体外分析E3泛素连接酶功能

本实验方案的总体目标是分析E3连接酶功能的重要关键方面，包括E2酶特异性、底物选择以及泛素转移。该技术的主要优势在于其广泛的适用性，因为所有真核来源的蛋白质均可通过重组表达并在体外进行研究，无需特殊设备。首次使用赖氨酸释放技术时，优化检测参数（如酶浓度）非常重要，以确定所选E3连接酶的理想释放条件。

为了进行体外自泛素化实验，需设计一个移液方案以检测不同E2酶的功能活性，并在冰上为所有泛素化反应以及一个额外反应配制总反应混合液。接着，向相应的离心管中加入一微摩尔的E2酶，并在指定条件下将样品置于PCR仪中孵育两小时。孵育结束后，向每个反应体系中加入SDS上样缓冲液，并通过反复移液混匀。

然后立即在95摄氏度下将样品煮沸5分钟，并将变性的蛋白质储存在20摄氏度下。为进行体外底物泛素化实验，需准备所有反应的移液方案。在计算出单个反应所需的预混液量后，于冰上配制所有反应的预混液，并将预混液加入各离心管中。

分别加入相应的E3连接酶。然后将样品放入PCR仪中，按照所示条件孵育两小时。孵育结束后，向每个反应体系中加入两倍体积的SDS上样缓冲液，用移液器反复吹打混匀，并在95摄氏度下煮样5分钟。

进行赖氨酸释放实验时，设置好充电反应的移液方案，并在37摄氏度下孵育充电反应15分钟。为终止充电反应，加入apyrase至终浓度为每毫升1.8单位，并在室温下孵育反应5分钟。孵育结束后，加入EDTA至终浓度为30毫摩尔，并用双蒸水将反应体系体积调整至30微升。

为检测E3介导的E2泛素化释放，准备五个对应实验时间点的离心管，每管中加入6.7微升非还原性上样缓冲液，从零时间点反应管中取出6微升已终止的充电反应液，并将总体积调至26.7微升。进行去泛素化反应时，向各反应管中分别加入双蒸水、泛素化缓冲液、BSA、赖氨酸、E3连接酶以及已充电的E2。在选定的时间点后，从每个去泛素化反应体系中转移20微升样品至对应的样品管中。

然后立即涡旋混匀样品，并在70摄氏度下孵育10分钟。在此代表性Western印迹分析中，无活性的CHIP未发生自身泛素化。然而，在无活性CHIP存在或CHIP缺失的情况下，均形成了E3非依赖性泛素化产物。

野生型CHIP与UBE2D家族和UBE2E家族蛋白共同作用时会发生自身泛素化，而与UBE2D家族蛋白协同产生游离的多聚泛素链，但与UBE2E家族蛋白则无此作用。UBE2N/V1对泛素的结合可引导游离泛素链的形成。仅在野生型CHIP存在时观察到UNC-45B的自身泛素化及泛素化修饰，而在CHIP的失活突变体中未观察到该现象，表明UNC-45B是CHIP的一个保守底物。

当使用赖氨酸释放实验分析CHIP的催化活性时，未结合泛素的UBE2D2酶分子量为17千道尔顿，而携带单个泛素分子的结合态UBE2D2分子量约为26千道尔顿。在反应时间为0时，可观察到全部的结合态E2产物。在存在无活性CHIP的情况下，检测到微弱的E3连接酶非依赖性UBE2D2泛素释放，但未检测到CHIP的自身泛素化。

在野生型CHIP存在的情况下，UBE2D2的释放迅速，并在60分钟内完成，同时CHIP的自泛素化表明泛素被转移至其自身的赖氨酸残基上。由于E2酶活性有限，操作应尽可能迅速，并立即进行释放反应，随后进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。通过这些体外泛素化实验步骤，可使用特异性识别不同泛素连接类型的抗体探测蛋白质印迹膜，从而鉴定特定的泛素化连接类型。