Name: 优化低温电子断层扫描数据采集策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解如何使用SerialEM和PyEM自动化低温电子断层扫描数据采集流程，实现网格映射、目标选择与倾斜序列采集，显著提升显微镜时间利用效率并减少人工干预。

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我们感谢德国海德堡欧洲分子生物学实验室的结构与计算生物学单元以及电子显微镜核心设施提供的支持，以及iNEXT-Discovery（项目编号871037）的资助。我们非常感谢SerialEM软件包作者David Mastronarde教授提供的出色技术支持。同时感谢Herman Fung对稿件的审阅。

本文所述方案是欧洲分子生物学实验室（EMBL）冷冻电镜服务平台编制的一份更全面文档的组成部分，该文档包含典型的冷冻电子断层扫描（cryoET）实验全过程的详细分步说明和截图，涵盖样品加载、载网成像、显微镜调校、采集位点设置以及自动化数据收集等步骤。完整方案可通过以下链接下载：https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. 先决条件
<ol>
	<li>安装 SerialEM 3.8 版本，并设置以控制显微镜和探测器（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm）。</li>
	<li>安装一个 SerialEM 3.8 版本的虚拟实例（https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html）。</li>
	<li>安装 PyEM（https://git.embl.de/schorb/pyem）。</li>
</ol>
2. 网格作图
<ol>
	<li>将载有载网的盒式样品架装入显微镜自动进样器中。</li>
	<li>设置适用于对整个载网进行成像的条件。在考虑所用探测器视野（EFTEM SA 2250x）的前提下，尽可能使用最低放大倍数进行设置。将成像条件保存为 SerialEM Imaging State，以便后续使用时更加便捷。</li>
	<li>设置完整拼图
	<ol>
		<li>打开 SerialEM Navigator 菜单。</li>
		<li>选择 Montaging &amp;#38; Grids。</li>
		<li>选择 Set up Full Montage。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动脚本 Grid_Mapping。允许脚本等待自动进样器冷却；执行样品清点，然后对清点过程中发现的每个载网进行成像。通过 Tilt Series Menu 输入电子邮件地址，以便脚本在完成时自动发送通知邮件。</li>
	<li>保存 Navigator。</li>
	<li>在 SerialEM Navigator 中检查所有载网图谱，并选择需在更高放大倍数下进一步成像的载网。 
	注意：许多配备自动进样器系统的透射电子显微镜在重新加载样品时会出现载网旋转现象。建议在重新加载后对载网重新成像。其他系统通常仅出现轻微位移，可在 SerialEM 中通过 Shift To Marker 程序进行校正。</li>
</ol>
3. 设置 SerialEM 低剂量模式
<ol>
	<li>设置 SerialEM 低剂量观察和预览模式的放大倍数（此步骤为第6步所必需）。</li>
	<li>获取一幅观察图像，并将其作为地图保存在导航器中。</li>
	<li>获取一幅预览图像，并将其作为地图保存在导航器中。
	<ol>
		<li>将两种模式设置为相同的 binning（建议使用 binning 4）。这允许将两张地图保存为一个图像堆栈。</li>
		<li>在 SerialEM 导航器窗口中，将观察地图的标签更改为观察，将预览地图的标签更改为预览。</li>
		<li>保存并关闭导航器文件。 
		注意：初始的观察和预览图像无需设置目标区域，PyEM 仅会使用其成像参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 网格方格定位
<ol>
