Name: 中子自旋回声光谱学作为脂膜动力学和膜-蛋白相互作用的独特探针 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 了解中子自旋回声光谱学技术，用于研究脂膜动力学与膜-蛋白相互作用。该方法通过氘代标记增强散射对比度，可探测纳米秒时间尺度的膜弯曲与厚度涨落，为膜生物物理学研究提供关键数据。

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R. Ashkar 感谢 M. Nagao、L.-R. Stingaciu 和 P. Zolnierczuk 提供了许多有益的讨论，以及在他们各自束线上的中子自旋回波实验中给予的频繁协助。作者承认使用了美国国家标准与技术研究院（NIST）和美国橡树岭国家实验室（ORNL）的中子自旋回波谱仪。NIST 的中子自旋回波谱仪由高分辨率中子散射中心资助，该中心是美国国家标准与技术研究院与美国国家科学基金会根据协议号 DMR-1508249 建立的合作项目。ORNL 散裂中子源的中子自旋回波谱仪由美国能源部基础能源科学办公室下属的科学用户设施部门资助。橡树岭国家实验室由 UT-Battelle, LLC 根据美国能源部合同号 DE-AC05-00OR22725 进行管理。

作者声明无利益冲突，无可披露内容。

中子自旋回声（NSE）是一种在多种条件下测量脂质膜介观动力学的强大且独特的技术。NSE的有效应用取决于样品质量、中子对比度以及在给定样品中可探测的动力学范围。因此，要成功进行NSE实验并采集高质量数据，必须完成若干关键步骤。在NSE实验前，使用实验室常规方法对脂质体悬浮液进行表征，是确保中子束时间高效利用的关键步骤。例如，通过动态光散射（DLS）可测定挤出法制备的脂质体的粒径分布（或扩散系数），该方法在各实验室或共享平台中普遍可用84。冷冻电子显微镜是近年来在脂质体样品上得到验证的另一种表征方法，通过获取脂质体悬浮液冷冻超薄切片的高分辨率显微图像，可有效评估脂质体的单层结构65、结构域形成85,86，或添加剂（如纳米颗粒76和蛋白质87）的掺入情况。此外，小角X射线散射（SAXS）也可用于表征膜结构<sup class="xref"...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

