部，然后将双手向外拉开进行颈椎脱位。</li>
		<li>收获骨髓以确认 NIS+BCMA-CAR T细胞能有效迁移至肿瘤部位。</li>
		<li>将收获的股骨和胫骨转移至含有5 mL细胞培养基的6孔板中。去除股骨和胫骨上的肌肉和肌腱，并简单剪去股骨和胫骨的两端（关节上方）。</li>
		<li>用胰岛素注射器吸取细胞培养基，将骨髓冲洗至6孔板中。对于股骨，使用22 G针头和5 mL注射器，因为股骨直径大于胫骨。</li>
		<li>使用注射器推杆的平端研磨骨髓。将70 µm细胞滤网置于无菌50 mL锥形管上，过滤研磨后的骨髓。随后用流式缓冲液补满管体积，在300 × g 4 °C下离心8分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，用 5 mL 流式缓冲液重悬骨髓细胞。取 200 µL 骨髓细胞悬液转移至 96 孔板。以 300 × g 4 °C 下离心 3 分钟。倾去上清液，用 50 µL 流式缓冲液重悬细胞。</li>
		<li>使用针对 0.25 µg 小鼠 CD45、0.03 µg 人 CD45、0.06 µg 人 CD3、0.24 µg 人 BCMA 以及 0.3 µL 活/死染料（aqua）的流式抗体对骨髓进行染色。将培养板在室温避光孵育 15 分钟。</li>
		<li>将培养板在300 × g条件下离心 g 4 °C 下孵育 3 分钟。然后加入 200 µL 流式缓冲液，在流式细胞仪上检测（图5C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

SSK 是诺华（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）和 Mettaforge（通过梅奥诊所）授权的 CAR 免疫疗法领域专利的发明人。RS、MJC 和 SSK 是人类基因公司（Humanigen）授权的 CAR 免疫疗法领域专利的发明人。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、Celgene、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis、Leahlabs 和 Lentigen 的研究资助。图片使用 BioRender.com 制作。

本文介绍了一种将NIS整合到CAR T细胞中的方法，并对输注后的CAR T细胞进行成像 体内 通过 [18F]TFB-PET。作为概念验证，NIS+通过双重转导生成BCMA-CAR T细胞。我们近期报道过，将NIS整合入CAR T细胞不会损害CAR T细胞的功能与疗效 体内 并允许CAR T细胞的迁移和扩增30随着CAR T细胞疗法的应用从现有的B细胞恶性肿瘤进一步拓展至慢性淋巴细胞白血病（CLL），人们将更加需要能够实现无创监测的工具 体内 输注的过继性T细胞的成像与监测。T细胞的动态成像将有助于验证过继性T细胞的迁移行为，并可能实现对疗效和毒性的早期检测。
NIS 已在临床试验中被研究并验证为一种用于成像细胞和病毒的敏感模态32,42。NIS 示踪剂的生理性摄取主要见于甲状腺/唾液腺、胃和膀胱，这些器官通常不是液体肿瘤...