	<li>设置成像条件以绘制网格方格图。必须能够同时观察到目标样本和定位标记微珠的分布。为确保网格方格图具有最佳对比度，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>插入物镜光阑。</li>
		<li>如适用，插入能量过滤器狭缝。</li>
		<li>使用 -100 µm 的欠焦量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在网格图中筛选适合进一步成像的优质方格。在目视检查网格图中的各个方格后，使用将用于网格方格图的成像条件拍摄该方格的测试图像。</li>
	<li>当确定一个优质方格后，使用 SerialEM Navigator 中的 添加点 功能在网格图图像中标记其中心位置。</li>
	<li>所有点添加完成后，在 SerialEM Navigator 中先对第一个点按下 Shift + A，然后对最后一个点按下 Shift + A。 
	注意：所有已添加的点现在均被标记为 A，表示它们均为采集点。</li>
	<li>在第一个点上按下 Shift + N（在项目处创建新文件），然后在最后一个点上再次按下该组合键。在弹出的对话框中，选择 拼接图像。</li>
	<li>当拼接图像对话框弹出时，设置拼接范围以覆盖一个完整的网格方格。具体尺寸取决于所用放大倍数和网格的孔径大小，通常需要 2 × 2 至 4 × 4 的拼接阵列。为文件命名并添加编号（例如 squaremap_01.mrc），以便 SerialEM 能够按网格方格自动编号所有文件。</li>
	<li>通过打开 SerialEM 的 Navigator 菜单并点击 在项目处采集，开始网格绘图。</li>
	<li>在弹出菜单中，选择以下选项。
	<ol>
		<li>选择 粗略同心度校正。</li>
		<li>选择 采集地图图像。</li>
		<li>选择 结束时关闭镜筒阀门。</li>
		<li>选择 结束时发送电子邮件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 选择靶标
<ol>
	<li>打开一个虚拟的 SerialEM 实例。该实例可以设置在控制显微镜的 SerialEM 计算机上，也可以设置在另一台（支持）计算机上，前提是两台计算机共享网络连接。</li>
	<li>当第一个网格区域完成成像后，使用 SerialEM Navigator 菜单中的 合并 选项，在虚拟的 SerialEM 实例中查看拼接图像。</li>
	<li>双击 Navigator 窗口以打开网格区域地图。</li>
	<li>在地图中查找目标区域，并使用虚拟 SerialEM Navigator 的 添加点 选项，在感兴趣的目标区域上添加图像采集点。</li>
	<li>完成操作后，若已对新区域进行成像，请保存 Navigator 文件并再次合并 Navigator；重复此过程，直至所有网格区域均完成成像。</li>
</ol>
6. 生成虚拟图谱
<ol>
	<li>再次将导航器文件与虚拟的 SerialEM 实例合并。</li>
	<li>从虚拟 SerialEM 菜单的 工具 中运行 PyEM 虚拟地图 脚本，并选择 虚拟锚定地图。根据网格方块图的数量、大小以及观察图和预览图的 binning 情况，此过程可能需要一定时间。 
	注意：PyEM 会启动一个命令窗口，在处理完成后该窗口将自动关闭，随后即可打开新的导航器文件。对于每个包含选定点的拼接图，PyEM 将生成一张合并后的地图及其所有观察图和预览图。最后，它将生成一个名为 &#60;navigatorfilename&#62;_automaps.nav 的新导航器文件。</li>
</ol>
7. 显微镜调校
<ol>
	<li>检查显微镜调校。为确保显微镜性能正常，请按以下顺序使用相同的放大倍数和束斑尺寸设置进行数据采集：
	<ol>
		<li>运行 SerialEM 的 基于CTF的无彗差对中（Zemlin 表格法）。</li>
		<li>插入并居中物镜光阑。</li>
		<li>运行 SerialEM 的 基于CTF校正像散（自动消像散）。</li>
		<li>运行 GIF Quick Tune（即仅进行狭缝聚焦）。 
		&#8203;注意：由于步骤 7.1.1、7.1.3 和 7.1.4 可能需要更高的剂量率，此时仅应改变光斑尺寸；不应改变束斑尺寸，因为这会导致电子束倾斜，从而使调校结果不准确。步骤 7.1.1、7.1.2 和 7.1.3&#160;已在此公开可用的脚本中实现半自动化（https://serialemscripts.nexperion.net/script/47）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 设置导航器
