Name: 探索病毒感染时的m6A和m5C表继转录组:HIV示例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 探索m6A和m5C表观转录组在HIV病毒感染中的分析方法。本研究利用HIV载体感染人源细胞，通过meRIP-Seq和亚硫酸氢盐转化技术，揭示病毒与宿主相互作用的新机制，为病毒学研究提供重要资源。

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本工作由瑞士国家科学基金会（资助号 31003A_166412 和 314730_188877）资助。

<ol><li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 262-267 (2013).</li>
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<li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+marks%3A+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576(2020).</li>
<li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li>
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<li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+%286%29-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li>
<li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li>
<li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li>
<li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215(2013).</li>
<li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1(2017).</li>
<li>Endrullat, C., Glökler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+%26+Translational+Genomics%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied & Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li>
<li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12(2009).</li>
<li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22biorxiv%22%5BJournal%5D)">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
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<li>Okonechnikov, K., Conesa, A., García-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualimap+2%3A+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), Oxford, England. 292-294 (2016).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), Oxford, England. 3047-3048 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137(2008).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+Journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeqKit%3A+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA%2FQ+File+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962(2016).</li>
<li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meRanTK%3A+methylated+RNA+analysis+ToolKit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

RNA修饰在病毒感染中的作用目前仍 largely 未知。深入理解表观转录组修饰在病毒感染背景下的作用，可能有助于寻找新的抗病毒治疗靶点。
在本研究中，我们提供了一个完整的工作流程，可用于分析感染细胞中m6A和m5C的表观转录组。根据具体的生物学问题，我们建议使用poly-A筛选的RNA作为起始材料。尽管该流程也可使用总RNA进行（此步骤为可选），但需注意的是，rRNA以及小RNA具有高度修饰性，含有大量甲基化残基，这可能导致有意义的测序数据在质量和数量上下降。
然而，如果研究的重点是非多聚腺苷酸化RNA，则应调整RNA提取步骤，以避免丢弃小RNA（在基于柱法的RNA提取中），并优先采用核糖体耗竭技术而非多聚A选择技术进入后续流程。
为了确保获得高质量的 RNA、正确的片段化以及适用于文库构建的 m6A 富集和亚硫酸氢盐转化 RNA 的质量，我们强烈建议使用片段分析仪或生物分析仪。然而，此类设备并非总是可用。作为替代方案，可通过琼脂糖凝胶电泳观察来评估 RNA、mRNA 的质量以及片段化后 RNA 的大小。此外，也可在不预先检测 RNA 量的情况下直接进行文库构建。
我们采用基于抗体的MeRIP-Seq16技术来研究m6A表观转录组景观。该技术基于RNA免疫沉淀，已被证实有效；然而，其中某些步骤需要仔细优化，可能至关重要。尽管已有研究指出m6A甲基化主要发生在RRA*CH共识序列内，但该基序在mRNA分子中出现频率很高，无法实现甲基化位点的精确定位。因此，获得可重复且一致的RNA片段化，生成较小的RNA片段，对于提高基于RIP的分辨率至关重要。在本实验方案中，我们推荐一种经过优化的流程，在我们的实验条件下可获得可重复且一致的结果；然而，该片段化步骤可能需要根据具体样本特征进一步优化。
最近描述了一种允许m6A直接测序的新技术。该技术基于使用特定的逆转录酶变体，这些变体在遇到m6A RNA修饰时会表现出独特的逆转录特征24。该技术经过仔细优化后，有望克服MeRIP-Seq面临的主要局限性（减少起始材料用量并实现更高分辨率）。为了研究m5C修饰，我们决定采用亚硫酸氢盐转化技术，以在核苷酸分辨率水平上检测被修饰的胞嘧啶残基。为了降低因RNA二级结构存在而导致的假阳性率，我们进行了3轮变性/亚硫酸氢盐转化，并利用ERCC外参对照进一步控制亚硫酸氢盐转化效率。该技术的一个局限性在于，亚硫酸氢盐转化条件非常剧烈，三轮变性/亚硫酸氢盐转化可能导致部分RNA降解，从而降低分辨率。然而，在本实验设置中，我们选择接受可能略低的分辨率，以提高数据集的整体质量。
得益于这些优化和对照措施，我们能够提供一种可靠且严谨的工作流程，可用于研究表观转录组景观及其在病毒感染、宿主-病原体相互作用或任何特定处理暴露条件下的改变。

它&#160;众所周知，RNA分子可发生修饰，迄今为止已发现超过150种转录后修饰1它们包括将化学基团（主要是甲基）添加到RNA分子中嘧啶和嘌呤环的几乎所有位置2此类转录后修饰已被证实高度富集于转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA），并最近也在信使RNA（mRNA）分子上被发现。
新一代测序技术（NGS）的发展以及特异性识别特定化学修饰的抗体的制备，首次使得在转录组范围内研究特定化学修饰的位置和频率成为可能。这些进展加深了人们对RNA修饰的理解，并实现了对mRNA分子上多种修饰的定位与图谱绘制3,4。
尽管表观遗传学研究DNA和组蛋白修饰在转录组调控中的作用，表观转录组学则类似地关注RNA修饰及其功能。表观转录组学的研究&#160;修饰作用为揭示可能调控多种细胞过程（如RNA剪接、转运、稳定性和翻译）的新型调控机制提供了新的机遇5因此，最近的研究发现病毒侵染期间细胞RNA和病毒RNA上均存在大量表观转录组修饰，这并不令人意外。6迄今为止研究的病毒包括DNA病毒和RNA病毒；其中，HIV可被视为一个开创性的例子。总体而言，在病毒感染背景下发现的RNA甲基化可能有助于研究尚未阐明的病毒表达或复制机制，从而为控制这些病毒提供新的工具和靶点7.
