中子自旋回波谱学作为研究脂质膜动力学及膜-蛋白质相互作用的独特探针

本方案描述了中子自旋回声（NSE）研究所需的样品制备和数据处理步骤，该研究旨在探究与脂质膜的生物学功能及其实际应用相关的集体膜波动。NSE技术能够直接探测关键膜功能所涉及的纳秒时间尺度上的膜动力学，其独特优势在于具备同位素敏感性，可针对其他技术无法探测的特定膜结构特征进行研究。在纳米尺度上对膜动力学开展研究，对于理解各种细胞病理过程中所涉及的膜特性及膜蛋白相互作用的分子机制至关重要。

该方法为初次接触中子散射实验（NSE）的研究人员提供了详细的指导，涵盖脂质体的设计、制备和表征，以确保实验成功，并进行后续的数据约化分析与结果解读。演示该实验步骤的是来自实验室的研究生Teshani Kumarage和本科生Julie Nguyen。在通风橱内操作，通过将精确称量的脂质溶解于1毫升溶剂中，并手动混合，制备脂质悬浮液。

将脂质溶液置于小瓶中，一边缓慢倾斜旋转，一边通入惰性气体，使其干燥。为彻底去除残留溶剂，将小瓶置于35摄氏度的真空烘箱中过夜。次日，加入2毫升重水水合脂膜，使脂质浓度达到50毫克/毫升，并涡旋振荡水合后的脂质悬浮液，直至脂膜完全溶解。

接下来，进行五次冻融循环：将含有水合脂质悬浮液的小瓶置于–80 °C条件下冷冻至完全凝固，然后转移至35 °C水浴中使脂质悬浮液解冻。每次解冻后，涡旋振荡至悬浮液均匀，再进行下一次循环。

实验开始前，使用聚碳酸酯膜置于两个膜支撑架之间组装挤出装置，并在每一侧各添加两张滤纸以提供额外支撑。使用密封玻璃注射器，将0.3毫升重水多次通过膜组件，以水合聚碳酸酯膜。膜水合完成后，将装有1毫升已配制的乳白色脂质溶液的气密注射器插入挤出装置的一端，另一端插入一个空注射器。

将注射器连接好后，将组件放入挤出块中。通过按住“速率”（Rate）按钮输入挤出速率，并按下“直径”（Diameter）按钮输入注射器直径。然后按“回吸”（Withdraw）按钮，直至指示灯亮起。

按下开始，等待样品开始注入空的注射器中。在样品注射器即将完全排空之前，按下停止按钮。记录分配的体积，然后按住速率按钮，直到屏幕上显示第一阶段。

保持“Withdraw”指示灯关闭，按下体积按钮，输入之前记录的已分配体积。再次按下“Rate”按钮，使用最右侧的上箭头进入第二阶段。按下“Volume”按钮，输入与之前记录的已分配体积相同的数值。

在此阶段，按下“Withdraw”按钮，直至“Withdraw”指示灯亮起。接着进入第三阶段，按下体积按钮，直到屏幕上显示“LP:SE”，并将其设置为20。最后，按下“Rate”按钮，进入第四阶段，再按下体积按钮，选择“Stop”功能，完成泵的设置。

泵设置完成后，按“开始”以启动挤出循环。在收集透明乳光蓝色挤出脂质悬浮液至洁净小瓶用于测量之前，需进行15至20次挤出循环。打开DAVE软件，从“数据约简”菜单中选择“约简NSE数据”。

通过文件菜单中的“打开 echo 文件”功能，上传不同 Q 值的数据文件。上传的文件将显示在可用数据集下方。右键单击所选文件，并根据其对应的测量类型标注为样品、空白或分辨率。

使用“数据集”选项卡，将探测器像素以 2×2 进行分组，以提高信噪比。对分辨率、晶胞和样品的所有文件应用相同的分箱设置。检查所有像素组的数据，并通过按下键盘上的 End 键屏蔽信号较差的像素组。

按 Enter 键以打开弹出窗口，将同一掩膜应用于您的四个时间点。被掩膜的像素将变为绿色。确保所采集的数据为回波信号形式。

通过右键单击上传文件列表中目标文件，然后从弹出菜单中选择“拟合操作”→“拟合回波分辨率”，开始对分辨率文件进行拟合。确保回波信号的拟合结果产生合理的拟合参数。为检查整个探测器范围内每个拟合参数相关的误差，选择“图像选项”，然后选择感兴趣的拟合参数。

然后，右键单击检测器图像，打开一个显示误差条图的弹出窗口。如果某个特定像素的拟合结果不理想，可选择该像素，点击“拟合”选项卡，然后点击“拟合像素”来重新拟合该像素上的信号。在“拟合”选项卡中，输入新的相位和周期的初始参数。

从已上传并标注的文件列表中选择相应文件，以减少样本文件。检查所有像素，并按上述方法将质量较差的像素进行掩膜处理。然后，右键单击该文件，选择拟合操作中的“导入相位”。

对于分辨率文件，按照之前所述方法拟合回波信号，其中周期值保持不变，并从分辨率拟合结果中导入回波相位点。通过访问“通用”选项卡并输入实验记录的X和Y方向光束中心值，为所有数据文件输入光束中心。拟合完成后，从拟合文件列表中右键单击目标样品文件，然后在弹出菜单中选择“计算I(Q)”，以计算归一化的中间散射函数。

在弹出窗口中输入分辨率和细胞文件所需的信息，以及Q弧的数量，然后按“确定”查看结果。请注意，青色数据显示的信号较差，这是由于探测器边缘效应所致，在整合不同的Q数据集时应予以剔除。最后，将简化后的数据集保存为ASCII文件，并将整个会话保存为DAVE项目到指定文件夹中。

本研究对采用不同氘化方案制备的脂质体样品进行了中子自旋回波（NSE）测量。膜弯曲涨落的NSE测量在完全对比度匹配的脂质体上进行。该氘化方案导致膜核心与氘化流体环境之间产生较大的散射长度差异，显著增强了来自脂质体膜的散射信号，从而改善了弯曲动力学测量的统计质量。

另一方面，中子自旋回声（NSE）对脂质体膜厚度涨落的测量结果显示，其与弯曲涨落的 Q 的三次方依赖关系存在偏差。为了分离出厚度涨落信号，将获得的信号除以 Q 的三次方，然后将多余的动态行为用洛伦兹函数在 Q 空间中进行拟合。该方法依赖于高质量的数据，而高浓度样品和强散射信号更有利于获得此类数据。通过 NSE 探测到的动力学行为可与氘核核磁共振弛豫测量和分子动力学模拟相结合，共同揭示分子脂质结构和堆积模式如何影响膜的功能。

中子散射实验（NSE）对脂质膜的研究为膜生物物理学、膜结构与动力学之间复杂的相互关系，以及这些因素如何影响膜功能和膜蛋白相互作用提供了新的见解。