细胞膜及其功能的理解在过去几十年中取得了显著进展。过去认为细胞膜是被动的脂质双分子层，仅用于界定细胞边界并承载膜蛋白1 逐渐转变为一种动态模型，其中脂质双分子层在调控重要的生物过程（包括细胞信号传导、分子交换和蛋白质功能）中发挥着关键作用 — 仅举几例2,3,4,5,6细胞膜具有高度动态性，持续发生重塑和分子重分布，这一认识推动了科学界对膜结构的研究超越平衡态结构的探索7,8,9因此，已开发出多种方法用于研究生物及仿生脂质膜中的各种动态模式。迄今为止，大多数研究主要集中在分子的扩散运动上10,11,12,13 以及宏观形状涨落14,15,16，导致对中间尺度膜动力学的理解存在显著空白，即由数十至数百个脂质分子组成的脂质聚集体的集体涨落。这些动力学过程发生的长度尺度为几十至几百埃，时间尺度为亚纳秒至数百纳秒（参见 图1），这里称之为介观尺度。实际上，膜层面的关键生物活动正是发生在这些尺度上。17。这包括病毒出芽18通道门控19以及膜蛋白相互作用20还需要指出的是，膜蛋白的能量景观同样重要21,22 表明蛋白质的构象变化 — 发挥其调控作用所必需的 — 发生在纳秒时间尺度上23 集体膜波动的重要性，进一步强调了介观动力学在细胞膜及其仿生类似物生物学功能中的关键作用20本文聚焦于脂质膜的两种主要介观动态模式，即弯曲涨落和厚度涨落。
直接探测这些涨落模式的主要挑战在于，使用常规光谱学方法难以同时覆盖其空间和时间尺度。另一个挑战是，直接接触的技术可能会干扰其所要测量的涨落本身16。这一问题因生物膜在组成和结构上的复杂性而进一步加剧24,25，这种复杂性导致膜具有非均质的特征，包括脂质区域的形成26,27,28,29,30以及膜的不对称性31,32,33—因此需要选择性探针来理解不同膜特征的动力学行为。幸运的是，这些挑战可以通过非侵入性的中子散射技术（如中子自旋回波（NSE））加以克服，该方法天然地覆盖了所需的长度和时间尺度，并能够在不改变其物理化学环境的前提下，实现对特定膜特征的研究34。事实上，近年来NSE光谱技术已发展成为研究集体膜动力学的一种独特而强大的工具35。针对脂质膜的NSE研究结果，为脂质膜的力学36,37和黏弹性38,39特性提供了新的认识，并揭示了其在生物学功能中潜在作用的新线索40,41。
中子自旋回波（NSE）谱学技术基于一种干涉仪仪器设计，该设计最初由Mezei提出42，利用一系列自旋翻转器和磁线圈来控制中子通过仪器时其自旋的进动。该设计依赖于相对于样品位置对称分布的磁场元件（即磁镜结构）（图1A）。这意味着，当没有发生中子与样品之间的能量交换时，中子在仪器的前半段和后半段经历相同次数但方向相反的自旋进动（注意两个进动线圈之间有一个π翻转器）。因此，中子的最终自旋态相对于初始态保持不变——这一现象称为自旋回波（见图1A中透明的中子）。然而，当中子与样品发生能量交换时，这种相互作用会改变中子在仪器后半段的自旋进动次数，从而导致最终自旋态发生变化（见图1A）。实验上，这种变化表现为极化的损失，这一点将在本文后续部分展示。关于NSE技术的更多细节，读者可参考专门的技术文献42,43,44,45。
此处提供一个简化的描述，以粗略估计中子自旋回声（NSE）技术可达到的长度和时间尺度。长度尺度由可实现的波矢转移范围 Q = 4π sin θ/λ 决定，其中 2θ 为散射角，λ 为中子波长。可以看出，Q 取决于波长范围以及谱仪第二臂的旋转范围（见图1A）。典型的 NSE 谱仪 Q 范围约为 ~0.02–2 Å-146,47，近期升级后可达 ~0.01–4 Å-148,49，对应的空间尺度约为 ~1–600 Å。另一方面，可探测的时间尺度由中子在磁进动线圈内获得的总进动角（或相位）计算得出，其表达式为50：<img alt="量子力学公式中的总角相位方程，φ_tot≃γBħω/m_n v³=ωt。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 12">。在此表达式中，t 是定义为 <img alt="静态平衡方程，t=γBlh/mₙv³=0.186Blλ³，公式，科学分析。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 13"> 的傅里叶时间，其中 <img alt="静态平衡方程 ΣFx=0, ΣFy=0 图示；力平衡分析与力学稳定性。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 50"> 为中子的旋磁比，<img alt="静态平衡图示；ΣFx=0, ΣFy=0；平衡演示装置；教学物理工具。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 51"> 为线圈长度，<img alt="静态平衡方程，ΣFx=0, ΣFy=0，受力分析图，物理教学，力分析。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 52"> 为线圈磁场强度。值得指出的是，傅里叶时间是一个严格依赖于仪器几何结构、磁场强度和中子波长的量。例如，使用波长 <img alt="静态平衡图示；ΣFx=0；实验装置；力学平衡分析。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 70"> = 8 Å 的中子，并设置仪器参数为 <img alt="静态平衡图示；ΣFx=0, ΣFy=0；平衡演示装置；教学物理工具。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 51"> = 1.2 m 和 <img alt="静态平衡方程，ΣFx=0, ΣFy=0，受力分析图，物理教学，力分析。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 52"> = 0.4 T 时，计算得到的傅里叶时间为 t ~ 50 ns。实验上，通过调节进动线圈中的电流（即磁场强度）或使用不同的中子波长来调节傅里叶时间，从而使 NSE 典型的时间尺度达到 ~1 ps 至 100 ns。然而，近期 NSE 谱仪的升级已实现了更长的傅里叶时间，在 Heinz Maier-Leibnitz Zentrum 的 J-NSE-Phoenix 谱仪上可达约 400 ns51，在橡树岭国家实验室的 SNS-NSE 谱仪上也达到类似水平48，而在法国劳厄-朗之万研究所（Institut Laue-Langevin, ILL）的 IN15 NSE 谱仪上甚至可达约 1,000 ns49。
除了能够直接获取膜动力学的长度和时间尺度信息外，中子自旋回声（NSE）还具有固有的中子同位素敏感性52特别是中子与氢元素的不同同位素发生相互作用的能力——氢是生物系统中最丰富的元素——导致中子散射长度密度的差异，34 或NSLD（等效于光学折射率）50），当氕被氘取代时，可采用一种称为对比度调节的方法，该方法常用于突出特定的膜结构特征或掩盖其他部分 — 后一种情况被称为对比度匹配。对比度变化/匹配的一个常见应用是用水（NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2）通过重水或D2O（NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2）以放大来自含氢脂质膜的中子信号（NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2）。该方法在膜结构研究中具有很高的有效性，因为D的穿透能力2O进入膜的头部区域可准确测定膜的厚度（参见 图2A，左侧面板）以及应用更复杂模型时不同脂质亚类的位置分布53,54本文重点介绍了一些利用对比度变化研究仿生膜中集体动力学及特定膜特征的实例。
本文通过中子自旋回声（NSE）技术对模型脂质膜和具有生物学意义的脂质膜体系开展研究的具体实例，展示了NSE在揭示膜的动力学和功能特性方面所提供的独特见解，尤其侧重于以脂质体悬浮液形式存在的自由-standing膜的介观尺度动力学。关于膜面内动力学的NSE测量，读者可参考专门针对掠入射中子自旋回声谱学（GINSES）55,56 的出版物以及其他关于取向多层脂质膜堆叠体系的研究57,58,59,60。
为简化起见，本文以一种被广泛研究的、能够形成相分离结构的脂质双分子层体系为例，说明三种不同的膜氘化方案，该体系由1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）混合物构成61,62。这两种脂质的烃链长度存在差异（DMPC为每条链14个碳原子，DSPC为每条链18个碳原子），且其凝胶-流体相变温度也不同（Tm, DMPC = 23 °C，Tm, DSPC = 55 °C）。因此，在混合物上下相变温度之间的温度范围内，DMPC:DSPC膜会发生横向相分离63。本文所考虑的氘化方案旨在展示在脂质体膜的中子自旋回声（NSE）测量中可探测的不同动力学模式，即弯曲涨落、厚度涨落，以及横向相区的特异性弯曲/厚度涨落。所有脂质组成均基于摩尔分数为70:30的DMPC:DSPC双分子层，使用市售的全氢化和全氘化DMPC与DSPC变体。所有样品制备均以4 mL重水（D2O）中的脂质体悬浮液为基础，脂质浓度为50 mg/mL，每份样品总脂质质量为Mtot = 200 mg。