在HIV表观转录组学领域，病毒转录本的修饰已被广泛研究，结果表明此类修饰的存在有利于病毒复制8,9,10,11,12,13。目前已有多种技术可用于在全转录组水平上检测表观转录组修饰。其中最常用的技术是基于免疫沉淀的方法，如MeRIP-Seq和miCLIP，用于m6A的鉴定。MeRIP-Seq依赖于RNA片段化以捕获含有甲基化残基的片段，而miCLIP则基于RNA-抗体紫外交联后产生α-m6A抗体特异性突变特征，从而实现更精确的定位。
m5C 修饰的检测可通过类似于 m6A 检测的抗体依赖性技术（即 m5C RIP）、亚硫酸氢盐转化、AZA-IP 或 miCLIP 方法实现。Aza-IP 和 m5C miCLIP 均利用特定的甲基转移酶作为“诱饵”，在 RNA 甲基化过程中靶向 RNA。在 Aza-IP 中，靶细胞被暴露于 5-氮杂胞苷，导致新生 RNA 中随机引入胞苷类似物 5-氮杂胞苷位点。在 miCLIP 中，NSun2 甲基转移酶&#160;经过基因改造，携带 C271A 突变14,15。
本研究以HIV为模型，聚焦于感染细胞中m6A和m5C修饰的双重表征。经过方法学优化，我们建立了一种整合甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）与RNA亚硫酸氢盐转化（BS）的工作流程，可在转录组范围内同时探索宿主细胞与病毒环境中的m6A和m5C表观转录组标记。该工作流程既可用于细胞RNA提取物，也可用于从病毒颗粒中分离的RNA。
甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）16 可用于研究 m 的方法6在转录组水平上的研究已得到充分确立，并且存在一系列 m6目前市面上已有商品化的A特异性抗体17该方法包括对 m 的选择性捕获6使用含A的RNA片段进行m6特异性抗体。该技术的主要缺点有两个：（i）分辨率有限，其高度依赖于RNA片段的大小，因此只能提供含有甲基化位点的近似位置和区域；（ii）进行分析所需的起始材料量较大。在以下优化的实验方案中，我们将RNA片段大小标准化至约150 nt，并将起始材料用量从目前推荐的10 µg poly-A筛选RNA减少至仅需1 µg poly-A筛选RNA。同时，我们还提高了m6通过与特定抗体结合的RNA片段，并采用竞争性洗脱方法进行分离6使用肽而非基于苯酚的技术或蛋白酶K等更常规但特异性较低的洗脱方法。然而，这种RIP-based检测的主要局限性仍然是分辨率不够理想，无法精确识别发生修饰的A核苷酸。
目前可通过两种不同方法对m5C修饰进行分析：一种是基于RIP（RNA免疫沉淀）的m5C特异性抗体方法，另一种是RNA亚硫酸氢盐转化法。由于RIP方法在鉴定甲基化位点方面分辨率有限，因此我们采用了可实现单核苷酸分辨率的亚硫酸氢盐转化法。RNA暴露于亚硫酸氢盐（BS）时，会引起胞嘧啶脱氨，从而将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。因此，在RNA亚硫酸氢盐转化反应中，所有未甲基化的胞嘧啶均被脱氨并转化为尿嘧啶，而胞嘧啶第5位上的甲基具有保护作用，可防止BS诱导的脱氨反应，从而保留胞嘧啶残基。基于BS的方法能够在单碱基分辨率下检测m5C修饰的核苷酸，并评估每条转录本的甲基化频率，从而揭示m5C修饰的动态特征18。然而，该技术的主要局限在于甲基化位点的假阳性率。实际上，BS转化仅对单链RNA中可及的胞嘧啶残基有效。然而，若RNA存在紧密的二级结构，则可能掩盖N5C位点，阻碍BS转化，导致未甲基化的胞嘧啶未能转化为尿嘧啶，从而产生假阳性结果。为解决这一问题并降低假阳性率，我们进行了三轮变性与亚硫酸氢盐转化循环19。此外，我们在样品中引入了两个对照，以评估亚硫酸氢盐转化效率：一方面加入ERCC测序对照（非甲基化的标准化且商业可得的序列）20以及poly-A耗尽的RNA，用于评估亚硫酸氢盐转化率；另一方面通过RT-PCR验证28S核糖体RNA上一个已知且高度保守的甲基化位点C4447的存在21。
在病毒学领域，将这两种表观转录组学研究方法与下一代测序技术及精确的生物信息学分析相结合，可实现对m6A 和 m5碳动态（即病毒感染后可能发生的RNA修饰时间动态变化，并揭示一系列具有临床治疗潜力的新靶点。

