利用光遗传学多点光刺激在小鼠心脏中实现高级心律管理

心脏纤维性颤动及除颤的物理机制至今尚未完全明确。光遗传学技术可在高度可控的环境中为深入理解心脏现象提供一种有效途径。利用微型发光二极管（micro LED）进行局部光刺激，能够实现对特定心脏组织区域的精准调控。

这种靶向刺激是一种开发心脏温和型抗心律失常治疗新方法的工具。本方案可用于研究心脏在心律失常期间，尤其是心律失常终止过程中的行为。未来，所开发的技术可用于研究更具临床相关性的大型动物模型。

每次实验前，使用完全去离子水清洗所有试管。在室温下，用碳氧混合气体（carbogen）对甲状腺溶液通气30分钟，并用氢氧化钠和盐酸将pH值调节至7.3。使用水加热泵将灌流系统加热至37摄氏度。

通过使用额外的加热元件（如防水加热电缆）来保持水浴中灌注液的温度恒定。将500毫升的每种甲状腺溶液加入相应的储液器中，并通过灌注系统循环甲状腺溶液，以排除管道和气泡捕集器中的空气，直至管道和气泡捕集器中无可见的气泡残留。在整个实验过程中，持续向储液器中的甲状腺溶液通入碳合气（carbogen）进行通气，以确保灌注液的pH值在后续灌注过程中保持稳定。

取出心脏后，在体视显微镜下进行精细制备。将主动脉固定在钝针上，并用缝合材料固定血管。作为对照，通过针头向心脏内注射冰冷的甲状腺溶液，检查心脏是否牢固安装。

将固定好的心脏转移至灌注系统，并确保灌注液持续流动，以便在连接针头与气泡捕获装置时防止空气进入心脏。检查心脏是否已被水浴中的甲状腺溶液覆盖，并确认其在数分钟内开始搏动。将其中一个心电图电极尽可能贴近心脏表面放置，以确保良好的信号质量。

将第二个心电图电极悬置于甲状腺溶液中，并确保正在记录心电图信号。将微 LED 阵列放置于目标区域。更换灌流液为含青霉素和链霉素的低钾甲状腺溶液，并持续灌流心脏 15 至 30 分钟。

为诱导心律失常，使用LED一和LED二以20至50次光脉冲照射心脏，频率为25至35赫兹，脉冲持续时间为2至15毫秒，光强度为2.8毫瓦每平方毫米。重复该过程直至诱导出心律失常。一旦通过视觉观察到持续性心律失常，使用阵列中的3个、6个或9个微LED，以15毫安峰值的脉冲电流施加一组不同脉宽和频率的脉冲序列。

如果在进行五次基于微LED阵列的除颤尝试后心律失常仍持续存在，则将该次尝试归类为失败，并启动备用除颤程序，使用LED一和LED二，保持相同的时序参数。用blebbistatin溶液灌注心脏，并等待机械解耦完成，即心脏停止跳动但心电图信号仍可测得时。将一毫升电压敏感染料4-A-N-B-D-Q-P-Q作为团注注入Langendorff灌流系统的气泡捕集器中，随后等待5至10分钟，使染料均匀分布于整个心脏。

打开 LED 三。将相机对准心脏表面，并施加 1.27 毫瓦每平方毫米的光功率。关闭实验室灯光并开始记录，通过将获得的信号频率与记录的 ECG 频率进行比较，确保正在采集光学信号。

对11只小鼠进行了不同频率、不同微LED数量以及不同脉冲持续时间的一系列实验，结果表明，1至20毫秒的脉冲可实现不同成功率的除颤。当除颤频率为18和20赫兹时，九个LED在脉冲持续时间为1毫秒和20毫秒的情况下，成功率显著提高，该频率接近所有心律失常分析所得的平均心律失常频率22.55赫兹，误差区间为±4.03赫兹。此处展示了两次频率为14赫兹的除颤尝试，及其相应的ECG记录和对应的频谱图。

在一个使用30毫秒脉冲进行除颤的例子中，心律失常的主导频率在光刺激开始前略有上升。心室颤动转变为心室心动过速，其主导频率降至14赫兹，随后除颤未成功，心律再次恢复为主导频率为24赫兹的非节律性活动。在第二个例子中，片段一显示了主导频率为23赫兹的心室心动过速及其谐波成分，直至光刺激开始，刺激脉冲宽度为20毫秒。

第三片段显示了一次成功的终止，恢复为正常窦性心律，其基频为3.5赫兹，并伴有相应的谐波。使用高速摄像机进行光学标测显示，在正常窦性心律期间，心脏单次搏动过程中荧光强度发生变化。灌注时间必须维持所有保持心脏健康的条件，即温度、pH值以及氧化水平需保持恒定。

尤其需要注意的是，甲状腺溶液不得流空，因为系统中的气泡可能对心脏造成损伤。微阵列具有很高的灵活性，您可以在实验中针对心脏的不同部位，甚至组合使用多个阵列，以有效终止心律失常。