<ol>
	<li>在 SerialEM 中，打开名为 &#60;navigatorfilename&#62;_automaps.nav 的新导航器文件。 
	注意：V_yyyy&#160;为视图图谱，P_yyyy&#160;为预览图谱。预览图谱被设置为采集点。</li>
	<li>在 SerialEM 导航器窗口中，取消选中所有 A 点，选择第一个 V_yyyy&#160;图谱，点击 折叠（Collapse），然后连续点击 A 两次，再取消选中 折叠（Collapse）。</li>
	<li>选择第一个 V_yyyy 位置，按下 Shift + T，然后选择最后一个 V_yyyy 位置，再次按下 Shift + T。</li>
	<li>在打开文件对话框的属性中，选择 单帧图像（Single Frame Images）。</li>
	<li>在接下来的文件属性对话框中，根据成像需求和仪器设置选择所需的参数。</li>
	<li>当系统提示时，输入带编号的文件名（例如 TS_001.mrc），然后点击 保存（Save）。 
	注意：SerialEM 将自动为所有倾斜系列图像编号。</li>
	<li>为第一个倾斜系列（TS）位置设置倾斜系列控制器。完成后，点击 确定（OK），以将这些参数应用于此后所有倾斜系列采集项。所有预览图谱现在均被选为 TS（倾斜系列），并分配编号文件名 TS_xxx.mrc。 
	注意：用户可稍后使用导航器中的 TSparams 功能手动更改参数；更改将应用于列表中其下方的所有项目。用户也可选择运行自定义脚本，而非执行倾斜系列采集。</li>
</ol>
9. 设置焦平面/轨迹位置
<ol>
	<li>如有需要，为每个目标设置聚焦/跟踪距离（确保已开启 SerialEM 的低剂量模式）。</li>
	<li>双击视图图谱以加载该图谱。</li>
	<li>在导航器列表中选择预览图谱。</li>
	<li>在导航器窗口中选择编辑聚焦。</li>
	<li>在低剂量控制面板中，取消选中旋转区域间轴，以使试拍和聚焦沿样品台倾斜轴方向定位。</li>
	<li>在已加载的视图图谱中单击所需区域，以设置本次倾斜系列的聚焦/跟踪位置。</li>
	<li>确保导航器项目现在已设置为TSP；对所有项目重复此操作。 
	&#8203;注：聚焦/跟踪位置会在导航器中自动向下复制。因此，若前一个项目的聚焦/跟踪位置已在正确的一侧且距离正确，则当前项目无需更改。</li>
</ol>
10. 设置附加脚本
<ol>
	<li>有两个脚本用于处理聚焦范围：pretomo 和 duringtomo。pretomo 脚本在每次倾斜系列采集前运行，而 duringtomo 脚本在每次倾斜过程中运行。</li>
	<li>在 pretomo 脚本中编辑聚焦范围。</li>
	<li>在 SerialEM 倾斜系列菜单中，勾选 Run Script in TS，并选择 duringtomo 脚本的脚本编号。</li>
</ol>
11. 运行
<ol>
	<li>检查氮气罐液位。</li>
	<li>确认已选择自动进样器涡轮关闭（Autoloader turbo off）。</li>
	<li>检查数据存储的可用空间。</li>
	<li>在 SerialEM 的文件菜单中，取消勾选日志文件的连续保存选项，并关闭任何当前打开的日志文件。每个倾斜系列将生成独立的日志文件。</li>
	<li>在导航器菜单中，点击 在项目处采集（Acquire at Items）。</li>
	<li>运行脚本 PreTomo。</li>
	<li>选择 主任务：采集倾斜系列（Primary task Acquire tilt series）。</li>
	<li>选择 采集后运行脚本（Run script after PostTomo）。</li>
	<li>选择 结束时关闭镜筒阀门（Close column valves at end）。</li>
	<li>选择 结束时发送电子邮件（Send email at end）。</li>
	<li>点击 开始（GO）。 
	注意：SerialEM 将为每个倾斜系列发送一封电子邮件，无论成功或出现错误；然而，错误也可能意味着未达到完整的倾斜范围。</li>
</ol>