<table><tbody><tr><td>AccuPrime Pfx SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>12344-040</td><td></td></tr><tr><td>抗m6A抗体_克隆17-3-4-1</td><td>Millipore</td><td>MABE1006</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>默克</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>ERCC</td><td>Invitrogen</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>EZ RNA甲基化检测试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>EZR5001</td><td></td></tr><tr><td>Fragment analyzer RNA试剂盒 - 高灵敏度RNA试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>DNF-472-0500</td><td></td></tr><tr><td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>DNF-471-0500</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>应用生物系统公司</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq 链特异性 mRNA</td><td>Illumina</td><td>20020594</td><td></td></tr><tr><td>磁珠A/G混合液</td><td>默克</td><td>16-663</td><td></td></tr><tr><td>N6-甲基腺苷，5&amp;prime;-单磷酸钠盐（m6A）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2780-10MG</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠 IgG</td><td>Merk</td><td>12371</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>61005,</td><td></td></tr><tr><td>PCRapace</td><td>Stratec</td><td>1020220300</td><td></td></tr><tr><td>Quick RNA病毒提取试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>1034</td><td></td></tr><tr><td>RNA纯化 &amp;和浓缩器</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>RNA片段化试剂</td><td>Ambion</td><td>AM8740</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Ambion</td><td>AM2684</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>TRIzol试剂</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

探索病毒感染期间的 m6a 和 m5c 表观转录组：以 hiv 为例

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

近年来，RNA修饰在生物过程中的作用受到越来越多研究的关注，这一领域如今被称为表观转录组学。其中，mRNA分子上的N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA修饰已被广泛报道，可能参与调控细胞过程。因此，表观转录组学构成了除转录组分析之外必须考虑的新型调控层面，因为其同样可因暴露于各种化学或生物因子（包括病毒感染）而发生改变或受到调控。
本文介绍了一种工作流程，可同时分析感染或未感染人类免疫缺陷病毒（HIV）细胞中 m6A 和 m5C 修饰的联合细胞与病毒表观转录组景观。从感染和未感染 HIV 的细胞中分离并片段化 mRNA 后，我们采用了两种不同的方法：MeRIP-Seq（一种基于 RNA 免疫沉淀的技术），用于富集含有 m6A 修饰的 RNA 片段；BS-Seq（一种基于亚硫酸氢盐转化的技术），用于在单核苷酸分辨率下鉴定 m5C 修饰。在进行甲基化特异性捕获后，构建 RNA 文库用于高通量测序。我们还开发了专用的生物信息学分析流程，可独立于转录本的基础表达谱来识别差异甲基化（DM）转录本。