嵌合抗原受体T（CAR T）细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中是一种快速兴起且具有潜在治愈前景的治疗策略1,2,3,4,5,6。在靶向CD19的CAR T（CART19）或靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR T细胞治疗后，已报道了显著的临床疗效2。这促使美国食品药品监督管理局（FDA）批准了CART19细胞用于治疗侵袭性B细胞淋巴瘤（axicabtagene ciloleucel（Axi-Cel）4、tisagenlecleucel（Tisa-Cel）3和lisocabtagene maraleucel）7、急性淋巴细胞白血病（Tisa-Cel）5,8、套细胞淋巴瘤（brexucabtagene autoleucel）9以及滤泡性淋巴瘤（Axi-Cel）10。最近，FDA还批准了靶向BCMA的CAR T细胞疗法用于多发性骨髓瘤（MM）患者（idecabtagene vicleucel）11。此外，针对慢性淋巴细胞白血病（CLL）的CAR T细胞疗法正处于临床开发的后期阶段，预计在未来三年内将获得FDA批准1。
尽管CAR T细胞疗法取得了前所未有的成果，其广泛应用仍受到以下因素限制：1）不足的 体内 CAR T细胞扩增不足或向肿瘤部位迁移能力差，导致持久应答率降低12,13&#160;以及2）危及生命的不良事件的发生，包括细胞因子释放综合征（CRS）14,15CRS 的特征不仅包括免疫系统激活导致炎性细胞因子/趋化因子水平升高，还包括在 CAR T 细胞输注后出现大量 T 细胞增殖。15,16因此，开发一种经过验证的、临床级别的CAR T细胞成像策略 体内 可实现1）CAR T细胞的实时追踪 体内 以监测其向肿瘤部位的迁移并揭示潜在的耐药机制，以及2）监测CAR T细胞的扩增情况，并可能预测其毒性反应，例如细胞因子释放综合征（CRS）的发生。
轻度细胞因子释放综合征（CRS）的临床特征包括高热、乏力、头痛、皮疹、腹泻、关节痛、肌痛和全身不适。在较严重的CRS中，患者可能出现心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾/肝衰竭以及弥散性血管内凝血17,18。总体而言，细胞因子（包括干扰素-γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素（IL）-10和IL-6）升高的程度已被证明与临床症状的严重程度相关17,19。然而，由于成本高昂且检测可及性有限，对血清细胞因子进行&#34;实时&#34;监测以预测CRS的应用受到限制。为了充分利用CAR T细胞治疗的优势，可采用过继性T细胞的无创成像技术，以预测CAR T细胞输注后的疗效、毒性反应及复发情况。
多位研究人员已开发出利用基于放射性核素成像的正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射计算机断层扫描（SPECT）的策略，该技术具有高分辨率和高灵敏度20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30&#160;对于 体内 CAR T细胞迁移的可视化与监测。在这些基于放射性核素的成像策略中，钠碘同向转运体（NIS）已被开发为一种利用PET扫描成像细胞和病毒的敏感手段31,32. NIS+CAR T细胞成像与[18F]TFB-PET 是一种灵敏、高效且便捷的技术，可用于评估和诊断 CAR T 细胞的扩增、迁移及毒性30. 本方案描述了1）NIS的开发+通过高效双重转导制备CAR T细胞以及NIS成像的方法+CAR T细胞与[18F]TFB-PET&#160;扫描。多发性骨髓瘤（MM）中的BCMA-CAR T细胞被用作概念验证模型，以描述NIS作为CAR T细胞成像报告基因的应用。然而，这些方法可推广至其他任何CAR T细胞治疗。

<table><tbody><tr><td>22 号针头</td><td>Covidien</td><td>8881250206</td><td></td></tr><tr><td>28 号胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>抗人（ETNL）NIS 抗体</td><td>Imanis</td><td>REA009</td><td>ETNL 抗体结合 NIS 的胞质 C 末端</td></tr><tr><td>抗人 BCMA，克隆 19F2，PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>357507</td><td>流式抗体</td></tr><tr><td>抗人 CD45，克隆 HI30，BV421</td><td>BioLegend</td><td>304032</td><td>流式抗体</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45，克隆 30-F11，APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>流式抗体</td></tr><tr><td>抗兔 IgG 抗体</td><td>R&amp;D</td><td>F0110</td><td>NIS 染色二抗</td></tr><tr><td>BCMA-CAR 构建体，第二代</td><td>IDT, Coralville, IA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>CD3 单克隆抗体（OKT3），PE，eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 系统&amp;nbsp; B5-R3-V5</td><td>Beckman Coulter</td><td>C04652</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>带鲁尔锁扣头的一次性注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS（杜氏磷酸盐缓冲液）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S（磁性颗粒浓缩器）</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep 磁力架</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 T 细胞分离试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>阴性选择磁珠；17951RF 包含吸头和缓冲液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>Inveon 多模态 PET/CT 扫描仪</td><td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td><td>10506989 VFT 000 03</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷液体</td><td>Piramal Critical Care</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina S5 成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;reg; Spectrum 活体成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>&amp;nbsp;124262</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒，适用于 405 nm 激发</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快速流动 500 mL 真空滤器，0.22 µm，无菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快速流动 500 mL 真空滤器，0.45 µm，无菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid&amp;nbsp;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson laboratory</td><td>05557</td><td></td></tr><tr><td>OPM-2</td><td>DSMZ</td><td>CRL-3273</td><td>多发性骨髓瘤细胞系</td></tr><tr><td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td><td>Addgene</td><td>80389</td><td>编码荧光素酶-GFP 的慢病毒载体</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓度），液体</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PMOD 软件</td><td>PMOD</td><td>PBAS 和 P3D</td><td></td></tr><tr><td>混合人 AB 血清，血浆来源</td><td>Innovative Research</td><td>IPLA-SERAB-H-100ML</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td>0210055210</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>全自动细胞分离仪</td></tr><tr><td>RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640 培养基）</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50（IVD）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>密度梯度分离管</td></tr><tr><td>叠氮化钠，5%（w/v）</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Terrell（异氟烷，USP）</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-019-10</td><td></td></tr><tr><td>Webcol 酒精消毒片</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

