Name: DNA张力探针用于绘制免疫细胞的瞬时皮牛顿受体力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 了解DNA发夹张力传感器技术，用于绘制免疫细胞表面瞬时皮牛顿级机械力。该方法通过锁定机制存储短暂力学信号，实现常规荧光显微镜下的高灵敏度定量分析。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01GM131099、NIH R01GM124472以及美国国家科学基金会（NSF）CAREER 1350829的支持。我们感谢NIH四聚体中心提供的pMHC配体。本研究部分由埃默里大学综合糖组学核心设施支持。

OT-1 转基因小鼠饲养于埃默里大学动物资源中心。所有实验均经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照其规程进行。
1. 寡核苷酸制备
<ol>
	<li>将配体链DNA溶解于水（电阻率为18.2 MΩ，整个实验流程均使用该规格水）中。涡旋混匀后，使用台式离心机离心收集溶液。调节加水量，使终浓度为1 mM。使用NanoDrop分光光度计测定260 nm处的吸光度，根据寡核苷酸的消光系数确定最终浓度。 
	注意：配体链在两端均带有修饰基团，5'端为氨基，3'端为生物素，分别用于与荧光染料偶联以及展示生物素化配体。配体链中的氨基需与荧光染料偶联。本实验选用Cy3B染料进行偶联，因其具有高亮度和良好的光稳定性，但该染料通常不直接商业化供应，需自行在实验室完成偶联。因此，下文将描述氨基与NHS酯类染料的偶联方法。对于无法获得核酸修饰相关设备或资源的终端用户，可从提供高亮度、高光稳定性染料（如Alexa和Atto系列染料）的定制DNA合成公司直接购买已修饰的核酸。</li>
	<li>配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）和1 M NaHCO3溶液。取10 µL 1 mM氨基配体链溶液（10 nmol），加入10 µL 10x PBS、10 µL 1 M NaHCO3和60 µL H2O，混匀。在使用前立即用10 µL DMSO溶解50 µg Cy3B NHS酯，并将其加入上述混合液中，总体积为100 µL。Cy3B NHS酯应在最后加入。室温反应1小时，或4 °C过夜反应。</li>
	<li>通过将氨基锁定链与Atto647N NHS酯偶联，制备Atto647N标记的锁定链。配制10x PBS和1 M NaHCO3溶液。取10 µL 1 mM氨基锁定链溶液（10 nmol），加入10 µL 10x PBS、10 µL 1 M NaHCO3和60 µL H2O，混匀。在使用前立即用10 µL DMSO溶解50 µg Atto647N NHS酯，并将其加入上述混合液中，总体积为100 µL。Atto647N NHS酯应在最后加入。室温反应1小时，或4 °C过夜反应。</li>
	<li>反应完成后，使用P2脱盐凝胶过滤法去除副产物、过量染料及盐分。用H2O将反应混合物稀释至总体积300 µL，以适用于后续HPLC纯化步骤。向离心装置中加入650 µL经水充分溶胀的P2凝胶，18,000 x g离心1分钟。弃去装置底部液体，将反应混合物加至含P2凝胶的柱中，18,000 x g离心1分钟，收集装置底部的反应混合物。 
	注意：P2凝胶应在使用前至少用H2O溶胀4小时。</li>
	<li>使用专用于寡核苷酸纯化的C18柱，以反相高效液相色谱（HPLC）对脱盐后的反应混合物进行纯化，流动相A为含0.1 M TEAA的H2O，流动相B为乙腈（ACN），采用线性梯度洗脱（50分钟内B相从10%升至100%），流速为0.5 mL/min。将脱盐后的反应混合物通过500 µL进样环注入反相HPLC系统进行纯化。收集同时在260 nm（DNA吸收峰）、560 nm（Cy3B吸收峰）和647 nm（Atto647N吸收峰）处具有吸收峰的组分，并在真空离心浓缩仪中过夜干燥（见图2A）。</li>