总体而言，该方法能够同时探索多种表观转录组修饰，并提供病毒感染或其他细胞扰动条件下差异修饰转录本的图谱。这一方法为发现细胞应答中的新参与者和新机制提供了新的机遇，例如促进或限制病毒复制的宿主因子。

该实验流程已被证明可用于研究m6A和m5C甲基化在HIV感染背景下的作用。为此，我们采用了一种CD4+ T细胞系模型（SupT1），将其分为感染HIV与未处理两组。每种条件下起始使用5000万个细胞，最终获得平均约500 µg总RNA，RNA质量数为10（图1A-B）。经过poly-A筛选后，每种条件下回收得到10至12 µg的mRNA（约占总RNA的2%）（图1B）。此时，我们取5 µg经poly-A富集的RNA用于MeRIP-Seq流程，另取1 µg用于BS-Seq流程。由于HIV RNA具有多聚腺苷酸化特征，无需额外处理，可直接进行MeRIP-Seq和BS-Seq操作。
<img alt="RNA提取流程示意图；mRNA筛选与测序步骤；数据图显示RNA纯度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：下游应用的RNA制备。A) 显示RNA制备及用于同时进行MeRIP-Seq和BS-Seq流程的示意图。每个实心六边形代表一种RNA修饰类型，例如m6A（绿色）或m5C（粉色）。图中标注了实验所需RNA材料的用量。B) 代表性结果，展示总RNA提取（上图）和poly-A筛选（下图）后预期的RNA分布特征（片段大小和数量）。样品使用标准灵敏度试剂盒在片段分析仪上进行检测，以评估进入特定MeRIP-Seq和BS-Seq步骤前的RNA质量。RQN：RNA质量数；nt：核苷酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
MeRIP-Seq 流程是一种基于RNA免疫沉淀的技术，可用于研究RNA分子上m6A修饰的分布情况。该方法首先将RNA片段化，然后与偶联磁珠的m6A特异性抗体共同孵育，以进行免疫沉淀和捕获。对MeRIP富集的RNA片段以及未经处理的输入样本（input）进行测序并比较，从而鉴定出发生m6A修饰的RNA区域，进而识别m6A甲基化的转录本（图2A）。该技术的分辨率依赖于RNA片段化的效率，较短的片段有助于更精确地定位m6A修饰位点。在此实验中，细胞内poly-A筛选的RNA和病毒RNA在20 µL终体积中，使用RNA片段化缓冲液进行离子介导的片段化处理15分钟，获得长度为100–150 nt的RNA片段。从5 µg mRNA起始，回收得到4.5 µg片段化RNA，回收率达90%（图2B）。取100 ng片段化并纯化的RNA作为输入对照，直接用于文库构建和测序。剩余RNA（约4.4 µg）则按照MeRIP-Seq流程进行处理，即先将片段化RNA与连接了抗m6A特异性抗体的磁珠或作为对照的抗IgG抗体磁珠共同孵育。使用2.5 µg片段化RNA进行m6A特异性RIP（MeRIP），可回收约15 ng富集m6A的RNA材料，用于后续文库构建和测序（图2B）。如预期所示，使用抗IgG抗体作为对照的RIP未能获得足量RNA，无法进行进一步分析（图2B）。
<img alt="MeRIP-Seq mRNA分析；m⁶A RIP示意图显示测序方法、数据分析和比较结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：MeRIP-Seq 流程图。 A) MeRIP-Seq 实验流程及输入对照的示意图。经 poly-A 筛选后，样本被片段化为 120–150 nt 的片段，其中一部分直接用于测序（100 ng，输入对照），另一部分用于RNA免疫沉淀（2.5 µg，RIP），后者使用抗-m6A 特异性抗体或抗-IgG 抗体作为阴性对照，随后进行测序。 B) 代表性结果展示片段化后（上图）和免疫沉淀后（下图，MeRIP：左，IgG 对照：右）预期的RNA分布谱（大小和含量）。样品经片段分析仪检测以评估RNA质量和浓度，再进行文库构建和测序。片段化RNA分析采用RNA标准灵敏度试剂盒，免疫沉淀RNA则使用高灵敏度试剂盒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