动态成像嵌合抗原受体t细胞与[18f]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程T细胞在针对B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤（MM）患者的关键临床试验中已展现出前所未有的疗效。然而，由于CAR T细胞向肿瘤部位的迁移和浸润能力较差，以及体内持久性不足，多种障碍限制了其治疗效果，并阻碍了该疗法的广泛应用 体内此外，危及生命的毒性反应（如细胞因子释放综合征或神经毒性）是主要关注的问题。对CAR T细胞进行高效且灵敏的成像与追踪，能够实现对T细胞迁移、扩增以及 体内 表征并有助于制定策略以克服当前CAR T细胞疗法的局限性。本文描述了将钠碘同向转运体（NIS）整合至CAR T细胞的方法，以及利用[18F]四氟硼酸盐-正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）在临床前模型中的应用。本方案中描述的方法也可应用于其他CAR结构和靶基因，而不仅限于本研究中所使用的内容。

图1展示了生成NIS+BCMA-CAR T细胞的步骤。第0天，分离外周血单个核细胞（PBMCs），然后通过阴性选择法分离T细胞。接着，使用抗CD3/CD28磁珠刺激T细胞。第1天，用NIS和BCMA-CAR慢病毒同时转导T细胞。第3、4、5天，对T细胞进行计数，并添加培养基，调整细胞浓度至1.0 × 106/mL。对于转导了NIS的T细胞，加入1 μg/mL嘌呤霉素以筛选NIS+细胞。第6天，将细胞置于磁铁中1分钟，去除磁珠。然后将去除了磁珠的细胞从管中转移至新的培养瓶中。取一部分细胞（例如50,000个细胞），用抗体染色，通过流式细胞术检测T细胞表面NIS和CAR的表达情况。第8天，对T细胞进行计数，并以10 × 106/mL的浓度用冻存液进行冷冻保存。
图2 表示慢病毒滴定的流程。第0天，将T细胞重悬至浓度为1.0 × 106/mL 的 TCM 中。然...

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内 使用一种临床可获取的平台。

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程T细胞在针对B细胞恶性肿瘤患者的关键临床试验中已显示出前所未有的疗效。