	<li>将干燥的寡核苷酸-染料产物重新溶解于100 µL水中。使用NanoDrop分光光度计测定Cy3B配体链和Atto647N锁定链的浓度。确保染料标记比例接近1:1。在测定寡核苷酸浓度时，如需要，应校正染料在260 nm处的吸光度干扰。</li>
	<li>使用MALDI-TOF质谱法对纯化产物进行验证，基质为3-HPA，溶剂为含0.1% TFA和5 mg/mL柠檬酸铵的50% ACN/H2O，取1–5 µM浓度的产物溶液0.5 µL用于MALDI-TOF-MS样品制备。示例质谱图见图2B。</li>
	<li>将发夹链和淬灭锚定链分别溶解于水中，并确保储备液浓度在50–100 µM之间。 
	注意：发夹链无修饰，可直接由供应商定制合成。锚定链含有硫醇锚定基团和淬灭剂BHQ2，也可直接由供应商定制合成。</li>
	<li>将所有寡核苷酸分装保存。短期使用和储存时，置于4 °C保存；长期储存时，应冷冻并保存于-20 °C。至此，所有寡核苷酸均已准备好用于DNA张力探针的组装。 
	&#8203;注意：反复冻融对寡核苷酸无明显影响。</li>
</ol>
2. 表面准备
注意：DNA发夹张力探针底物的制备需要两天时间。DNA发夹张力探针将被功能化固定在玻璃盖玻片上。
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>将25 mm盖玻片放置在50 mL烧杯中的聚四氟乙烯架上。每个架子最多可容纳8片盖玻片。通过将盖玻片浸入水中三次进行冲洗。</li>
		<li>向装有架子和盖玻片的烧杯中加入40 mL体积比为1:1的乙醇-水混合溶液，并用石蜡膜密封烧杯。</li>
		<li>在超声波清洗器（工作频率35 KHz）中对烧杯进行15分钟的超声处理，以清洁盖玻片。超声处理后，倒掉液体，并用清水至少冲洗烧杯连同架子和盖玻片6次，以去除残留的有机溶剂。</li>
		<li>通过将硫酸与过氧化氢按3:1的比例混合，配制新鲜的Piranha溶液。配制40 mL Piranha溶液时，先向一个洁净的50 mL烧杯中加入30 mL硫酸，然后缓慢加入10 mL H2O2。加入H2O2后，Piranha溶液会迅速发热并产生气泡。使用玻璃移液管末端轻轻混合Piranha溶液。</li>
		<li>接下来，将承载盖玻片的架子转移至含有轻柔混合的Piranha溶液的烧杯中进行蚀刻（图3A）。在室温下让Piranha溶液对盖玻片进行羟基化和清洗，持续30分钟。蚀刻完成后，使用不锈钢或聚四氟乙烯镊子将架子转移至盛有清水的洁净50 mL烧杯中，并再次用清水至少冲洗6次。 
		警告：大量有机物可能与Piranha溶液剧烈反应，甚至引发爆炸。操作时务必小心，并始终在通风橱中使用Piranha溶液。确保穿戴实验服、手套和护目镜。切勿将新鲜Piranha溶液储存在密闭容器中。 
		注意：过氧化氢与硫酸的体积比应保持在1:2以下，绝不可超过1:1。将带有盖玻片的架子浸入Piranha溶液时，应缓慢且小心地放入。蚀刻后切勿立即丢弃溶液，因其仍具活性且高温。应在烧杯中静置过夜后再倒入酸性废液容器中。</li>
		<li>将承载盖玻片的架子浸入含40 mL乙醇的50 mL烧杯中以去除水分。倒掉乙醇并重复此步骤3次，确保水分完全去除。</li>
		<li>然后将架子浸入含3%氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（v/v）的40 mL乙醇溶液中，在室温下反应1小时，使APTES与盖玻片表面的-OH基团反应（图3B）。 
		注意：乙醇可用丙酮替代。</li>
		<li>将表面浸入40 mL乙醇中冲洗6次，然后在80 °C烘箱中干燥20分钟。冷却后，将干燥的胺基修饰盖玻片储存于-20 °C，以备后续使用（最长可达6个月）。</li>