BS-Seq 分析流程可在核苷酸分辨率水平上探索 RNA 的 m5C 修饰，并实现对 m5C 甲基化转录本的鉴定。经亚硫酸氢盐转化后，未甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变（图 3A）。由于亚硫酸氢盐转化过程的反应条件较为剧烈（即 高温和低 pH），转化后的 mRNA 会出现严重降解（图 3B），但该降解现象不会影响文库构建与测序。亚硫酸氢盐转化仅对单链 RNA 有效，因此可能受到双链 RNA 二级结构的阻碍。为评估胞嘧啶向尿嘧啶转化的效率，我们引入了两个对照。作为阳性对照，我们利用了先前报道的 28S rRNA 第 4447 位胞嘧啶高度甲基化的特征23。通过 RT-PCR 扩增并测序包含该甲基化位点在内的约 200 bp 片段后，我们观察到除第 4447 位的胞嘧啶保持不变外，其余所有胞嘧啶均成功转化为尿嘧啶，因此在 DNA 序列中表现为胸腺嘧啶。为控制亚硫酸氢盐转化率，我们使用了 commercially available synthetic ERCC RNA 序列作为对照。该混合物包含一组已知的、未甲基化且带有 poly-A 尾巴的 RNA 序列，具有多样的二级结构和长度。在完成文库构建与测序后，我们重点分析这些 ERCC 序列，通过统计所有 ERCC 序列中每个样本内总胞嘧啶残基中被转化的 C 数量，计算转化率。我们获得的转化率达到 99.5%，证实了亚硫酸氢盐转化反应的高效性与成功（图 3D）。
<img alt="亚硫酸氢盐转化过程，mRNA测序示意图，DNA分析，转化率图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：BS-Seq分析流程。A) BS-Seq工作流程示意图。经过poly-A筛选后，样本经亚硫酸氢盐处理，导致未甲基化的胞嘧啶（C）残基发生脱氨反应，转化为尿嘧啶（U）。相比之下，甲基化的胞嘧啶残基（m5C）不受亚硫酸氢盐处理影响，保持不变。B) 使用标准灵敏度试剂盒在片段分析仪上分析亚硫酸氢盐转化后RNA的分布情况（大小和含量）的代表性结果。C) 毛细管电泳图显示对28S rRNA中第4447位100%甲基化胞嘧啶（以蓝色高亮）周围区域进行RT-PCR扩增产物的代表性测序结果。相比之下，参考序列中的胞嘧啶残基因成功发生亚硫酸氢盐转化，在扩增子序列中被识别为胸腺嘧啶（T）残基。D) 通过分析HIV感染与非感染细胞中ERCC外参序列评估C-U转化率。平均转化率达到99.5%。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
经过m6A富集、亚硫酸氢盐转化的样本以及输入对照样本将进一步进行文库构建、测序和生物信息学分析（图4）。根据实验设计和所研究的生物学问题，可应用多种生物信息学分析方法。作为原理验证，本文展示了一种潜在应用（即，差异甲基化分析）的代表性结果，该分析聚焦于鉴定HIV感染后诱导产生的差异甲基化转录本。简而言之，我们在未感染和HIV感染的细胞中，独立于基因表达水平，分别考察了转录本的m6A或m5C甲基化水平，以进一步理解RNA甲基化在病毒生命周期中的作用。在对基因表达数据进行标准化后，我们发现ZNF469转录本的m6A甲基化状态随感染状态而变化：该转录本在未感染细胞中未发生甲基化，而在HIV感染后则出现多个甲基化峰（图5A）。对m5C的类似差异甲基化分析显示，PHLPP1转录本包含多个甲基化位点，且在HIV感染条件下更倾向于发生甲基化（图5B）。上述结果表明，HIV感染会影响细胞的表观转录组。
<img alt="m6A 和 m5C RNA 测序流程；流程图、FASTQ 文件处理、比对、峰检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：m6A 和 m5C 数据分析的生物信息学流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ZNF469、PHLPP1的基因组定位；HIV整合、序列变异图谱、染色体分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：感染后差异甲基化转录本的示例。A) 代表性结果显示HIV感染细胞（绿色）与未感染细胞（灰色）中ZNF459转录本的m6A甲基化情况。y轴显示经输入表达量校正后的峰强度，x轴显示染色体上的位置。差异甲基化分析表明，ZNF469转录本在HIV感染后呈现高甲基化。 B) HIV感染细胞（上排）与未感染细胞（下排）中m5C甲基化基因的代表性结果。每个条形的高度代表每个核苷酸的测序读段数，用于评估覆盖度。每个C残基以红色表示，甲基化的C比例以蓝色表示。每个C残基上方标出了确切的甲基化率（%）。箭头标示出具有统计学显著性的差异甲基化C位点。样本使用IGV浏览器进行可视化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