<ol><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li>
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<li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structural+analysis+of+SARS-CoV-2+spike+reveals+flexibility+mediated+by+three+hinges%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges.</a> Science. 370 (6513), 203-208 (2020).</li>
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<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.7+%C3%85+inside+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells.</a> Nature Methods. 18, 186-193 (2020).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

从一种小众技术发展至今，冷冻电子断层扫描（cryoET）已成熟为一种广泛应用的方法，能够在细胞和分子水平上以前所未有的分辨率进行结构研究21,22。随着对冷冻电镜成像需求的不断增长，可用于获取该技术的资源正面临巨大压力。尽管多个国家级冷冻电镜设施已相继开放，且科研机构也在努力提升透射电子显微镜（TEM）的容量以满足全球科研群体的需求，但冷冻电镜仪器的使用机会仍然有限，因此用户必须高效利用宝贵的数据采集时间，以最大化每次显微镜实验的产出。由于需要采集数百个倾转系列，而数据采集时间又极为有限，这就迫切需要开发新的图像采集流程，在不牺牲数据质量的前提下提高通量。近年来，硬件和成像工作流程的进展显著加快了倾转系列的采集速度18,19，从而极大地改变了“设置采集位点所需时间”与“实际倾转系列采集所需时间”之间的比例关系。总体而言，采集位点的设置流程正逐渐成为限制cryoET实验通量提升的主要瓶颈之一。
本文所介绍的优化方案使我们能够在冷冻电子断层扫描（cryoET）会话的第一天，在离线模式下设置171个用于自动断层成像采集的位置，而此时显微镜正忙于其他操作（例如方格成像、调校以及自动倾斜系列采集），因此不会影响可用于数据采集的显微镜机时。除了最大化cryoET会话的通量外，该流程还显著减少了用户在自动化数据采集准备阶段所投入的时间。在所述方案中，用户需浏览已成像的网格方格，识别出合适的感兴趣区域，并将其作为采集点添加至SerialEM导航器中。所有目标随后将由PyEM工具在SerialEM中批量自动处理，生成虚拟图谱16。因此，相较于通过获取真实锚定图谱的方式，该计算方法大大加快了流程，避免了因载物台移动、图像采集、在“查看”（View）与“预览”（Preview）模式间切换成像条件所导致的等待时间，也避免了在高倍率下反复居中目标而重复执行这些步骤所需的时间。此外，由于每次图像采集都会在目标样本上累积电子剂量23，使用虚拟图谱对目标进行精确定位可减少在正式倾斜系列采集前的准备阶段引入的辐射损伤。本文所述方案利用中等放大倍率和高放大倍率的虚拟图谱（分别为“Preview”和“View”）在倾斜系列采集前对目标进行重新对准。当对对准精度要求不高时，该流程可轻松修改为仅使用中等放大倍率的View图像，例如在目标结构较大、最终定位精度要求较低的情况下10，或在单颗粒分析样品于冷冻网格上分布稀疏、需用户手动选择每个采集点的情形中24,25。最后，基于离线使用虚拟SerialEM实例的方法还通过减少用户必须亲临显微镜现场的需求，支持远程连接设置采集点，从而提高了设施在运行组织上的灵活性。
近年来，冷冻电子断层扫描技术（cryoET）在技术和方法上的进步显著提高了自动化数据采集过程的速度和可靠性。然而，仍需进一步发展以解决该方法中尚存的限速步骤。其中最显著的问题是，载网和方格的初步定位映射现已成为实验设置中的主要瓶颈之一，因此迫切需要改进硬件，以加快显微镜载物台的移动速度以及直接电子探测器的图像采集速度。此外，开发基于机器学习的方法以完全自动化目标识别过程至关重要，这将消除用户在选择感兴趣区域时所需的人工视觉检查——这一耗时的步骤目前仍依赖于操作者的专业经验。