		<li>用石蜡膜覆盖直径为10 cm的塑料培养皿底部内侧。石蜡膜可防止盖玻片在培养皿内滑动，并有助于在后续功能化步骤中使溶液保留在盖玻片上。将冷却后的胺基修饰盖玻片放入培养皿中，待功能化的面应朝上。</li>
		<li>为修饰盖玻片上的胺基，向每片盖玻片上加入300 µL含0.5% w/v硫辛酸-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯（LA-PEG-SC）和2.5% w/v甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯（mPEG-SC）的0.1 M NaHCO3溶液，并在室温下孵育1小时（图3C）。对于每片25 mm盖玻片，称取1.5 mg LA-PEG-SC和7.5 mg mPEG-SC。NHS试剂应在加入表面之前立即溶解，因其在室温水溶液中的半衰期较短（约10分钟）。反应完成后，用清水冲洗表面3次。 
		注意：NHS反应也可在4 °C下过夜进行。在4 °C时，NHS试剂在水解前的半衰期更长，约为4–6小时。这将导致整个表面制备过程延长至三天。</li>
		<li>向一组&#34;三明治&#34;结构的盖玻片（两片盖玻片相对放置，中间夹有反应缓冲液）中加入100 µL含1 mg/mL磺基-NHS乙酸盐的0.1 M NaHCO3溶液。让钝化反应至少进行30分钟。为节省试剂，此步骤也可使用50 µL含1 mg/mL磺基-NHS乙酸盐的溶液完成。钝化后用清水冲洗三次。</li>
		<li>向每片盖玻片加入0.5 mL金纳米颗粒（AuNP，8.8 nm，单宁酸，0.05 mg/mL），并在室温下孵育30分钟（图3D）。为节省试剂，此步骤也可通过将两片盖玻片制成三明治结构完成。确保体系中不含前步残留的盐分，以避免金纳米颗粒聚集。此步骤后切勿让盖玻片干燥。</li>
		<li>同时，在PCR管中以1.1:1:1的比例于1 M NaCl中预杂交4.7 pN发夹结构、Cy3B配体链和BHQ2锚定链，形成DNA张力探针构建体，总浓度为300 nM。在热循环仪中将溶液加热至95 °C持续5分钟，然后在30分钟内逐渐降温至20 °C，使各链退火。</li>
		<li>与金纳米颗粒孵育30分钟后，用清水冲洗盖玻片三次。向退火后的DNA溶液中加入额外的BHQ2锚定链（来自100 µM储备液），使BHQ2锚定链与Cy3B配体链的比例达到10:1。此时，DNA溶液中应含有300 nM张力探针构建体和2.7 µM BHQ2链。每两片盖玻片加入100 µL溶液，形成&#34;三明治&#34;结构（图3E）。</li>
		<li>小心地在培养皿中（远离盖玻片处）放置一个湿润的实验纸球，并用石蜡膜密封培养皿，防止溶液蒸发。用铝箔覆盖培养皿，并在4 °C下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>用1x PBS洗去盖玻片上多余的探针。在落射荧光显微镜下检查DNA张力探针表面的质量。</li>
		<li>在1x PBS中配制40 µg/mL链霉亲和素溶液，并在室温下孵育30分钟（图3F）。通常，每片25 mm盖玻片使用100 µL即可。孵育后用PBS冲洗三次，以去除多余的链霉亲和素。</li>
		<li>在1x PBS中配制40 µg/mL生物素化抗体/配体溶液。每三明治结构加入50–100 µL，并在室温下孵育30分钟（图3G）。孵育后用PBS冲洗三次，以去除多余的生物素化抗体/配体。</li>
		<li>小心组装洁净的成像腔室。拧紧腔室时盖玻片容易破裂。向成像腔室中加入0.5–1 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS），并准备好用于细胞成像（图3H）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像细胞受体受力
<ol>
	<li>将目标免疫细胞在HBSS中配制成浓度为1-2 x 10⁶个/mL6 cells/mL 