RNA修饰在病毒感染中的作用刚刚开始被探索，可能揭示新的病毒-宿主相互作用机制。在本研究中，我们提供了一种用于研究病毒感染背景下m6A和m5C RNA修饰的分析流程。

探索病毒感染期间的 m6A 和 m5C 表观转录组：以 HIV 为例

近年来，RNA修饰在生物过程中的作用已成为越来越多研究关注的焦点，如今这一领域被称为……

您好，在本视频中，我们将向您展示如何在病毒感染后研究 m6A 和 m5C 表观转录组。实验开始时，您需要准备 5000 万个未感染的细胞和 5000 万个感染的细胞。为了在分析后获得高质量的数据集，您需要实现全面的感染。在此，我们用基于HIV的载体感染这些细胞，并通过FACS检测病毒编码的GFP。在此情况下，我们获得了80%的感染细胞，并开始进行后续流程，首先提取总RNA。因此，我们将细胞分成每份1000万个细胞的等分试样，每份加入1 mL Trizol进行裂解。然后向细胞裂解液中加入 200 µL 氯仿，通过倒置混匀。此时，将裂解液在室温下静置 3 分钟，随后将所有样品在 4 °C 下高速离心 15 分钟。此时应观察到分为三层的不同相，如图所示。RNA位于上层水相中，因此需小心地将水相转移至新的离心管中，注意避免转移有机相。随后向水相中加入0.5 mL异丙醇，并通过轻柔颠倒充分混匀。样品可在80°C孵育1小时，以确保RNA充分沉淀。高速离心后，应能看到清晰的RNA沉淀，如图所示。通过倒置或移液小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀。随后用1 mL 75%分子生物学级乙醇洗涤RNA沉淀。然后短暂涡旋混匀样品。离心后，确保获得一个完整的白色RNA沉淀。弃去上清液，将RNA沉淀在室温下干燥15分钟。将每个沉淀重悬于20 µL水中，并将相同条件下的所有样品合并在一起。总RNA现在可用于通过poly-A选择进行mRNA分离。对于每75 µg RNA的样品，准备200 µL寡核苷酸-dT磁珠，并用1 mL结合缓冲液洗涤磁珠。将试管置于磁力架上，使磁珠在一次混匀过程中结合至磁铁。弃去上清液，并重复该步骤进行第二次洗涤。随后将磁珠从磁力架上取下，小心地重悬于100微升结合缓冲液中。此时，通过将RNA样品分装，每份含有75微克RNA，并重悬于100微升水中，以制备RNA样品。加入100微升结合缓冲液，在65摄氏度孵育2分钟。然后离心样品，并置于冰上孵育。随后，向每个RNA样本中加入100 µL洗涤后的磁珠，于室温下在旋转仪上孵育15分钟，使RNA与磁珠结合。孵育结束后，将离心管放回磁力架上，静置1分钟。然后将上清液转移至新的离心管中，留作第二轮分离使用。用 200 微升洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次，然后进行洗脱。为从磁珠上洗脱 poly-A 选择的 RNA，向每个样品中加入 20 微升冰上预冷的 TRIS HCl，并小心吹打。随后将样品在 80 摄氏度孵育 2 分钟，以释放 RNA。将含有经多聚腺苷酸选择的RNA的上清液转移至新的离心管中，注意避免磁珠的污染。为了提高mRNA得率，洗脱步骤以及分离步骤均应重复两次。此时mRNA已准备好，可直接进入meRIP-Seq流程的片段化步骤，或直接进行亚硫酸氢盐转化。进入meRIP-Seq流程的第一步是mRNA片段化。为此，您需要将五微克mRNA分装至0.2 mL离心管中，每管18微升。为了确保数据的一致性，操作时必须迅速，并且每次仅处理少量样品。本实验中，已对片段化条件进行优化，以获得长度在115至200个核苷酸之间的片段。然后向每个含有18 µL mRNA的离心管中加入2 µL片段化试剂，注意将液滴加在管壁上。将所有样品短暂离心，使试剂与RNA同时接触，并在70°C下孵育15分钟。孵育结束后，加入 2 µL 0.5 M EDTA 以终止反应。此时，可使用您选择的方法纯化片段化的 mRNA，并通过片段分析仪进行 RNA 质量控制。此步骤为可选步骤，但可在进行 RNA 沉淀前评估片段的大小。如您在此处第四泳道所见，我们获得的两个样本片段大小均约为150个核苷酸。随后我们进行了meRIP-Seq实验。第一步是将A/G磁珠与抗m6A抗体或IgG对照分别偶联。针对每个反应方案，将25 µL磁珠转移至新的离心管中。请注意，您至少需要设置一个m6A特异性条件和一个对照条件。用250 µL IP缓冲液洗涤每份25 µL磁珠。用移液器轻轻吹打重悬磁珠，将离心管置于磁力架上静置1分钟，使磁珠充分分离。