冷冻电子显微镜（cryoEM）技术基于对生物样品进行快速玻璃化冷冻后，利用透射电子显微镜（TEM）对其进行成像，该样品制备过程可将样品的分子和细胞结构保持在接近天然且水合的状态1,2。在冷冻电子断层扫描（cryoET）中，通过从不同倾转角度对同一感兴趣区域采集一系列图像（即所谓的倾转系列），再经计算重建出玻璃化样品的三维模型3。这一先进成像技术已发展成为在天然细胞环境中研究生物过程结构的有力方法4,5,6。
除了对玻璃化样品进行超微结构分析外，通过应用子层析平均技术5，还可获得存在于层析体积内多个拷贝的大分子复合物的高分辨率重构图像。该重构方法基于对包含目标结构的子体积进行迭代比对和平均，旨在提高最终重构图像的信噪比和分辨率7,8。子层析平均依赖于大量数据的采集与处理，通常需要借助高端透射电子显微镜获取数百个倾转系列，其运行成本较高。
目前，此类自动化冷冻电子断层扫描（cryoET）实验的设置是一个耗时的过程，通常依赖于用户的手动输入9,10,11。通常情况下，目标区域是通过目视检查样品网格图后，再手动设定用于自动数据采集的区域。用户在识别采集位点时的效率常受样品性质的影响，尤其在分析浓度不理想的纯化大分子或在拥挤的细胞环境中检测稀有事件时，难度显著增加，此时需要采用关联成像方法12。此外，当前的工作流程要求在设置阶段以多种放大倍数采集图像，这些图像将在后续自动化采集过程中用于目标区域的精确定位与居中对准11,13,14。这些高精度的重新对准步骤对于高分辨率应用至关重要，因为高倍成像要求精确的居中操作，以确保目标区域始终保留在较小的视野范围内。总体而言，每次数据采集过程中，有数小时时间被用于这一耗时的准备工作，而在此期间透射电子显微镜（TEM）无法进行倾斜系列图像的采集。因此，根据所需倾斜系列图像的数量，采集位点的识别与设置可能对一次cryoET实验中可用于数据采集的显微镜时间产生显著影响。
本文介绍了一种基于 SerialEM 软件包15 和最新版本 PyEM 软件16 的优化方案，用于网格定位、网格方格成像、目标选择以及建立大规模倾转系列数据自动采集的流程。该方法的核心理念是通过 PyEM 为每个采集项目计算生成图像（称为虚拟图谱），并将其提供给 SerialEM，以实现对目标的精确定位与居中。为了节省实际采集时间，目标选择及虚拟图谱的生成均通过在另一台计算机上运行的虚拟 SerialEM 实例离线完成，从而将采集目标的选择过程与透射电子显微镜（TEM）的操作分离。本方案虽未涉及提升数据质量13,17 或倾转系列采集速度18,19 的方法，但主要聚焦于优化大规模自动化冷冻电子断层扫描（cryoET）实验设置的时间效率。因此，本方案适用于正在建立 cryoET 数据采集工作流程、并希望通过增加可用于倾转系列采集的显微镜时间以最大化自动化数据采集产出的科研人员。

<table><tbody><tr><td>透射电子显微镜</td><td></td><td></td><td>我们的实验方案仅基于计算工作流程。用户只需能够访问任意类型的透射电子显微镜即可</td></tr></tbody></table>

冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

冷冻电子断层扫描技术（cryoET）是一种用于研究生物样品近天然状态下三维结构的强有力方法。目前最先进的 cryoET 技术结合亚断层平均分析，能够实现对在断层重建图像中多次出现的大分子复合物进行高分辨率结构解析。断层扫描实验通常需要利用高端透射电子显微镜采集大量倾转系列图像，其运行成本较高。尽管近年来自动化数据采集流程的通量和可靠性持续提升，但选择倾转系列图像采集区域（即感兴趣区域）的过程仍难以完全自动化，仍依赖用户手动操作。因此，大规模数据采集前的设置过程耗时较长，会显著减少显微镜可用于实际倾转系列图像采集的时间。本文所述的实验方案介绍了基于 SerialEM 软件包和 PyEM 软件的最新实现方法，可显著提高载网筛选和大规模倾转系列数据采集的时间效率。该方案详细说明了如何利用 SerialEM 的脚本功能，实现载网制图、载网方格制图以及倾转系列图像采集的全流程自动化。此外，本方案还描述了如何在自动化数据采集启动后，以离线模式使用 PyEM 选择额外的采集目标。为演示该方案的应用，文中以 Sars-Cov-2 倾转系列的高端数据采集为例进行了说明。该工作流程特别适用于那些既需要精细筛选采集目标，又需要采集大量倾转系列图像的断层扫描实验，可最大限度地提升实验时间利用效率。

