Name: 使用荧光激活的细胞核分选从新鲜冷冻的皮质中分离出成年人类星形胶质细胞群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习使用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻人脑皮层中分离成年星形胶质细胞核，该方法可获得高纯度细胞群用于转录组学和染色质可及性分析，助力研究健康和疾病状态下星形胶质细胞的分子功能。

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我们感谢西奈山伊坎医学院病理学和神经外科部门的成员在获取去标识化脑组织方面提供的帮助，以及西奈山医学院流式细胞术核心实验室（ISMMS's Flow Cytometry CORE）提供的专业建议。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为RF1DA048810、R01NS106229、R03NS101581（资助对象：N.M.T.）和R61DA048207（资助对象：S.A.）。

注意：西奈山伊坎医学院（ISMMS）人类受试者保护项目及其机构审查委员会（IRB）确保研究的伦理合规性，并遵守联邦、州及机构的各项规定。本研究中使用的所有尸检样本均为去标识化样本，通过生物样本库在适当的知情同意下获取，且经ISMMS的IRB（HS#14-01007）认定，豁免于&#34;人类研究&#34;的监管范畴。&#160;
1. 缓冲液的配制
注意：&#160;若进行后续RNA测序，需使用RNase去污染溶液彻底处理所有工作区域和工具，以防止mRNA降解。
<ol>
	<li>制备裂解缓冲液。
	<ol>
		<li>将以下成分溶于去离子 H2O 中并定容至 50 mL：5.47 g 蔗糖（终浓度 0.32 M）、250 µL 1 M CaCl2&#160;（终浓度 5 mM）、150 µL 1 M Mg(CH3COO)2&#160;（终浓度 3 mM）、10 µL 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 0.1 mM）、500 µL 1 M Tris-HCl（pH 8）（终浓度 10 mM）、50 µL Triton X-100（终浓度 0.1%）以及 17 µL 3 M 二硫苏糖醇（DTT，终浓度 1 mM，现用现加）（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备蔗糖缓冲液
	<ol>
		<li>将以下成分溶于去离子 H2O 中并定容至 50 mL：30.78 g 蔗糖（终浓度 1.8 M）、150 µL 1 M Mg(CH3COO)2（终浓度 3 mM）、500 µL 1 M Tris-HCl（pH 8）（终浓度 10 mM）以及 17 µL 3 M DTT（终浓度 1 mM，现用现加）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将冷冻组织解离为单核悬液
<ol>
	<li>取4 mL预冷的裂解缓冲液加入7 mL玻璃组织匀浆器（研磨器）中，并置于冰上保存。解剖约200–400 mg新鲜冷冻的人类成年大脑皮层组织，匀浆约50次，然后将组织匀浆转移至12 mL超速离心聚丙烯管中。</li>
	<li>使用5 mL移液器，将6.5 mL预冷的蔗糖缓冲液缓慢加入超速离心管底部，注意不要扰动蔗糖与组织匀浆之间的界面。 
	&#8203;注意：若同时处理多个样品，需通过向较轻的样品中添加额外的裂解缓冲液来精确平衡各管重量。精确平衡超速离心管对于防止转子损坏并确保达到正确转速至关重要。</li>
</ol>
3. 超速离心
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 24,400 rpm（101,814 × g）超速离心裂解物 1 小时。小心吸除上清液和碎片，避免扰动沉淀。 
	注意：若起始组织量少于 200 mg，可能无法观察到沉淀。</li>
	<li>向细胞核沉淀中加入 600 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）（无 Ca2+、Mg2+），冰上孵育 10 分钟后再进行重悬。</li>
	<li>在冰上反复吹打 50 次，以重悬细胞核沉淀。</li>
	<li>使用血细胞计数板在显微镜下观察完整细胞核，并确保重悬液浓度高于 105 个细胞核/mL 后再进行下一步操作（取 10 µL 重悬细胞核与 10 µL 台盼蓝混合）。</li>
</ol>
4. 抗体孵育
<ol>
	<li>为了对样本进行FANS免疫标记，加入500 µL重悬的&#160;样品沉淀，490 µL 1x PBS（Ca2+，Mg2+&#160;不含自由基的），10 µL 10% BSA（终浓度0.1%），1 µL 小鼠抗NeuN抗体偶联AF555（NeuN-AF555，终浓度1:1000），以及1 µL 小鼠抗PAX6抗体偶联别藻蓝蛋白（PAX6-APC，终浓度1:1000）。 
	注意：可选用其他偶联的抗体&#160;可添加其他荧光染料（见讨论部分）。本实验中，使用了AF488标记的小鼠抗OLIG2抗体（1:1000浓度），结果良好。</li>
	<li>使用少量样本进行仅4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色及单色对照，以设置门控参数。
	<ol>
		<li>为了进行AF555单色对照，加入20 µL重悬的样品沉淀和970 µL的1x PBS（含Ca2+，Mg2+&#160;不含），10 µL 10% BSA（终浓度0.1%），以及1 µL NeuN-AF555抗体（1:1000浓度）。</li>
		<li>为进行APC单色对照，加入20 µL重悬的样本沉淀和970 µL 1X PBS（含Ca²⁺、Mg²⁺）至流式管中。2+，Mg2+&#160;不含），10 µL 10% BSA（终浓度0.1%），以及1 µL PAX6-APC抗体（1:1000浓度）。</li>
		<li>为进行仅DAPI对照，向1.5 mL离心管中加入20 µL重悬的样品沉淀和970 µL 1X PBS（含Ca²⁺、Mg²⁺），混匀后在37°C避光孵育15分钟。随后在4°C以300 × g离心5分钟，弃上清，用1 mL 1X PBS（含Ca²⁺、Mg²⁺）重悬沉淀。将细胞悬液转移至96孔板中，每孔加入100 µL。使用高内涵成像系统在DAPI通道下采集图像，并通过配套分析软件定量细胞核数量与形态。 