<table><tbody><tr><td>氯仿（生物技术级）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>496189</td><td>生物技术级，&amp;ge;99.8%，含0.5-1.0%乙醇作为稳定剂</td></tr><tr><td>循环水浴锅</td><td>Julabo</td><td>SE-12</td><td>带智能泵的加热循环器，可编程温度设置，并配有外部传感器接口用于测量与控制</td></tr><tr><td>氧化氘</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>DLM-4</td><td>氘代水；重水（D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）（D，99.9%）</td></tr><tr><td>数字半微量天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS105</td><td>半微量天平，量程120 g，可读性0.01 mg，配备高分辨率称重传感器、符合人体工学的门设计以及移液器校验功能</td></tr><tr><td>乙醇（分子生物学级）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof乙醇，适用于分子生物学应用</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>VWR</td><td>36360-536</td><td>一次性钠钙玻璃巴斯德移液管</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7990-1</td><td>硼硅酸盐玻璃小瓶，配有PTFE/硅胶隔垫盖</td></tr><tr><td>实验室级冷冻柜</td><td>Fisher Scientific</td><td>IU2886D</td><td>超低温冷冻柜（-86 至 -50 °C），用于脂质和蛋白质的长期储存</td></tr><tr><td>脂质（部分氘代或全氘代）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>根据脂质种类而定</td><td>脂质可从Avanti公司购买粉末形式或氯仿溶液形式，可根据需要选择特定含量和氘代模式</td></tr><tr><td>Millipore纯水器</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRQSVP3US</td><td>Direct-Q&amp;reg;&amp;nbsp;3 UV纯水系统，内置紫外灯，可提供纯水和超纯水，降低有机物含量，适用于生物&amp;nbsp;应用</td></tr><tr><td>小型挤出器套装</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td>小型挤出器套装包括小型挤出器、加热模块、2支气密型注射器、2个O型圈、聚碳酸酯膜和滤膜支撑装置</td></tr><tr><td>快接接头</td><td>Grainger</td><td>2YDA1 和 2YDA7</td><td>按钮式管路接头，适用于QuickConnect水循环应用，例如高温囊泡挤出</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>SyringePump.com</td><td>New Era-1000</td><td>完全可编程注射泵，支持注入和回吸操作；可设置多达41个泵送阶段，调节泵送速率、分配体积和挤出循环次数</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPX2800</td><td>温度可控的超声波清洗仪，具备可编程功能，适用于脱气和超声处理</td></tr><tr><td>真空烘箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>3608</td><td>0.7立方英尺真空烘箱，内置高温限温器，防止过热</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td>可变转速模拟控制，支持低转速启动以实现温和振荡，或高速混合以实现样品的剧烈涡旋</td></tr></tbody></table>