	注意：本文以OT-1 CD8+ 初始细胞为例。纯化OT-1 CD8+ 从处死小鼠的脾脏中使用MACS小鼠CD8分选 naïve T细胞+ 使用T细胞分离试剂盒配合MACS分选仪，按照制造商说明书操作。分离并富集CD8+ 通过去除非CD8细胞来分离T细胞+ 与磁性耗竭抗体混合物结合的T细胞。将纯化的OT-1 CD8+初始T细胞重悬于HBSS中，浓度为2 × 106 细胞/mL，并在使用前置于冰上保存。</li>
	<li>在添加配体或接种细胞之前，使用荧光显微镜（100倍物镜）检查DNA发夹张力探针表面的质量，以进行质量控制。从DNA发夹张力探针表面至少5个不同位置及3个重复样本中，采集Cy3B通道的图像并量化平均背景强度。保持成像采集条件一致，以便该数值可作为表面质量和探针密度的可靠指标。图 4C). 
	注意：量化每粒金纳米颗粒上的DNA链数量，以及每微米（µm）上的金纳米颗粒数量2 根据文献记载的最初几次表面处理12，可作为表面质量的另一个可靠指标。</li>
	<li>接种约 4 x 104 - 10 x 104 将细胞接种至每张DNA张力探针功能化的盖玻片上，在室温下孵育约15分钟，使其贴壁并铺展。</li>
	<li>当细胞接种到DNA发夹张力探针上并开始铺展时，使用100倍物镜在Cy3B通道中成像所产生的荧光信号图3I).</li>
	<li>当细胞开始在DNA发夹张力探针表面的Cy3B通道中产生实时张力信号时，在Cy3B和Atto647N通道中同时采集图像（全内反射荧光显微镜的信噪比优于落射荧光显微镜）。随后，向成像腔室中加入Atto647N标记的寡核苷酸链，终浓度为200 nM，以实现机械选择性杂交。</li>
	<li>孵育10分钟后，迅速而轻柔地移除含有荧光Atto647N封闭链的缓冲液，并替换为新鲜的Hank's平衡盐溶液。再次在Cy3B和Atto647N通道中成像，并使用Fiji软件计算Pearson相关系数。15.</li>
	<li>在需要检测的时间点，向成像腔室中的细胞加入非荧光锁定链，以储存张力信号。配制锁定链储备液（100 µM），将其加入细胞中，终浓度为 1 µM。轻柔吹打混匀。锁定时间可有所变化，但建议时长为 10 分钟。</li>
	<li>根据需要，在落射荧光显微镜下获取延时录像或终点图像，用于定性张力图谱分析和定量分析图 3J 和 图5). 
	&#8203;注意：若需在多个时间点测量张力，可通过加入解锁链来启动存储张力信号的清除。为避免过度清洗，使用终浓度为 2 µM 的解锁链，与锁定链发生持续 3 分钟的由黏性末端介导的链置换反应，从而清除存储的信号（图3J）。用HBSS轻轻冲洗掉多余的寡核苷酸。DNA发夹张力探针表面和细胞即可进行下一轮张力储存与定位。若研究仅关注单一时间点，则无需解锁张力信号。</li>
</ol>
4. 数据分析
注意：图像分析使用 Fiji 软件进行，定量分析使用分析软件进行。
<ol>
	<li>在 Plugins 菜单下的 Registration 中使用 Correct 3D drift 命令校正图像采集过程中的漂移。</li>
	<li>在 Process 菜单下使用 Subtract 命令去除图像的相机背景。</li>
	<li>在 Analyze 菜单下使用 Colocalization 功能计算 Pearson 相关系数。</li>
	<li>对三个不同局部背景区域中未打开探针产生的荧光背景取平均并扣除。使用 Image J 的 Freehand Selections 工具在背景扣除后的图像或 RICM（反射干涉对比显微镜）图像上绘制细胞的感兴趣区域（ROI）。在 Analyze 菜单下使用 Measure 工具测量 ROI 的任意感兴趣参数，例如总荧光强度和张力占据率（图 6）。</li>
	<li>将测量结果导出至分析软件进行定量分析。</li>
	<li>使用任意分析软件绘制数据图表。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