关键词：DAPI, 对照实验, 细胞核染色, 高内涵成像, PBS, 重悬, 离心, 37°C孵育, 4°C, 300 × g2+，Mg2+&#160;不含自由基），以及10 µL 10% BSA（终浓度0.1%）（DAPI将在后续步骤中添加，见4.4）。 
		注意：如果使用两种以上的抗体，除单色对照外，建议同时进行荧光减一（FMO）对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下避光旋转孵育样品和对照样品 1 小时。</li>
	<li>将 DAPI 以 1:1000 的比例加入所有样本和对照中，然后进行分选。</li>
</ol>
5. 荧光激活细胞核分选（FANS）
注意：除非已熟练掌握流式细胞术/分选技术，否则建议在训练有素的人员协助下，使用机构内的流式细胞仪设施。
<ol>
	<li>如下图所示的门控。
	<ol>
		<li>首先，针对每个样本，根据前向散射光（FSC-A）设门 与侧向散射（SSC-A）用于筛选出符合细胞核大小范围的颗粒，从而排除红细胞和碎片图1A). 
		注意：非常纯净的细胞核制备物可区分较小的碎片聚集体与细胞核聚集体。</li>
		<li>接下来，针对每个样本，根据FSC-A进行设门 与 FSC-W（或 FSC-A） 与 FSC-H 和 SSC-A 与 SSC-W（或 SSC-A） 与 SSC-H）以仅包含单细胞核（图1B).</li>
		<li>接下来，针对每个样本，通过DAPI设门以包含完整单个细胞核（DAPI高信号设门群体），排除碎片（DAPI低信号，位于设门群体左侧）和双联体（位于设门群体右侧）图1C).</li>
		<li>根据荧光对照在FACS图上目测确定的明显细胞簇，设置进一步的门控。
		<ol>
			<li>运行仅含 DAPI 的对照，以确定在无抗体情况下的群体背景染色水平图1D 和 图2A).</li>
			<li>运行仅 NeuN-AF555 对照，以确定 AF555 通道中 NeuN+ 染色的阈值图 2B).</li>
			<li>运行仅含PAX6-APC的对照样本，以确定APC通道中PAX6+染色的阈值（图2C).</li>
			<li>如果使用更多种抗体，则需运行额外的单色对照图 2D，E). 
			注意：若使用两种以上的抗体，建议设置荧光减一（FMO）对照，以观察细胞群体是否存在偏移。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>所有对照实验完成后，在设定的阈值上方绘制 NeuN+ 和 PAX6+ 群体的分选门。
		<ol>
			<li>圈选 NeuN+ 群体以收集神经元（图1E 和 图2F).</li>
			<li>从 NeuN- 群体中圈选 PAX6+ 细胞以收集星形胶质细胞（图1E，F 和 图2F).</li>
			<li>门控并从NeuN-PAX6-群体中收集额外的胶质细胞群体（例如少突胶质细胞前体细胞，此处由OLIG2+示出）图1F). 
			注意：如果由于细胞群不明显，使用流式细胞术软件难以确定适当的设门阈值，可通过调整可视化事件数量（增加或减少FANS图中的事件数）来优化。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据预期的下游分析选择适当的样品采集方法。</li>
</ol>
6. 下游分子分析用FANS群体的收集
<ol>
	<li>进行大规模RNA测序时，在PBS中收集50,000–500,000个细胞核（另见第7.1节）。
	<ol>
		<li>加入2 mL蔗糖溶液、50 µL 1 M CaCl2和30 µL 1 M Mg(CH3COO)2，再用PBS定容至10 mL。</li>
		<li>颠倒混匀后冰上孵育15分钟，然后在4 °C下以900 × g离心10–15分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL RNA提取试剂中，涡旋振荡，干冰上速冻，随后于-80 °C保存。</li>
		<li>或者，直接将样品收集至200 µL RNA提取试剂中。分选完成后加入RNA提取试剂至总体积1 mL，保持试剂与分选样品体积比为1:1。涡旋振荡，干冰上速冻，随后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行基于测序的转座酶可及性染色质大规模检测（ATAC-seq）时，在预先用5%牛血清白蛋白（BSA）包被的微量离心管中，以PBS收集50,000–75,000个细胞核。将细胞核在干冰或-80 °C下冷冻，或立即用于ATAC文库制备。</li>
	<li>进行单核RNA测序（sn RNA-seq）或ATAC-seq时，在含0.04% BSA的PBS中收集细胞核（另见第7.2节）。</li>
</ol>
7. 文库构建前的准备建议
<ol>
	<li>大量细胞核RNA测序文库制备
	<ol>
		<li>收集后，在RNA提取试剂中进行标准的酚/氯仿RNA提取，加入酚/氯仿，从上层水相中用乙醇沉淀RNA，随后在管中进行DNase消化（15分钟）。</li>
		<li>进行RNA纯化并浓缩至最终体积为15 µL的水溶液中。 
		注意：使用本方法，从300 mg成人皮质样本中可获得的代表性核回收量约为300,000个NeuN+核（纯化和浓缩后总RNA为15–20 ng/µL）和约250,000个PAX6+核（纯化和浓缩后总RNA为10–12 ng/µL）。该代表性产量可能因样本质量、设门严格程度及RNA回收效率的不同而有显著差异。</li>
		<li>在测序前进行定量聚合酶链式反应（qPCR），以确认基于经典星形胶质细胞标志物高差异表达的星形胶质细胞富集情况GFAP、SOX9）、10-甲酰四氢叶酸脱氢酶（ALDH1L1）) 以及神经元和其他细胞谱系标志物的耗竭（图1G). 
		注意：收集双阴性群体（NeuN-PAX6-）可实现更精确的多层级qPCR质量控制分析，以评估星形胶质细胞的相对富集程度图 2H).</li>
		<li>使用适用于低RNA完整性数值（RIN）的试剂盒构建RNA-seq文库，此类低RIN值为死后样本所预期的结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单核测序文库制备
	<ol>
		<li>通过机构测序中心进行SN测序。</li>
		<li>对于基于纳米流体技术的处理与测序，使用推荐浓度 1 × 106 个细胞/毫升，置于至少60 µL的1×PBS + 0.04% BSA中，用于单核RNA测序（snRNA-seq）和3 × 106 每毫升细胞数不少于20 µL的1×PBS + 0.04% BSA，用于单核转座酶可及染色质测序分析（snATAC-seq）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
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<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在考虑若干生物学和实验技术因素后，应最终确定遵循本方案的实验设计。起始组织样本应为新鲜冷冻样本，未经固定处理，并且最好具有较短的死后采集时间间隔，以最大化细胞核的回收率。根据经验，死后间隔（PMI）不超过24小时可实现足够的细胞核回收；然而，为优化完整细胞核的回收，建议PMI控制在12小时或更短。除PMI外，其他因素如尸体储存温度和组织pH值也可能影响细胞核得率，但本研究未对此进行评估14。根据非正式经验，相同组织在-80 °C下储存长达五年时，FANS回收效果仍可保持相当水平，但尚未开展对照实验以评估储存条件对细胞类型特异性表达变异的影响。抗体孵育后的洗涤步骤是另一个可能需要考虑的变量。通常情况下，洗涤步骤会降低总体得率，但可能改善不同免疫标记细胞群的分离效果。在本研究中，无论是否包含抗体孵育后的洗涤步骤，NEUN/PAX6细胞群的分离效果均未观察到差异；但在使用其他一抗和二抗时（尤其是未预偶联的抗体），该步骤可能具有优势。
由于分选设备的灵敏度存在差异，每次分选操作时都必须设置适当的对照。若在血细胞计数板上观察到重悬样本中存在过多...