该实验流程用于获取 Turonova 等人 2020 年20所述的 Sars-Cov-2 倾斜系列数据集；整个数据集是在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室（EMBL）通过三次显微镜会话使用三个不同的载网完成的。本研究将重点介绍并描述使用第一个载网进行的首次为期 3 天（约 72 小时）的实验会话。
在低倍率下完成整个网格的成像后（约需10分钟，参见步骤2），在网格图上选取了71个合适的方格，并以中等倍率获取这些方格的图像（方格图），成像参数设置（倍率、曝光时间、离焦量）需能够直接可视化并识别目标样品，即本例中的冠状病毒（参见步骤4）（图1A）。每个方格的成像时间约为3分钟，总计耗时3小时45分钟。
首个方格图创建后，立即在另一台计算机上打开一个虚拟的SerialEM实例（不控制相机或显微镜），用于查看方格图，并在适合进行倾转系列采集的靶标位置上添加标记点（见步骤5）（图1B）。通过将当前虚拟SerialEM导航器与采集用SerialEM实例的导航器合并，可获取新采集的方格图。经过约2小时的网格方格采集与筛选，共确定了50个初始靶标。
方形图谱采集完成后，设置 SerialEM 的低剂量模式，并采集和保存参考观察和预览图像作为图谱（见步骤 3）。随后可立即将这些图谱在虚拟 SerialEM 实例中使用，通过 PyEM 软件套件从相应的方形图谱图像生成 50 个选定目标的虚拟观察（图 1C）和虚拟预览图谱（图 1D），处理时间约为 ~30 分钟（见步骤 6）。在虚拟 SerialEM 会话中的这一处理时间内，可完成显微镜采集前的最终准备工作：能量滤波器调谐、新相机增益参考图像采集、物镜的像散和彗差消零对中。
显微镜调校完成后，生成了来自50个初始目标的虚拟图谱，随后建立了用于实际采集的SerialEM导航器（见步骤8），并设置了聚焦和跟踪位置（见步骤9），即可开始倾转系列图像的采集（见步骤10和11）。首先利用虚拟视图图谱（图1C）对目标进行初步居中（图1E），然后在实际倾转系列采集的放大倍数下，使用虚拟预览图谱（图1D）完成最终的精确居中（图1F）。
从上午9:30开始进行网格定位，约在15:00启动了对前50个目标的倾转系列图像采集。根据断层成像采集所用的设置（详见参考文献），每个倾转系列的采集时间约为20分钟，目标数量足以支持整个夜间连续运行。在采集过程中，可对剩余的方格图进行检查，并通过虚拟SerialEM实例离线添加更多目标。在剩余的方格图中又筛选出121个新目标，在为这些新目标创建虚拟图后，将其添加至采集用SerialEM导航器中，足以支持72小时采集会话直至完成。
该流程（如图2所示）可在单个工作日内完成171个目标的设置，用于为期72小时（3天）的显微镜自动断层扫描采集。
<img alt="纳米颗粒分布分析；显微镜图像显示不同放大倍数、视野图及各种分辨率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：代表性虚拟图与居中后对应采集图像的方形图示例。（A）Turonova 等人20研究中使用的 Sars-Cov-2 冷冻电镜载网的代表性方形图。四个感兴趣区域以红色十字标记。显微镜放大倍数为 2,250×。（B）从方形图中裁剪出的区域，突出显示用于生成选定目标（红色十字）的虚拟视野（橙色）和虚拟预览（黄色）图的区域。（C）虚拟视野图。（D）虚拟预览图。（E）以虚拟视野图为参考进行居中后的实际视野采集图像。显微镜放大倍数为 11,500×。（F）以虚拟预览图为参考进行居中后，倾斜系列中的 0° 倾斜采集图像。显微镜放大倍数为 64,000×。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用SerialEM进行显微镜载网定位、低剂量设置和目标采集的工作流程图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：结合PyEM工具使用SerialEM进行冷冻电子断层扫描（CryoET）实验的工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

低温电子断层扫描中对大规模数据采集日益增长的需求，要求具备高通量的成像采集流程。本文所述方案实现了先进的采集策略的最新进展，旨在最大限度地提高断层扫描数据采集的时间效率和通量。