通过本文提供的详细步骤，可制备DNA发夹张力探针底物，用于绘制和量化免疫细胞产生的受体张力。当细胞接种到DNA发夹张力探针底物上时，受体会同时从化学和机械层面感知配体，细胞随之着陆、附着并铺展，其中机械信号由我们的探针检测。然而，在某些情况下，细胞可能无法铺展（图7A）或无法产生张力信号。这通常是表面化学问题所致，需要进行故障排查（Table 1）。配体密度偏低是导致细胞无法铺展最常见的原因之一。这可能由多种因素引起，例如配体降解、DNA链降解、APTES和/或LA-PEG-NHS等试剂水解、金纳米颗粒聚集，或玻璃盖玻片清洁不充分。通过比较成功实验与失败实验中底物的背景荧光强度（图7B），可快速判断问题来源。例如，背景测量中出现强荧光信号表明DNA探针的固定已成功；而背景信号弱则提示在加入链霉亲和素和生物素化配体之前的制备步骤存在问题。若问题源于配体，可通过将其以10 µg/mL浓度包被在玻璃载片或96孔板孔中，检测细胞黏附情况来评估其质量。这对于pMHC配体和抗CD3抗体而言是一种有...

免疫细胞通过持续爬行并扫描靶细胞表面的抗原以抵御病原体和癌细胞，这些抗原散布在细胞表面1,2。当T细胞受体（TCR）与靶细胞表面表达的肽-主要组织相容性复合物（pMHC）结合时，即启动抗原识别过程。由于TCR与pMHC的识别发生在两个可移动细胞之间的接触界面上，长期以来人们推测该过程会受到机械力的影响。此外，这促使了TCR激活的力学感受模型的提出，该模型认为TCR所受的机械力有助于其功能发挥3,4。为了理解机械力在何时、何地以及如何影响T细胞功能，迫切需要开发能够可视化T细胞传递的分子水平机械力的工具。传统上，牵引力显微镜（TFM）和微柱阵列被用于研究细胞层面的力学作用5,6。然而，TFM和微柱阵列的力敏感度处于纳牛顿（nN）量级，通常不足以研究细胞受体传递的皮牛顿（pN）级别的分子力7。为了提高检测的力分辨率和空间分辨率，我们实验室率先开发了分子张力探针，最初使用聚乙二醇（PEG）聚合物合成7。分子张力探针由一个可伸展的分子“弹簧”（如PEG、蛋白质或DNA）构成，其两端分别连接荧光团和淬灭剂，并锚定于表面。当外力作用于探针末端时，会导致其伸展，从而使荧光团与淬灭剂分离，进而产生强烈的荧光信号（图1A）8,9,10。
在过去十年中，我们开发了一系列不同类型的分子张力探针，其弹簧元件分别由核酸11、蛋白质10和聚合物8构成。其中，基于DNA的张力探针具有最高的信噪比和最佳的力敏感性，其响应范围可轻松调节，从几皮牛（pN）至约20 pN11。我们已利用这些实时DNA张力探针研究了多种不同类型细胞产生的分子力，包括成纤维细胞、癌细胞、血小板以及免疫细胞11,12,13。本文将详细描述在表面合成并组装DNA张力探针的实验方案，以利用常规荧光显微镜在皮牛（pN）级力分辨率下绘制分子受体所受的力学图谱。尽管当前方案包含对核酸进行化学修饰以引入荧光报告基团的步骤（图1B），但需注意的是，许多修饰与纯化步骤均可外包给定制DNA合成公司完成。因此，DNA张力探针技术操作简便，易于被更广泛的细胞生物学与力学生物学研究领域所采用。
简而言之，DNA张力传感器的组装过程如下：将一个DNA发夹结构的一端与荧光配体链杂交，另一端与淬灭锚定链杂交，然后将其固定在玻璃基底上（图1C，实时张力）。在无机械力作用时，发夹结构处于闭合状态，因此荧光被淬灭；然而，当施加的机械力超过F1/2（即达到50%解折叠概率的平衡力）时，发夹结构发生力学熔解，从而产生荧光信号。
在实时DNA张力传感器的基础上，我们还描述了绘制累积力图谱的实验方案，这对于研究免疫细胞表面受体与其天然配体之间的相互作用尤其有用，因为免疫受体通常形成寿命较短的结合键3,14。累积力的成像依赖于一条“锁定”链，该链优先结合处于打开状态的DNA发夹结构，从而储存与机械拉伸事件相关的荧光信号（图1C，锁定张力）。该锁定链可结合在发夹结构因机械力诱导解链后暴露出来的一个隐蔽结合位点，并通过阻止发夹重新折叠而将其锁定在打开状态，进而储存张力信号，生成累积张力图谱。此外，锁定链设计包含一个八核苷酸的“趾端”（toehold），可与其完全互补的“解锁”链发生趾端介导的链置换反应。加入解锁链后，与发夹结合的锁定链将被置换脱离，从而清除储存的张力信号，并将发夹结构重置回实时检测状态。
<img alt="分子张力实验示意图，包含配体-受体、荧光淬灭和链锁定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：先进分子张力探针的示意图。（A）实时分子张力探针的一般设计，（B）基于DNA的张力探针结构的链段，以及（C）工程化的基于DNA的张力探针及其在实时状态与锁定状态之间的切换。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
主要实验方案包括四个主要部分：寡核苷酸制备、表面制备、成像和数据分析。本方案已在初始态和激活态的OT-1 CD8+ T细胞、OT-II CD4+细胞以及杂交瘤细胞中成功实施，可用于研究不同的免疫细胞受体，包括T细胞受体、程序性细胞死亡受体（PD1）和淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）所受的力学作用。本文以OT-1 CD8+初始T细胞作为示例细胞系。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;3-羟基吡啶酸（3-HPA）</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）基质</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;mPEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>MF001023-2K</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Acros</td><td>AC430941000</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>10× 红细胞裂解缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>00-4333-57</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>8.8 nm 金纳米颗粒，单宁酸</td><td>Nanocomposix</td><td>定制订单</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>Atto647N NHS 酯</td><td>Sigma</td><td>18373-1MG-F</td><td>荧光染料，寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Attofluor 细胞培养皿（用于显微镜）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>成像</td></tr><tr><td>BD 注射器（仅限 Luer-Lok 接头）</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>细胞</td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 CD3e 抗体</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>抗体/配体</td></tr><tr><td>生物素标记 pMHC 卵清蛋白（SIINFEKL）</td><td>埃默里大学 NIH 四聚体核心设施</td><td>NA</td><td>抗体/配体</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>735078001</td><td>封闭非特异性相互作用</td></tr><tr><td>细胞滤筛</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>细胞</td></tr><tr><td>盖玻片迷你架（聚四氟乙烯材质）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>Cy3B NHS 