目前尚无经过临床验证的嵌合抗原受体T细胞成像平台。钠碘同向转运体（NIS）作为一种敏感且具有临床相关性的报告基因，可用于通过正电子发射断层扫描（PET）对CAR T细胞进行成像。利用TLP PET对表达NIS的CAR T细胞进行成像，可使研究人员无创地在体内追踪输注的细胞，并有望预测CAR T细胞治疗的疗效与毒性。 高效成像CAR T细胞有助于评估T细胞的迁移和扩增，并可推动克服现有局限性策略的开发。本方案所述方法简便，可应用于本研究中所示以外的其他CAR结构。首先采用标准密度梯度法从血液样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。为此，轻轻将15毫升密度梯度介质加入50毫升密度梯度分离管中，避免产生气泡。为防止细胞滞留，用含有2% FBS的PBS以1:1的体积比稀释血液样本，并小心地将稀释后的血液加至密度梯度介质上方，避免破坏两者的界面。然后在室温下以1,200 × g离心10分钟。将上清液收集到一个新的50毫升锥形管中，用含有2% FBS的PBS洗涤细胞，加液至50毫升刻度线，然后在室温下以300 × g离心8分钟。弃去上清液，再将沉淀的细胞重悬于50毫升含2% FBS的PBS中。将沉淀的PBMCs重悬于含2% FBS的PBS中，调整细胞浓度至50 × 10⁶个细胞/毫升。在新的50毫升离心管中重复洗涤步骤。计数细胞数量，然后在室温下以300 × g离心8分钟。进行T细胞分离时，将分离得到的外周血单个核细胞（PBMCs）转移至14毫升聚苯乙烯圆底管中。然后使用阴性选择磁珠试剂盒，通过将外周血单个核细胞（PBMCs）置于阴性选择抗体混合液中，并在全自动细胞分离器中进行T细胞分离。T细胞分离后，计数细胞，并以每毫升2×10⁶个细胞的浓度将细胞接种于T细胞扩增培养基或TCM中进行培养。接着，轻轻旋转混匀含有抗CD3/CD28磁珠的小瓶，用移液器吸取所需体积的磁珠至无菌的1.5毫升微量离心管中。洗涤时，将磁珠重悬于1毫升TCM中，然后将离心管置于磁力架上静置1分钟，吸除上清液。从磁力架上取下离心管后，将洗涤后的磁珠再次重悬于1毫升TCM中，并重复洗涤两次。将洗涤后的磁珠重悬于1毫升TCM中以转移至T细胞培养物中，随后用TCM将T细胞-磁珠悬液稀释至浓度为1.0 × 10⁶ 个细胞/毫升，再转移至经组织培养处理的6孔板中。将培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。为进行慢病毒转导，需在4摄氏度条件下解冻冻存的慢病毒，该病毒携带嵌合抗原受体或钠碘同向转运体。T细胞刺激24至48小时后，混匀T细胞以打散细胞团块，并以感染复数为5的比例将 freshly thawed 慢病毒加入细胞中。将转导的T细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。孵育的第3、4、5天，计数转导的T细胞，并通过加入新鲜预热的TCM将细胞浓度调整至每毫升1.0×10⁶个细胞。对于携带嘌呤霉素抗性基因的NIS转导T细胞，在孵育的第3、4、5天，用浓度为每毫升1微克的嘌呤霉素二盐酸盐处理细胞。第六天，将转导后的T细胞置于磁铁上一分钟，以打散T细胞簇并去除抗CD3/CD28磁珠。随后将收集的细胞重新放回培养体系中，细胞浓度为每毫升1.0 × 10⁶个细胞。用流式缓冲液洗涤含有50,000个细胞的T细胞培养等分试样，并用50 µL流式缓冲液重悬细胞。为检测CAR表达，用一微升山羊抗小鼠抗体对T细胞进行染色。为排除死细胞，加入0.3微升LIVE/DEAD Aqua染料。将染色后的细胞在室温下避光孵育。孵育15分钟后，在4°C条件下，以650 × g离心3分钟，用150微升流式缓冲液洗涤细胞。为固定并通透已染色的细胞，将细胞与100微升固定液在4°C条件下孵育20分钟。随后用含有皂苷等细胞通透剂的缓冲液洗涤细胞两次，每次100微升，并进行离心。洗涤后，将透化的细胞重悬于50微升透化缓冲液中。然后加入0.3纳克抗人ETNL NIS抗体，在4摄氏度下孵育。孵育一小时后，加入150微升流式缓冲液洗涤细胞，并按所示方法进行离心。然后在4°C条件下，将细胞与含有2.5微升抗兔二抗的50微升流式缓冲液共同孵育30分钟。按照前述方法洗涤T细胞后，将细胞重悬于200微升流式缓冲液中，进行流式细胞术检测。随后测定细胞的转导效率。第8天，将T细胞在4°C条件下以300 × g离心8分钟，计数后用冻存液重悬细胞沉淀，细胞浓度为每毫升10 × 10⁶个细胞。将1毫升细胞悬液转移至每个已标记的冻存管中，于-80°C冰箱中保存48小时。48小时后，将T细胞转移至液氮中长期保存。将注射了NIS阳性BCMA CAR-T细胞的小鼠进行PET/CT成像前准备，包括称重并去除金属耳标。随后通过尾静脉注射，向小鼠静脉内注射9.25兆贝可新鲜配制的F18四氟硼酸盐。经过45分钟的摄取期后，对麻醉状态的小鼠进行15分钟的静态PET图像采集，随后进行CT图像采集，旋转360度，共180个投影，持续5分钟。在此代表性分析中，将两种病毒共转导至T细胞后，生成了NIS阳性的BCMA CAR T细胞，其中超过90%的细胞为NIS阳性。对T细胞从第0天至第8天的生长动力学分析显示，与未转导的细胞相比，导入BCMA CAR和NIS对T细胞扩增无显著影响。在对OPM-2细胞的流式细胞术分析中，经慢病毒转导并在嘌呤霉素处理后，细胞表现出GFP表达。 接受BCMA阳性且荧光素酶阳性的OPM-2细胞的小鼠进行了生物发光成像，以确认OPM-2细胞的植入情况。给予F18四氟硼酸盐的小鼠进行PET成像，结果显示NIS阳性的BCMA CAR T细胞在多个器官及骨髓中的分布。此外，从小鼠中分离的骨髓细胞显示OPM-2细胞已成功植入，并且NIS阳性的BCMA CAR T细胞已递送至骨髓。为了获得高质量的灌注CAR T细胞成像，重要的是遵循NIS CAR T细胞生成方案的各个步骤，并确认存在双阳性NIS和CAR细胞组分。