冷冻电子断层扫描技术（cryoET）是一种强大的方法，可用于研究接近天然状态的生物样品的三维结构。目前……

大规模数据采集会话的设置是一个耗时的过程，可能会显著减少可用于倾转系列采集的剩余显微镜时间。本方法可实现大规模自动化断层扫描数据采集的快速设置，从而最大限度地提高需要仔细选择采集目标的断层扫描实验的时间效率。首先打开一个虚拟的 SerialEM 实例。完成第一个网格区域的成像后，使用 SerialEM 导航器菜单中的合并功能，在虚拟的 SerialEM 实例中查看拼接图像。双击导航器窗口以打开网格区域地图。在地图中查找目标区域，并使用虚拟 SerialEM 导航器的“添加点”功能，在感兴趣的目标区域上添加图像采集点。完成新方格的映射后，保存导航器文件并再次合并导航器。重复此过程，直到所有网格方格均被映射。随后，再次将导航器文件与虚拟的 SerialEM 实例合并。从虚拟 SerialEM 菜单运行 Pi EM 虚拟图谱脚本。选择工具，然后选择虚拟锚定图谱。根据网格方块图谱的大小和数量，以及视图和预览图谱的 binning 设置，此过程可能需要一些时间。为确保显微镜性能正常，需按以下顺序进行数据采集时使用相同的放大倍数和束斑尺寸设置。通过CTF运行SerialEM的无像散对中程序。插入并居中物镜光阑。在 SerialEM 中通过 CTF 和 GIF 快速调谐校正像散。在 SerialEM 中打开新的导航器文件，取消选择所有 A 点。选择第一个视图地图。选择折叠。点击 A 两次，然后取消选择折叠。选择第一个视图图谱位置。按下 Shift+T，然后选择最后一个视图图谱位置，再次按下 Shift+T。在文件属性中选择单帧图像以打开对话框。在下一个文件属性对话框中，根据成像需求和仪器设置选择所需的参数。出现提示时，输入带编号的名称，然后点击保存。为第一个倾斜系列（TS）位置设置倾斜系列控制器。完成后，单击“确定”以将这些参数设置应用于此采集项目之后的所有倾斜系列。所有预览图现在均已选为倾斜系列（TS），并分配了编号的文件名。如有需要，为每个目标设置聚焦/追踪距离。双击视图地图以加载。在导航器列表中选择预览地图，然后在导航器窗口中选择编辑焦点。在低剂量控制面板中，取消选择“旋转区域间轴”以沿样品台倾斜轴对齐和定位试拍及聚焦。在加载的视图图谱中单击所需区域，以设置该倾斜序列的聚焦试拍位置，并确保导航器项目已设置为 TSP。对所有项目重复此操作。在每次倾斜系列开始前运行的 PreTomo 脚本中编辑焦距范围。在 SerialEM 倾斜系列菜单中，勾选“在倾斜系列中运行脚本”并选择 DuringTomo 脚本的脚本编号。检查氮气罐液位，并确认是否已选择自动装载器涡轮关闭功能。检查数据存储的可用空间。在 SerialEM 的文件菜单中，取消勾选日志文件的连续保存选项。每个倾斜系列将拥有其独立的日志文件。在导航菜单中点击“acquire”项目后，运行 PreTomo 脚本。选择主任务“acquire tilt series”，然后选择在 PostTomo 后运行脚本。勾选“结束时关闭柱阀”和“结束时发送邮件”，然后点击“go”。在低倍率下，从网格图中选取了71个合适的方格。使用能够直接可视化并识别目标样本（本例中为冠状病毒）的设置，获取中倍率图。每个方格的采集时间为3分钟，总计3小时45分钟。创建第一张方格图后，在另一台计算机上打开了一个虚拟的SerialEM实例，用于可视化方格图，并在适合进行倾转系列采集的靶标区域添加点。设置SerialEM的低剂量模式，获取并保存参考图像和预览图像作为地图。随后，这些地图可立即在虚拟SerialEM实例中使用，以从相应的方格图图像生成虚拟视图和虚拟预览。利用虚拟视图图谱对目标进行初步居中，随后使用虚拟预览图谱在实际倾转系列采集的放大倍数下进行最终居中。用户应预留充足时间充分探索样品的形貌特征。在搜索若干图谱后，使用者将更能准确判断适合数据采集的高质量区域。

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冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

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