从诱导多能干细胞生成3D全肺类器官，用于模拟肺发育生物学和疾病

本文描述了诱导多能干细胞与含有近端和远端上皮肺细胞以及间充质的三维全肺类器官的逐步定向分化。

该协议使用诱导多能干细胞将它们分化为肺细胞，以便在培养皿中模拟人类肺部疾病和发育。该协议意义重大，因为它很难获得和培养原代人肺组织。将肺细胞与多能干细胞区分开来的主要优点是具有恒定的特定肺细胞供应，以研究人的肺部发育和疾病。

这些细胞可以在细胞培养物中长时间维持，可以冷冻保存以备将来应用，并且可以进行遗传操纵以研究基因突变。演示该过程的将是Rachel McVicar，我实验室的博士候选人。在开始实验之前，在冰上缓慢解冻生长因子还原或GFR基底膜基质培养基，并将其稀释在等体积的冷DMEM F12中。

使用前将 P1000 吸头放入冰箱中冷藏。接下来，用500微升的50%GFR基底膜基质培养基涂12孔板的每个孔，并从孔中除去任何多余的介质混合物和气泡。将孔板放在湿冰或冰箱上，以4摄氏度的温度凝固20分钟，然后将孔板移至37摄氏度的培养箱过夜。

当高PSE达到70%汇合度时，向人诱导多能干细胞中加入10微摩尔ROCK抑制剂Y27632，并在解离前等待一小时。吸出培养基，并用PVS洗涤细胞一次。通过每孔添加500微升细胞分离培养基来解离IPSC，并在5%二氧化碳培养箱中以37摄氏度孵育20分钟。

孵育后，每孔加入500微升干细胞传代培养基。使用P1000吸头轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。然后将解离的细胞转移到15毫升管中，并在300倍G下离心5分钟，离心后，吸出培养基，并用一毫升mTeSR Plus培养基重悬细胞沉淀，并补充10微摩尔ROCK抑制剂。

计数细胞后，向12孔GFR介质包衣板的每个孔中加入两次10到第五IPSC，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天，在添加确定性内胚层或DE诱导培养基之前，先吸走mTeSR Plus。在第二天和第三天，更换DE感应培养基。

第 4 天，通过用无血清基础培养基替代 DE 诱导培养基开始 AFE 诱导。每天更换AFE培养基三天，然后在第六天结束时分析AFE效率。在第七天，在冰上解冻GFR基底膜基质培养基体供以后使用。

同时，通过吸入AFE培养基并用PVS洗涤孔来进行肺祖细胞分化。向孔中加入一毫升细胞分离溶液，并在37摄氏度下孵育10分钟。孵育后，向含有细胞分离溶液的孔中加入一毫升淬灭培养基。

通过轻轻地上下移液来保持细胞为聚集体。确保所有细胞都被移位，但将它们转移到15毫升的锥形管中，以300倍G离心五分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于LPC诱导培养基中。

计数细胞，并向第五个细胞加入2.5次10到100微升冷的GFR基底膜基质培养基中，并充分混合。将液滴放入12孔板的孔中，并在37摄氏度下孵育30至60分钟。接下来，每孔添加一毫升LPC培养基，确保培养基液滴完全浸没并在37摄氏度下孵育过夜。

在第八天，更换LPC培养基以除去ROCK抑制剂Y27632。每隔一天更换一次介质，并在第16天结束时分析LPC效率。在第17天，洗孔并加入500微升，每毫升分散酶2微克。

用P1000移液器移取分散酶混合物并孵育15分钟，然后移取混合物并再孵育15分钟。孵育后，将一毫升淬火培养基加入含有孔的解酶中，并将细胞转移到锥形管中。离心并将沉淀重悬于一毫升冷却的PVS中，然后重复离心。

然后将沉淀重悬于一毫升细胞分离培养基中。将细胞在37摄氏度下孵育12分钟，然后加入等体积的淬灭培养基并再次离心。将沉淀重悬于一毫升淬火培养基和10微摩尔ROCK抑制剂Y27632中。

执行细胞计数以计算获得每孔八次10至第四个细胞所需的体积。然后将所需体积的LPC细胞聚集体等分到1.5毫升微量离心管中，并以300倍G离心5分钟，除去多余的上清液而不搅动细胞沉淀，留下10微升残留介质。将细胞沉淀重悬于200微升的冷GFR基底膜基质培养基中，并将细胞转移到细胞培养膜插入物中。

在37摄氏度下孵育30至60分钟。孵育后，将一毫升3D类器官诱导培养基加入插入物的基底外侧腔室，并每隔一天用新鲜培养基替换一次，持续六天。在第 23 天，将培养基切换到 3D 分支培养基，然后每隔一天更换一次培养基，持续六天。

在第29天，更换为3D成熟培养基，并在接下来的六天内每隔一天继续更换培养基。在DE诱导的第四天，附着的细胞显示出紧凑的鹅卵石形态。表达了覆盖有细胞核的明确内胚层标志物 CXCR4 和 SOX17，证实了内胚层分化。

第七天确认了前肠前部诱导，形态显示细胞更紧密地压实，并且标记FOXA2和SOX2覆盖有细胞核。用3D球体证实了3D肺祖细胞的产生，以及NKX2-1 GFP在报告细胞系中的内源性表达。经过三周的全肺类器官分化后，通过免疫细胞化学分析肺标志物。

在类器官中观察到由细胞核覆盖的分支形态发生SOX2和SOX9的标志物。近端肺标志物P63和KRT5，两者都是基底细胞的标志物，与SCGB3A2一起被成功检测，SCGB3A2是俱乐部细胞的标志物。远端肺标志物诱导肺泡II型细胞的Pro SPC和SPB标志物。

和肺泡I型细胞的HOPX标志物。此外，NKX2-1和ZO1与原子核叠加表达。间充质肺细胞标志物PGFR Alpha是成纤维细胞的标志物，与SOX9共同表达，代表远端间充质。

Vimentin也被表达并分散在整个肺部。在此程序之后，肺类器官可以与诱导多能干细胞衍生的内皮和免疫细胞一起投资。肺发育和疾病通过上皮细胞群和间充质细胞群之间的信号传导发生，但也来自内皮细胞和巨噬细胞。

3D肺组织模型系统与研究人类疾病和治疗方法具有临床相关性。