在原代组织中，人类星形胶质细胞的分子复杂性仍缺乏明确界定，迫切需要更优的工具以在健康和疾病状态下对其高分辨率地进行分离与表征。由于新鲜脑组织样本获取受限、胶质细胞与神经元突起之间高度互联，以及处理过程中不可避免的细胞活化，将完整的人类神经元和胶质细胞从其微环境中分离出来一直十分困难，这些因素均限制了对这些细胞类型进行离体（ex vivo）分子表征的能力1。荧光激活细胞核分选（FANS）作为一种替代活细胞分选的方法应运而生，可实现从冷冻组织中解离并进行细胞核群体的免疫标记。在过去十年中，FANS 已被广泛用于从多种脑组织样本和解剖区域中分离并分子表征人类神经元（NeuN+）细胞核群体1,2,3,4。
然而，用于从人类大脑皮层中分离特定胶质细胞核亚群的类似方法仍十分有限，导致对正常和病变组织中星形胶质细胞复杂性的理解相对不足。为此，研究人员改进了一种先前发表的利用FANS4分离人类神经元群体的方案，并验证了一种使用三种抗体组合的方法，以富集星形胶质细胞（以及少突胶质前体细胞），从而捕获处于静息状态和反应状态的星形胶质细胞5。为了在NeuN-组分中特异性富集星形胶质细胞，采用了针对两种在星形胶质细胞群体中差异表达的转录因子之一的抗体，即PAX6或SRY-box转录因子9&#160;(SOX9)6,7。PAX6在胎儿早期发育阶段的生发区放射状胶质样前体细胞中高表达，参与神经发生和胶质发生8,9,10,11，同时也参与视网膜神经元的特化12。在成体中，PAX6在静息状态的人类星形胶质细胞中差异性过表达6，并在人类癫痫组织的星形胶质细胞中与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）存在蛋白共表达现象13。
本方案描述了通过荧光激活核分选（FANS）同时分离新皮层富集的神经元和星形胶质细胞核群体的方法。首先对来自成人皮层的未经固定的速冻（即新鲜冷冻）&#160;死后组织进行机械和化学解离。经裂解及蔗糖梯度超速离心后，弃去细胞质和细胞外成分，保留细胞核。随后，使用与目标谱系相对应的荧光标记核抗体对细胞核进行标记，并通过FANS进行分选。采用该方法，所收集的PAX6+NeuN-细胞核群体中星形胶质细胞富集效果得到证实，并通过靶向qPCR检测以及后续的核RNA测序加以验证。