中子自旋回波谱学作为研究脂质膜动力学及膜-蛋白质相互作用的独特探针

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

脂质双分子层构成了细胞膜的主要基质，是营养物质交换、蛋白质-膜&#160;相互作用以及病毒出芽等其他重要细胞过程的主要平台。为了实现高效的生物学活性，细胞膜必须具有足够的刚性以维持细胞及其区室的完整性，同时又需具备足够的流动性，以允许膜组分（如蛋白质和功能结构域）扩散并相互作用。这种弹性与流动性的精细平衡及其对生物学功能的影响，要求我们更深入地理解在介观尺度长度和时间范围内的集体膜动力学，例如膜形变和蛋白质结合事件。在能够有效探测这一动态范围的技术中，中子自旋回波（NSE）光谱技术是其中之一。结合氘标记技术，NSE可用于直接探测弯曲和厚度涨落，以及特定膜特征的介观动力学。本文简要描述了NSE技术，并概述了在脂质体膜上进行NSE实验的步骤，包括样品制备和氘化方案的详细信息，以及数据采集与归约的指导说明。本文还介绍了用于提取关键膜参数的数据分析方法，例如弯曲刚度模量、面积可压缩模量和平面内黏度。为了说明NSE研究的生物学意义，本文讨论了NSE探测膜现象的若干典型实例，即添加剂对膜弯曲刚度的影响、结构域形成对膜涨落的影响，以及膜-蛋白质相互作用的动力学特征。

通过中子自旋回声（NSE）研究膜弯曲涨落时，通常在约 (0.04 - 0.2) Å-1 的 Q 范围内进行。该 Q 范围对应于介于膜厚度与脂质体半径之间的中间长度尺度，此处弯曲动力学占主导地位。在更宽的 Q 范围内测量可揭示其他动态模式，包括脂质体扩散和膜内动力学。有关 NSE 可探测的膜动力学转变的更多细节，请参阅以下相关文献25,71。需要特别强调的是，NSE 信号与以下表达式成正比：<img alt="静态平衡公式，I_coh(Q,t)-1/3 I_inc(Q,t)，方程。" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="方程 5">，其中 Icoh 和 Iinc 分别代表样品的相干散射强度和非相干散射强度。因此，建议将 NSE 脂质体样品制备在氘代缓冲液中（即使用 D2<...

本文介绍了中子自旋回波（NSE）研究脂质膜的样品制备、数据约化和数据分析的实验方案。通过对脂质进行合理的氘代标记，可探测介观尺度的膜动力学行为，这些尺度正是重要生命过程发生的时间和空间范围。