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Research

科研

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Cancer Research

癌症研究

使用[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描对嵌合抗原受体T细胞进行动态成像

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内...

小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

生物正交的逆电子需求Diels-Alder环加成反应已被用于开发一种高效且模块化的预靶向PET成像策略，用于癌症检测。本方案以靶向结直肠癌的抗体huA33和一种64Cu标记的放射性配体构成的模型系统为例，详细描述了该方法的各个步骤。...

利用生物正交逆电子需求狄尔斯-阿尔德环加成反应实现预靶向PET成像

我们介绍一种结合荧光介导断层成像（FMT）与微型计算机断层扫描（µCT）的融合成像方案。在完成图像融合与重建后，进行交互式器官分割，以提取荧光分布的定量测量数据。...

混合 µCT-FMT 成像与图像分析

我们演示了[18F]3F4AP的半自动化放射性化学合成及质量控制步骤。...

自动化的放射化学合成[18F]3F4AP：一种用于成像脱髓鞘疾病的新型PET示踪剂

参与多项早期临床研究试验的正电子发射断层扫描（PET）成像机构需要具备强大且多功能的放射性示踪剂制备能力。以放射性示踪剂[18F]Clofarabine为例，我们阐述如何利用一种灵活的、基于卡匣式放射性合成仪实现放射性示踪剂的自动化合成，并验证该合成方法在临床应用中的可行性。...

自动化正电子发射断层扫描（PET）放射性示踪剂合成方案用于临床生产

用于正电子发射断层扫描的氟-18（18F）标记放射性药物的合成通常需要数月的经验积累。当硅-氟受体（SiFA）结构被引入放射性示踪剂后，可实现一种简便的18F标记方案，该方法无需昂贵设备和前期培训，同时减少了前体用量，并采用更温和的反应条件。...

18F-标记含硅氟受体（SiFA）功能化放射性示踪剂用于正电子发射断层扫描

本文详细介绍了对一种人源特异性抗CD19单克隆抗体进行放射性标记的方法，以及如何利用该标记抗体在多发性硬化小鼠模型中定量中枢神经系统及外周组织中的B细胞 体内 PET成像， 离体...

使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19+ B 细胞

本文描述了一种新型放射性标记探针（即68Ga标记的纳米抗体NM-02）的放射性合成、制剂制备、质量控制，及其在异种移植模型中小动物PET/CT成像中的应用。...

68Ga标记纳米分子的放射性合成、质量控制及小动物正电子发射断层成像

在合成模块上自动化制备用于肿瘤微环境 PET 成像的 [68Ga]Ga-3BP-3940

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动态成像嵌合抗原受体T细胞与[¹⁸F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

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