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>抗NeuN抗体 克隆A60</td><td>Millipore</td><td>MAB377A5MI</td><td>小鼠抗NeuN抗体与荧光化合物AF555偶联（激发波长553 nm；发射波长568 nm）</td></tr><tr><td>抗OLIG2抗体 克隆211</td><td>Millipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>小鼠抗OLIG2抗体，偶联荧光染料AF488（激发波长499 nm；发射波长520 nm）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>亮线计数室</td><td>豪泽科学</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网，40 &amp;micro;M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA文库试剂盒</td><td>Illumina，Nextera</td><td>FC-121&amp;ndash;1030</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶I</td><td>沃辛顿</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>邓氏组织研磨器</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS 分选仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>四水合乙酸镁</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6（PAX6/496）- 100 次检测</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA纯化 &amp;和浓缩器</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 去污染溶液</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input 哺乳动物</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>片段化时间为2.5分钟，适用于RIN值较低的RNA。</td></tr><tr><td>蔗糖，结晶级，ACS，500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 摇摆桶转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl，1 M 溶液，pH 8.0，分子生物学级，超纯</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>TRIzol LS 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>RNA提取试剂</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特 Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管 PP 9/16 × 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>超纯去离子水（无RNA酶、无DNA酶）</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>称为蒸馏水</td></tr><tr><td>超纯EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