酯</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>荧光染料，寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>Midi MACS（LS）启动试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>细胞</td></tr><tr><td>小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>细胞</td></tr><tr><td>Nanosep MF 离心装置</td><td>Pall laboratory</td><td>ODM02C35</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>2 号圆形玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>N475-10</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>P2 凝胶</td><td>Bio-rad</td><td>1504118</td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>SX1244-6</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>乙酸磺基-NHS 酯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td>表面处理</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio 寡核苷酸 C18 色谱柱，4.6 × 150 mm，2.7 &amp;mu;m</td><td>653950-702</td><td></td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure 水纯化系统</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>水</td></tr><tr><td>CFI Apo 100&amp;times; NA 1.49 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Cy5 滤光立方体</td><td>CHROMA</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>evolve 电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）</td><td>Photometrics</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>高效液相色谱仪</td><td>Agilent 1100</td><td></td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Intensilight 正置荧光光源</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）</td><td>Voyager STR</td><td></td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>寡核苷酸制备</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Nikon 完美聚焦系统</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>四通道 TIRF 405/488/561/647 滤光立方体</td><td>CHROMA</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>RICM 滤光立方体</td><td>CHROMA</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>TIRF 激光发射器（488 nm（50 mW）、561 nm（50 mW）和 640 nm）</td><td>Coherent</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>TRITC 滤光立方体</td><td>CHROMA</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;寡核苷酸名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰 / 3' 修饰&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;序列（5' 至 3'）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;用途&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>15 个碱基的胺修饰锁定链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>锁定实时张力信号</td></tr><tr><td>15 个碱基的 Atto647N 标记锁定链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; Atto647N&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>锁定实时张力信号</td></tr><tr><td>15 个碱基的非荧光锁定链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰</td><td>A AAA AAC ATT TAT AC</td><td>用于定量分析的锁定实时张力信号</td></tr><tr><td>4.7 pN 发夹链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT&lt;br/&gt; TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT&lt;br/&gt; ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC&lt;br/&gt; CAGC</td><td>发夹探针</td></tr><tr><td>胺修饰配体链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; /5AmMC6/&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>发夹探针</td></tr><tr><td>BHQ2 锚定链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; /5ThiolMC6-D/&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; /3BHQ_2/</td><td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;发夹探针</td></tr><tr><td>Cy3B 标记配体链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; Cy3B&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>发夹探针</td></tr><tr><td>解锁链</td><td>&lt;strong&gt;5' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;3' 修饰：&lt;/strong&gt; 无修饰</td><td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td><td>解锁累积张力信号</td></tr></tbody></table>

