血源性内皮细胞与人多能干细胞的定向分化
2021年3月31日
这里介绍的是在大约 1 周内从人多能干细胞定向分化的血源性内皮细胞的简单方案。
该协议详细介绍了一种生成表征良好的人血源性内皮细胞群的方法。这些细胞可用于研究分子调控和内皮到造血的转变。首先培养人类胚胎干细胞四天，以将它们分化为原始内皮细胞。
在第五天，吸出细胞上方的培养基。然后用每孔一毫升DMEM / F-12轻轻洗涤细胞。每孔加入一毫升新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基，并将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。
在第六天和第七天，用每孔一毫升新鲜制备的均质内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，并将细胞再孵育24小时。第八天。分离并洗涤细胞后，将它们均匀地分成冰上的微量离心管，每个含有至少600微升细胞，密度为每毫升10至第5个细胞。
酌情将抗体添加到含有细胞的试管中，并在避光的冰上孵育30分钟。通过在1000倍G和4摄氏度下离心5分钟来沉淀细胞。除去上清液并将沉淀重悬于600微升冰冷的分选缓冲液中。
通过五毫升FACS管的网状过滤器帽过滤样品，并将细胞储存在避光的冰上，以便立即进行细胞分选。要通过FACS分离血源性内皮细胞，首先对CD45阴性细胞群进行门禁。然后在CD45阴性群体中，门控CD31阳性细胞。
接下来在CD31阳性群体中，VE-钙粘蛋白阴性细胞群的门。然后在VE-钙粘蛋白阴性群体中，对c-Kit阳性细胞进行门控。从c-Kit阳性群体中，门控CD34阳性细胞群。
最后从CD34阳性细胞群中，鉴定并收集KDR阳性细胞。将血源性内皮细胞接种到为造血祖细胞生长而配制的甲基纤维素基基中后，在第八天计数集落形成单位-红系集落和原始细胞形成单位-红系菌落。集落形成单位-粒细胞-巨噬细胞和集落形成单位-粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨石菖。
在第14天计数多能造血祖细胞菌落。每接种1000个血源性内皮细胞，产生约20个集落形成单位。具有内皮细胞形态的细胞在培养物中也可见。
这些是血源性内皮细胞，在单细胞水平上产生多谱系造血祖细胞。该协议是一种2D血清和小鼠饲养层无饲养层培养系统，可在大约一周内产生人血源性内皮细胞。
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概述
本文介绍了一种在约一周时间内从人类胚胎干细胞诱导生成生血内皮细胞的详细实验方案。该方法可使研究人员获得特征明确的此类细胞群体，这些细胞对于研究内皮向造血转变过程至关重要，并在再生医学和血液制品生成方面具有潜在应用价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 血管生物学
- 造血作用
- 组织工程
背景
- 血管对组织功能至关重要，其内壁由血管内皮细胞构成。
- 生血性内皮细胞是一种特殊亚型，在发育过程中可产生造血干细胞和祖细胞。
- 在体外生成这些细胞对于研究血细胞发育及潜在的治疗应用具有重要价值。
- 现有的内皮细胞分化方案尚不能从人类干细胞中获得特征明确的生血性内皮细胞。
研究目的
- 建立一种可重复的方案，从人类胚胎干细胞诱导生成生血内皮细胞。
- 实现在体外研究分子调控机制以及内皮细胞向造血细胞转变的过程。
- 提供一种无饲养层、无血清的培养系统，适用于后续应用。
使用的方法
- 人胚胎干细胞的培养及为期八天的逐步分化。
- 使用特定生长因子和小分子（如 GSK3β 抑制剂、bFGF、BMP4、VEGF-A、视黄酸）诱导中胚层及内皮细胞系的分化。
- 通过流式细胞术（FACS）对表面标志物（CD45-、CD31+、VE-cadherin-、c-Kit+、CD34+、KDR+）进行逐级设门，分离出造血性内皮细胞。
- 在甲基纤维素培养基中进行集落形成实验，以评估其造血潜能。
主要结果
- 该方案可在一周内获得定义明确的生血内皮细胞群体。
- 每1000个生血内皮细胞可生成约20个集落形成单位，表明其具有较强的造血潜能。
- 可观察到红系和多能造血祖细胞集落。
- 培养过程中内皮细胞形态得以维持，证实了细胞身份。
结论
- 该无饲养层、无血清的方案可高效地将人胚胎干细胞诱导为造血性内皮细胞。
- 该方法有助于在体外研究内皮向造血转变过程及其分子调控机制。
- 该方案为体外血液制品的潜在生成提供了平台，并减少了对人源供体的依赖。
常见问题
行业重要性概述
从人多能干细胞定向分化出造血性内皮细胞，解决了体外建模造血发育和生成血细胞谱系的关键瓶颈。该技术能够对内皮-造血转化过程进行机制性风险评估，并提升早期细胞治疗和再生医学研发管线的可预测性。本方案采用无饲养层、无血清的设计，增强了企业研发项目中的可重复性和可扩展性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够研究调控内皮细胞向造血细胞转变的分子通路。
- 支持对影响血液谱系特化因子的功能性靶点进行验证。
- 有助于在造血发育过程中对候选靶点进行预测性风险评估。
筛选与检测方法开发
- 为下游功能检测提供标准化且特征明确的细胞群体。
- 能够对来自特定前体细胞的造血集落形成进行定量评估。
- 支持对影响内皮细胞或造血细胞命运的调节因子进行可重复的筛选。
转化与临床前研究
- 建立了一个用于体外模拟与疾病相关的造血缺陷的平台。
- 实现了从发现到血液细胞生成策略的临床前验证的连续性。
- 支持基于细胞的治疗概念进行风险调整后的推进。
流程与工作流整合
本方案通过实现造血内皮细胞的高效生成与分离，用于机制研究和功能检测，从而融入从发现到临床前研究的连续过程。
- 发现生物学：支持对血液谱系出现的分子调控进行假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的集落形成结果，用于比较分析。
- 分析：基于流式细胞术设门和集落定量，实现客观的读数结果。
- 转化研究：连接体外模型与造血潜能的临床前评估。
- 企业级复用：提供可扩展、无饲养层的系统，适用于多种干细胞系和疾病模型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高造血谱系建模和靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：增强细胞分化工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：优化细胞治疗和再生医学项目的决策流程。
- 项目组合影响：实现对早期阶段细胞治疗候选项目的基于风险的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备人类多能干细胞培养及分化方案的专业知识。
- 需要具备流式细胞仪设备，用于多参数细胞分选。
- 需要跨团队统一门控策略和克隆定量方法。
- 经方案优化后，可适用于多种人类干细胞系。
- 依赖经验证的抗体组合和基于甲基纤维素的功能性检测方法。