在原代人类组织中，星形胶质细胞的复杂性仍缺乏明确界定，亟需更优的工具以实现其分离和分子表征。荧光激活细胞核分选（FANS）可用于成功分离和研究来自冷冻保存组织的人类神经元细胞核（NeuN+）群体，从而避免处理&#160;新鲜组织所伴随的问题。然而，目前尚缺乏类似方法用于从非神经元（NeuN-）成分中有效分离星形胶质细胞。一种近期开发并经过验证的免疫标记策略，利用三种转录因子抗体，可同时从非疾病状态的新鲜（未固定）速冻&#160;人死后颞叶新皮质组织中，富集分离出神经元（NeuN+）、星形胶质细胞（配对盒蛋白6（PAX6）+NeuN-）以及少突胶质细胞前体（OLIG2+NeuN-）细胞核群体。
该技术已被证明可用于表征原发性病理性癫痫新皮层中细胞类型特异性的转录组改变。转录组分析证实，PAX6+NeuN-分选群体显著富集了泛星形胶质细胞标志物，并能够在静息和反应性状态下捕获星形胶质细胞。本文描述了从新鲜冷冻的人类皮层组织中分离富集星形胶质细胞核群体的FANS方法，包括将组织解离为单核（sn）悬液；使用荧光标记的抗NeuN和抗PAX6抗体对细胞核进行免疫标记；FANS分选过程中的门控策略及质量控制指标，以优化分选的灵敏度和特异性，并确认星形胶质细胞的富集效果；以及推荐用于后续批量或单核分辨率的转录组和染色质可及性测序的样本制备方案。该方案适用于多种病理状态下的非坏死性新鲜冷冻人类皮层标本，建议死后组织采集时间在24小时内完成。

从死后12小时采集的新鲜（未固定）速冻颞叶新皮层组织中分离出细胞核。组织经解离形成细胞核悬液后，样本与针对NeuN、PAX6和OLIG2的抗体孵育，并根据图1和图2所示的设门策略进行分选。从NeuN+、PAX6+NeuN-和OLIG2+NeuN-分选的细胞群中收集细胞核（图1E、F和图2F）。靶向qPCR检测结果显示，在PAX6+(NeuN-)细胞群中，泛星形胶质细胞标志物GFAP和ALDH1L1显著富集（图1G和图2H）。此外，OLIG2+细胞群中少突胶质前体细胞（OPC）标志物PDGFRA表达富集（图1G）。对分选细胞群进行的批量RN...