用于绘制免疫细胞瞬时皮牛顿受体力的dna张力探针

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

相邻细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的连接处所传递的机械力，在调控从发育到免疫学等多种生物学过程方面至关重要。因此，开发能够在分子尺度上研究这些力的工具具有重要意义。我们课题组开发了一系列分子张力传感器，用于定量和可视化细胞产生并传递至特定配体的力学信号。其中最灵敏的一类分子张力传感器由核酸茎环发夹结构组成。这类传感器利用荧光团-淬灭剂对来报告在受力条件下DNA发夹结构的机械拉伸与展开状态。DNA发夹张力传感器的一个挑战在于其可逆性：当张力解除后，发夹结构会迅速重新折叠，因此难以记录短暂的力学事件。本文中，我们描述了制备可“锁定”DNA张力传感器的实验方案，使其无法重新折叠，从而实现机械信息的“存储”。该方法能够记录高度瞬时的皮牛顿级力学信号，并可通过添加互补核酸链解除锁定，实现机械信息的“擦除”。这种在实时张力成像与机械信息存储之间切换的能力，有助于揭示T细胞在执行免疫功能过程中常见的微弱、短暂且丰度较低的力学信号。

此处展示了代表性的表面质量控制图像（图4）。高质量的表面在RICM通道中应具有干净的背景（图4B），在Cy3B通道中应呈现均匀的荧光强度（图4C）。使用相同的成像设备和完全一致的荧光成像采集条件时，每次使用DNA探针进行实验所获得的背景荧光强度应保持一致且可重复。我们建议在每组独立实验前，将其作为表面质量控制的指标。
在本文中，我们展示了一些代表性数据（图5) 与OT-1初始CD8+ 细胞作为一种模型细胞类型，可特异性识别鸡卵清蛋白。实验中包含CD3ε抗体作为系统的阳性对照，并以同源抗原pMHC N4（SIINFEKL）为例进行说明。细胞接种于功能化基底上，该基底修饰有4.7 pN的DNA发夹探针，探针呈现抗CD3ε抗体或pMHC N4。30分钟后，通过反射干涉对比显微镜（RICM）记录细胞铺展情况，并在Cy3B通道中实时捕...