脂质双分子层构成细胞膜的主要基质，是营养物质交换、蛋白质-膜相互作用以及病毒侵入等过程的主要平台……

本方案描述了中子自旋回声（NSE）研究所需的样品制备和数据处理步骤，该研究旨在探究与脂质膜的生物学功能及其实际应用相关的集体膜波动。NSE技术能够直接探测关键膜功能所涉及的纳秒时间尺度上的膜动力学，其独特优势在于具备同位素敏感性，可针对其他技术无法探测的特定膜结构特征进行研究。在纳米尺度上对膜动力学开展研究，对于理解各种细胞病理过程中所涉及的膜特性及膜蛋白相互作用的分子机制至关重要。该方法为初次接触中子散射实验（NSE）的研究人员提供了详细的指导，涵盖脂质体的设计、制备和表征，以确保实验成功，并进行后续的数据约化分析与结果解读。演示该实验步骤的是来自实验室的研究生Teshani Kumarage和本科生Julie Nguyen。在通风橱内操作，通过将精确称量的脂质溶解于1毫升溶剂中，并手动混合，制备脂质悬浮液。将脂质溶液置于小瓶中，一边缓慢倾斜旋转，一边通入惰性气体，使其干燥。为彻底去除残留溶剂，将小瓶置于35摄氏度的真空烘箱中过夜。次日，加入2毫升重水水合脂膜，使脂质浓度达到50毫克/毫升，并涡旋振荡水合后的脂质悬浮液，直至脂膜完全溶解。接下来，进行五次冻融循环：将含有水合脂质悬浮液的小瓶置于–80 °C条件下冷冻至完全凝固，然后转移至35 °C水浴中使脂质悬浮液解冻。每次解冻后，涡旋振荡至悬浮液均匀，再进行下一次循环。实验开始前，使用聚碳酸酯膜置于两个膜支撑架之间组装挤出装置，并在每一侧各添加两张滤纸以提供额外支撑。使用密封玻璃注射器，将0.3毫升重水多次通过膜组件，以水合聚碳酸酯膜。膜水合完成后，将装有1毫升已配制的乳白色脂质溶液的气密注射器插入挤出装置的一端，另一端插入一个空注射器。将注射器连接好后，将组件放入挤出块中。通过按住“速率”（Rate）按钮输入挤出速率，并按下“直径”（Diameter）按钮输入注射器直径。然后按“回吸”（Withdraw）按钮，直至指示灯亮起。按下开始，等待样品开始注入空的注射器中。在样品注射器即将完全排空之前，按下停止按钮。记录分配的体积，然后按住速率按钮，直到屏幕上显示第一阶段。保持“Withdraw”指示灯关闭，按下体积按钮，输入之前记录的已分配体积。再次按下“Rate”按钮，使用最右侧的上箭头进入第二阶段。按下“Volume”按钮，输入与之前记录的已分配体积相同的数值。在此阶段，按下“Withdraw”按钮，直至“Withdraw”指示灯亮起。接着进入第三阶段，按下体积按钮，直到屏幕上显示“LP:SE”，并将其设置为20。最后，按下“Rate”按钮，进入第四阶段，再按下体积按钮，选择“Stop”功能，完成泵的设置。泵设置完成后，按“开始”以启动挤出循环。在收集透明乳光蓝色挤出脂质悬浮液至洁净小瓶用于测量之前，需进行15至20次挤出循环。打开DAVE软件，从“数据约简”菜单中选择“约简NSE数据”。通过文件菜单中的“打开 echo 文件”功能，上传不同 Q 值的数据文件。上传的文件将显示在可用数据集下方。右键单击所选文件，并根据其对应的测量类型标注为样品、空白或分辨率。使用“数据集”选项卡，将探测器像素以 2×2 进行分组，以提高信噪比。对分辨率、晶胞和样品的所有文件应用相同的分箱设置。检查所有像素组的数据，并通过按下键盘上的 End 键屏蔽信号较差的像素组。按 Enter 键以打开弹出窗口，将同一掩膜应用于您的四个时间点。被掩膜的像素将变为绿色。确保所采集的数据为回波信号形式。通过右键单击上传文件列表中目标文件，然后从弹出菜单中选择“拟合操作”→“拟合回波分辨率”，开始对分辨率文件进行拟合。确保回波信号的拟合结果产生合理的拟合参数。为检查整个探测器范围内每个拟合参数相关的误差，选择“图像选项”，然后选择感兴趣的拟合参数。然后，右键单击检测器图像，打开一个显示误差条图的弹出窗口。如果某个特定像素的拟合结果不理想，可选择该像素，点击“拟合”选项卡，然后点击“拟合像素”来重新拟合该像素上的信号。在“拟合”选项卡中，输入新的相位和周期的初始参数。从已上传并标注的文件列表中选择相应文件，以减少样本文件。检查所有像素，并按上述方法将质量较差的像素进行掩膜处理。然后，右键单击该文件，选择拟合操作中的“导入相位”。对于分辨率文件，按照之前所述方法拟合回波信号，其中周期值保持不变，并从分辨率拟合结果中导入回波相位点。通过访问“通用”选项卡并输入实验记录的X和Y方向光束中心值，为所有数据文件输入光束中心。拟合完成后，从拟合文件列表中右键单击目标样品文件，然后在弹出菜单中选择“计算I(Q)”，以计算归一化的中间散射函数。在弹出窗口中输入分辨率和细胞文件所需的信息，以及Q弧的数量，然后按“确定”查看结果。请注意，青色数据显示的信号较差，这是由于探测器边缘效应所致，在整合不同的Q数据集时应予以剔除。最后，将简化后的数据集保存为ASCII文件，并将整个会话保存为DAVE项目到指定文件夹中。本研究对采用不同氘化方案制备的脂质体样品进行了中子自旋回波（NSE）测量。膜弯曲涨落的NSE测量在完全对比度匹配的脂质体上进行。该氘化方案导致膜核心与氘化流体环境之间产生较大的散射长度差异，显著增强了来自脂质体膜的散射信号，从而改善了弯曲动力学测量的统计质量。另一方面，中子自旋回声（NSE）对脂质体膜厚度涨落的测量结果显示，其与弯曲涨落的 Q 的三次方依赖关系存在偏差。为了分离出厚度涨落信号，将获得的信号除以 Q 的三次方，然后将多余的动态行为用洛伦兹函数在 Q 空间中进行拟合。该方法依赖于高质量的数据，而高浓度样品和强散射信号更有利于获得此类数据。通过 NSE 探测到的动力学行为可与氘核核磁共振弛豫测量和分子动力学模拟相结合，共同揭示分子脂质结构和堆积模式如何影响膜的功能。中子散射实验（NSE）对脂质膜的研究为膜生物物理学、膜结构与动力学之间复杂的相互关系，以及这些因素如何影响膜功能和膜蛋白相互作用提供了新的见解。

