血源性内皮细胞与人多能干细胞的定向分化

该协议详细介绍了一种生成表征良好的人血源性内皮细胞群的方法。这些细胞可用于研究分子调控和内皮到造血的转变。首先培养人类胚胎干细胞四天，以将它们分化为原始内皮细胞。

在第五天，吸出细胞上方的培养基。然后用每孔一毫升DMEM / F-12轻轻洗涤细胞。每孔加入一毫升新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基，并将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。

在第六天和第七天，用每孔一毫升新鲜制备的均质内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，并将细胞再孵育24小时。第八天。分离并洗涤细胞后，将它们均匀地分成冰上的微量离心管，每个含有至少600微升细胞，密度为每毫升10至第5个细胞。

酌情将抗体添加到含有细胞的试管中，并在避光的冰上孵育30分钟。通过在1000倍G和4摄氏度下离心5分钟来沉淀细胞。除去上清液并将沉淀重悬于600微升冰冷的分选缓冲液中。

通过五毫升FACS管的网状过滤器帽过滤样品，并将细胞储存在避光的冰上，以便立即进行细胞分选。要通过FACS分离血源性内皮细胞，首先对CD45阴性细胞群进行门禁。然后在CD45阴性群体中，门控CD31阳性细胞。

接下来在CD31阳性群体中，VE-钙粘蛋白阴性细胞群的门。然后在VE-钙粘蛋白阴性群体中，对c-Kit阳性细胞进行门控。从c-Kit阳性群体中，门控CD34阳性细胞群。

最后从CD34阳性细胞群中，鉴定并收集KDR阳性细胞。将血源性内皮细胞接种到为造血祖细胞生长而配制的甲基纤维素基基中后，在第八天计数集落形成单位-红系集落和原始细胞形成单位-红系菌落。集落形成单位-粒细胞-巨噬细胞和集落形成单位-粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨石菖。

在第14天计数多能造血祖细胞菌落。每接种1000个血源性内皮细胞，产生约20个集落形成单位。具有内皮细胞形态的细胞在培养物中也可见。

这些是血源性内皮细胞，在单细胞水平上产生多谱系造血祖细胞。该协议是一种2D血清和小鼠饲养层无饲养层培养系统，可在大约一周内产生人血源性内皮细胞。