我们开发了一种方法，可从新鲜冷冻组织中富集并分离人星形胶质细胞群体，用于后续分子分析。

人类星形胶质细胞在原代人体组织中的复杂性仍缺乏明确定义，需要更优的工具以实现其分离和分子分析……

本方案可帮助希望研究人类星形胶质细胞在其原生微环境中分子功能的科学家。该技术的主要优势在于，可通过荧光激活细胞核分选技术，从大量人脑组织样本中分离并富集特定细胞类型——成年星形胶质细胞。该方法也可用于从人新皮层中分离其他细胞类型，例如使用其他合适的荧光标记抗体来分离神经元和少突胶质前体细胞。从新鲜冷冻的人类成年皮质组织样本中开始解剖约 200 至 400 毫克的组织。将组织放入一个含有 4 毫升预冷裂解缓冲液的 7 毫升玻璃匀浆器中，置于冰上，匀浆约 50 次。将匀浆液转移至一个 12 毫升的超速离心聚丙烯管中。使用5毫升移液管将6.5毫升预冷的蔗糖缓冲液沿超速离心管管壁缓慢加入管底，注意不要扰动蔗糖与组织匀浆之间的界面。为收集细胞核，将裂解液在101,814 ×g条件下超速离心1小时，随后小心吸除上清液及碎片，注意不要扰动沉淀。在超速离心管中加入含0.1% BSA的PBS溶液，冰上孵育10分钟，然后重悬细胞核沉淀。然后，使用台盼蓝在光学显微镜下观察完整的细胞核，并确保细胞核浓度高于每毫升10的5次方个。对于分离细胞核的荧光激活分选，将约20微升重悬的样品加入含有Alexa Fluor 555标记的小鼠抗NeuN抗体的抗体溶液中。另取约20微升重悬的样品加入含有APC标记的小鼠抗PAX6抗体的抗体溶液中。所有样品及对照组在4°C条件下避光振荡孵育1小时后，按1:1000的比例加入DAPI。为了包含适当大小的细胞核并排除红细胞和碎片，请使用对照管根据前向散射面积和侧向散射面积对细胞进行设门。为了选择单细胞核群体，根据前向散射面积与前向散射宽度或高度，以及侧向散射面积与侧向散射宽度或高度进行设门。通过DAPI设门，仅包含完整的单个细胞核，排除任何碎片和双联体。在根据任何额外的荧光对照设门后，运行仅含DAPI的对照样本。运行仅含NeuN Alexa Fluor 555的对照，以确定Alexa Fluor 555通道中NeuN阳性染色的阈值。运行仅含PAX6 APC的对照，以确定APC通道中PAX6阳性染色的阈值。在完成所有对照实验后，圈选 NeuN 阳性细胞以收集神经元，并将 PAX6 阳性细胞与 NeuN 阴性群体结合圈选以收集星形胶质细胞。从 NeuN 阴性且 PAX6 阴性的群体中圈选并收集其他感兴趣的胶质细胞亚群。对于大批量单核 RNA 测序，在收集 50,000 至 500,000 个细胞核至含 0.04% BSA 的 PBS 缓冲液后，向样本中加入 2 毫升蔗糖溶液、50 微升 1 摩尔氯化钙溶液和 30 微升 1 摩尔醋酸镁溶液。用 PBS 将悬浮液的终体积调至 10 毫升。通过倒置混匀管内物质，并将反应物置于冰上孵育 15 分钟。通过离心收集细胞核，并将细胞核重悬于 1 毫升 RNA 提取试剂中。然后，涡旋混匀管内样品，将样本在干冰上冷冻，并将细胞

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科研

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Neuroscience

神经科学

使用荧光激活的细胞核分选从新鲜冷冻的皮质中分离出成年人类星形胶质细胞群

在本视频中，我们介绍了从新生小鼠中获取纯化星形胶质细胞的方法。...

星形胶质细胞分离：一种获取小鼠皮层星形胶质细胞纯品的方法

该视频展示了一种从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的简单方法。在培养过程中，通过使用星形胶质细胞特异性培养基并抑制非星形胶质细胞的贴壁，该方法可选择性地培养星形胶质细胞。这些培养的星形胶质细胞呈现星状形态，并具有细长的突起。...

一种分离和培养小鼠星形胶质细胞的简易技术

本视频演示了使用荧光激活细胞核分选（FANS）从新鲜冷冻的人脑组织中分离和分选细胞核的实验步骤，该方法可用于研究不同细胞群体在多种神经科学领域的应用。...

使用荧光激活细胞核分选技术从脑组织中分离细胞群体

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。...

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

在此，我们介绍一种从新生小鼠（出生第1天）中分离小胶质细胞的实验方案 体外...

快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

此处描述的AWESAM方案是快速、简便且经济地从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的最佳方法。AWESAM星形胶质细胞表现出自发性Ca2+ 与星形胶质细胞相似的信号传导、形态及基因表达谱 体内.

培养 在体 内使用快速、简单且经济的AWESAM方案培养类小鼠星形胶质细胞

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文介绍了一种详细的实验方案，用于培养出生后小鼠中枢神经系统不同区域来源的高度富集的星形胶质细胞，并通过强制表达转录因子将其直接转化为功能性神经元。...

小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。...

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

学习使用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻人脑皮层中分离成年星形胶质细胞核，该方法可获得高纯度细胞群用于转录组学和染色质可及性分析，助力研究健康和疾病状态下星形胶质细胞的分子功能。

利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

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