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中子自旋回声光谱学作为脂膜动力学和膜-蛋白相互作用的独特探针

本文介绍了用于电子顺磁共振研究的五聚体配体门控通道的定点自旋标记和重组方法。该方案可适用于任何膜蛋白。此处描述的重组方法也可用于在特定脂质体系中进行宏观和单通道电流的膜片钳测量。...

位点定向自旋标记与五聚体配体门控离子通道的电子顺磁共振光谱研究

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。...

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

本方案演示了如何利用去垢剂反差匹配的小角中子散射技术，获得溶液中去垢剂增溶的膜蛋白的低分辨率ab...

小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

单个脂质体测量用于研究质子泵膜酶的电化学与荧光显微技术

本实验方案描述了研究两种在人类健康中具有重要作用的模型蛋白质结构与动力学特性的方法。该技术结合了台式生物物理表征与中子自旋回波谱学，可在与蛋白质结构域间运动相关的时间和长度尺度上探测其动力学行为。...

蛋白质动力学研究 通过 中子自旋回波谱学

本方案介绍了使用停流进样环境快速混合多种液体溶液的方法 原位 在小角中子散射测量期间，研究纳米尺度长度和秒级时间尺度上的动力学过程。...

利用停流法与小角中子散射测量纳米尺度材料的时间演化

本方案描述了一种基于iSCAT的图像处理与单粒子追踪方法，可同时研究大分子与脂质膜相互作用时的分子质量及其扩散行为。文中提供了样品制备、质量-对比度转换、视频采集和后期处理的逐步操作指南，并给出了避免潜在问题的建议。...

利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。...

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。...

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。...

利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

了解中子自旋回声光谱学技术，用于研究脂膜动力学与膜-蛋白相互作用。该方法通过氘代标记增强散射对比度，可探测纳米秒时间尺度的膜弯曲与厚度涨落，为膜生物物理学研究提供关键数据。

中子自旋回波谱学作为研究脂质膜动力学及膜-蛋白质相互作用的独特探针

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