小心移除并弃去上清液，注意不要吸到磁珠，重复洗涤步骤一次。随后，每25微升原始磁珠体积加入100微升免疫沉淀缓冲液（IP buffer），重悬磁珠。为每种条件准备并标记一个离心管。在本实验中，感染组需要两个离心管，分别用于m6A和IgG对照，未感染组也需要两个离心管。然后向每个离心管中加入100 µL洗涤后的磁珠。磁珠现已准备好与特异性抗体或IgG对照偶联。向每管含有100 µL洗涤后磁珠的溶液中加入5 µg的特异性抗m6A抗体或抗IgG对照抗体。将各管置于旋转仪上孵育30分钟，使抗体与磁珠结合。同时，进行样品制备。针对每个预设条件（m6A特异性或IgG对照），起始材料为2.5 µg重悬于100 µL水中的片段化mRNA。为达到500 µL的终反应体积，向每个样品中加入295 µL水。加入5微升浓度为40单位/微升的RNase抑制剂，使每份样品总量达到200单位，轻轻混匀。最后向每根试管中加入100微升5倍浓缩的IP缓冲液。样品现可进行免疫沉淀反应。从旋转轮上取出与抗体偶联的磁珠，并进行离心沉淀。将500微升预先制备的样品加入到每100微升与特异性抗体偶联的磁珠中。用移液器轻轻吹打数次，充分重悬磁珠。将样品或meRIP反应液置于4°C的旋转摇床上孵育两小时。孵育结束后，短暂离心各管，然后将其置于磁力架上静置一分钟，使磁珠充分分离。随后移除未结合的上清部分，转移至新的离心管中，如需要可保存用于后续分析。从磁力架上取下磁铁，将所有样品重悬于500 µL免疫沉淀缓冲液中。通过上下吹打小心地重悬每个样品。将磁铁插入磁力架，孵育1分钟，然后小心地移除上清液。重复洗涤两次，然后进行洗脱。每对样品（m6A特异性样品和对照样品）准备225微升洗脱缓冲液，其中含有20毫摩尔的纯化m6A。然后每份样品加入100微升洗脱缓冲液。将所有样品在4°C条件下于摇床上孵育一小时。然后将富集的m6A RNA样品收集至新的离心管中，并进行第二轮洗脱。使用您选择的方法纯化m6A富集的RNA，此时样品已准备好进行文库构建和测序。为了研究m5C修饰，我们采用亚硫酸氢盐转化法。实验起始使用500纳克的poly-A尾化RNA。尽管为可选步骤，向样品中添加500皮克的poly-A耗竭RNA以确保核糖体RNA的代表性，以及0.5微升市售的合成序列，可在测序后用于评估亚硫酸氢盐转化效率。将样品用水调整至终体积为 20 µL，然后向每个样品中加入 130 µL RNA 转化试剂。通过移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心所有样品，确保管壁上无液滴残留。将所有样品置于 PCR 仪中孵育，进行三个循环：70 °C 变性 5 分钟，54 °C 亚硫酸氢盐转化 45 分钟。通过在空柱中直接加入250微升RNA结合缓冲液和150微升的亚硫酸氢盐转化样本，进行柱上脱氨反应。用移液器反复吹打混合样本，注意不要触碰到柱子的滤膜。将400微升95-100%乙醇直接加入柱中的RNA结合缓冲液混合物中。盖上盖子并立即倒置混匀。将样品离心30秒，弃去流出液。用洗涤缓冲液洗涤柱子，然后向每个柱子的中心加入200 µL脱磺酸化溶液。将所有样品在室温下孵育30分钟。将样品以30秒离心，随后进行两轮洗涤。向每个样品中加入400 µL洗涤缓冲液，以最高速度离心30秒，弃去流出液。将柱子放入新的空离心管中，并用 20 µL 水洗脱亚硫酸氢盐转化后的 RNA。通过 RT-qPCR 检测亚硫酸氢盐转化效率，然后进行文库构建和测序。经过生物信息学分析后，以下是使用该工作流程可能获得的一些结果示例。在此，我们比较了感染HIV的细胞与未感染细胞在感染后24小时的表观转录组。在A图中，您可以观察到我们对m6A表观转录组进行分析所获得的结果。在此图中，我们绘制了通过 meRIP-Seq 分析获得的 m6A 富集序列读数。可以清晰地看到，一个锌指结构在感染后 24 小时出现高甲基化。我们在面板 B 中对 m5C 表观转录组研究进行了相同类型的分析。在此图中，每个未甲基化的胞嘧啶以红色显示，而已发生 m5C 甲基化的胞嘧啶比例以蓝色显示。如您所见，PHLPP1 基因在 HIV 感染后 24 小时，其三个胞嘧啶均呈现高甲基化状态。总体而言，该实验流程可用于研究感染细胞中 M6A 和 m5C 表观转录组，也可直接应用于病毒颗粒。了解病毒感染如何改变宿主的表观转录组景观，将使我们能够揭示一种全新的调控机制。对病毒感染后差异甲基化转录本的研究将为新的治疗干预提供宝贵的资源。在下方链接中，您可以找到我们关于HIV感染随时间变化过程中差异甲基化转录本研究的开放获取资源。

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