本文介绍了一种利用基于DNA的张力探针成像免疫细胞受体受力的详细实验方案。该方法可绘制受体受力图谱 &gt;4.7 pN 的实时力，并能对力进行时间上的积分。

用于绘制免疫细胞瞬时皮牛顿受体力的DNA张力探针

细胞间以及细胞与细胞外基质之间连接处传递的机械力至关重要……

本方案提供了一种用于绘制细胞特别是免疫细胞所产生的分子力的方法。该方案对于致力于研究力学生物学中机械转导现象的实验室至关重要。该技术的主要优势在于操作极为简便，并且能够利用常规荧光显微镜对永生化细胞和原代细胞中的力传递进行定量分析。首先，将25毫米的盖玻片放置在50毫升烧杯中的聚四氟乙烯架上，并通过将盖玻片浸入水中清洗三次。混合等体积的乙醇和水，取40毫升该溶液加入含有支架和盖玻片的烧杯中。然后，使用封口膜密封烧杯。将烧杯放入超声波清洗器中，超声处理15分钟以清洗盖玻片，超声结束后弃去液体。随后，用去离子水至少冲洗六次装有支架和盖玻片的烧杯，以去除残留的有机溶剂。配制新鲜的piranha溶液时，向一个50毫升的烧杯中加入30毫升浓硫酸，再缓慢加入10毫升过氧化氢。使用玻璃移液管末端轻轻混合piranha溶液。为开始蚀刻，将承载盖玻片的支架转移至盛有piranha溶液的烧杯中，在室温下孵育30分钟，以清洁并羟基化盖玻片。随后，使用钢制或聚四氟乙烯镊子将支架转移至一个洁净的50毫升烧杯中，并用水冲洗六次。为了彻底去除水分，将承载盖玻片的支架浸入含有40毫升乙醇的50毫升烧杯中。然后弃去乙醇。接着，将支架浸入40毫升含3%氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中，在室温下反应一小时，以启动与盖玻片表面羟基的反应。将盖玻片浸入40毫升乙醇中，清洗六次，并在80摄氏度的烘箱中干燥20分钟。用帕拉膜（parafilm）覆盖培养皿内底部，以防止盖玻片在培养皿内滑动。然后将带有氨基的盖玻片放置好，使需用DNA张力探针功能化的面朝上。将盖玻片在 20 摄氏度下覆盖保存，以备后续使用。为了修饰盖玻片上的氨基，加入硫辛酸 PEG NHS 和 mPEG NHS，并在室温下孵育培养皿 1 小时。孵育结束后，用纯水冲洗表面三次。随后，向一组三明治式盖玻片中加入 100 微升含有 1 毫克/毫升 Sulfo-NHS-乙酸酯的 0.1 摩尔碳酸氢钠溶液，在室温下孵育 30 分钟以实现钝化。向每张盖玻片中加入 0.5 毫升金纳米颗粒，于室温孵育 30 分钟。孵育结束后，用纯水冲洗盖玻片三次。将Black Hole Quencher 2链以10:1的比例加入退火的DNA张力探针后，每两张盖玻片加入100微升混合液以形成三明治结构。将湿润的实验用纸球小心放置于培养皿中远离盖玻片的位置，并用封口膜密封培养皿，防止溶液干燥。随后，用铝箔包裹培养皿，并在4摄氏度下孵育过夜。第二天，组装成像室，注意在拧紧室体时防止表面开裂。然后，向成像室中加入 0.5 至 1 毫升的亨克氏平衡盐溶液。使用 Cy3B 通道和 100 倍物镜，在细胞铺展到 DNA 发夹张力探针上并开始伸展时，捕获其荧光信号。配制100微摩尔非荧光锁定链储备液后，在所需时间点将其加入成像腔室中的细胞，终浓度为1微摩尔，并通过移液混匀以储存张力信号。

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DNA张力探针用于绘制免疫细胞的瞬时皮牛顿受体力

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。...

探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

在本视频中，使用生物膜力探针（BFPs）来测量受体与配体之间的相互作用力。该技术通过监测破坏探针微球上偶联的pMHC与靶细胞上的TCR之间结合所需的压强，从而检测分子间的相互作用。...

生物膜力探针定量受体-配体相互作用

该视频展示了一种利用聚乙二醇锚定的金纳米颗粒和DNA发夹张力探针来评估免疫细胞施加的受体力的方法。CD8阳性T细胞的相互作用会触发探针的展开，从而发出荧光，而锁定链则维持信号，用于量化免疫细胞施加的力。...

利用基于DNA的张力探针评估免疫细胞施加的受体作用力

我们通过在轴突膜上附着的光镊探针同时进行力谱测量，检测了使用激光显微切割仪部分损伤的轴突中的张力释放。该实验方案用于评估轴突与培养基底之间的黏附性。...

利用激光诱导轴突损伤过程中张力释放的测量，在皮牛顿和毫秒分辨率下评估轴突与基底的黏附力

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。...

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。...

使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。...

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

整合素张力在多种细胞功能中发挥重要作用。利用一种整合式张力传感器，可对整合素张力进行皮牛顿（pN）级灵敏度的校准，并以亚微米分辨率成像。...

以整合型张力传感器实现亚微米分辨率的整合素张力与细胞力成像

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

该方法通过检测细胞断裂固定化配体呈递DNA双链的倾向性，以报告细胞相对牵引力。断裂的荧光寡核苷酸被递送至细胞内，并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的力学历史。该技术可实现细胞力生成的高通量测量，适用于细胞力学表型分析。...

基于DNA张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

了解DNA发夹张力传感器技术，用于绘制免疫细胞表面瞬时皮牛顿级机械力。该方法通过锁定机制存储短暂力学信号，实现常规荧光显微镜下的高灵敏度定量分析。

用于绘制免疫细胞瞬时皮牛顿受体力的DNA张力探针

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