Name: 激光微辐射研究S阶段DNA招募 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 了解激光微辐射技术如何研究S期DNA修复蛋白的时空动态招募过程。利用荧光标记PCNA作为细胞周期标记物，结合共聚焦显微镜实现高分辨率活细胞成像，为DNA损伤修复机制研究提供精准方法。

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作者感谢 M. Pagano 的持续支持，以及 D. Simoneschi、A. Marzio 和 G. Tang 对手稿的审阅。B. Miwatani-Minter 感谢 R. Miwatani 和 B. Minter 的持续支持。G. Rona 感谢 K. Ronane Jurasz 和 G. Rona 的持续支持。

1. 人骨肉瘤来源细胞（U-2 OS）的培养
注意：U-2 OS 细胞是此类研究的理想选择，因为它们具有扁平的形态、较大的细胞核，并能牢固地附着于多种表面，包括玻璃。其他具有类似特性的细胞系也可使用。
<ol>
	<li>培养 U-2 OS 细胞系时，使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）以及抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的 McCoy's 5A 培养基。将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养2进行显微镜研究时，将细胞培养于10 cm培养皿中，以提供足够的细胞数量。</li>
	<li>当细胞接近90%融合度（约7 x 106 细胞/10 cm 培养皿），传代细胞。
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗细胞，以去除血清中含有的胰蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，确保细胞层被均匀覆盖。</li>
		<li>37 °C孵育，直至细胞层从培养板上脱落（约6分钟）。</li>
		<li>将经胰蛋白酶消化的细胞重悬于含血清的培养基中以灭活胰蛋白酶，并加入十分之一体积的培养基th 体积的（约0.7 × 106 将细胞接种至含有10 mL完全培养基的新10 cm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验前，应使用通用支原体检测试剂盒（Universal Mycoplasma Detection kit），按照制造商的建议常规检测细胞是否存在支原体污染。</li>
</ol>
2. 逆转录病毒感染
注意：对于 BSL-2 安全措施以及操作重组病毒时，请参阅：NIH 指南，第三部分 III-D-3：组织培养中的重组病毒。
<ol>
	<li>将4 × 106个HEK293T细胞接种至10 cm培养皿中，使细胞在接种后24小时内达到约60%的融合度。
	<ol>
		<li>培养HEK293T细胞时，请参照本方案第1.1–1.3节中所述的U-2 OS细胞培养步骤。对于HEK293T细胞，使用McCoy's 5A培养基替代DMEM。务必轻柔地洗涤HEK293T细胞，因其贴壁能力较弱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用基于脂质的转染试剂对HEK293T细胞进行转染，以实现质粒的病毒包装。
	<ol>
		<li>对于逆转录病毒载体，取1.5 µg VSV-G（Addgene #8454）和1.5 µg pUMVC（Addgene #8449）包装质粒，以及3 µg含有目的基因的载体质粒（构建于带有嘌呤霉素抗性的逆转录病毒载体骨架中），加入250 µL Opti-MEM低血清培养基中，置于微量离心管内混合。每加入1 µg DNA，向Opti-MEM/DNA混合物中添加1 µL P3000试剂（本例中为6 µL），轻轻敲击混匀。切勿涡旋或反复吹打。</li>
		<li>在另一微量离心管中，将转染试剂按每1 µg DNA使用2 µL（本例中为12 µL）与250 µL Opti-MEM低血清培养基混合。</li>
		<li>将上述两种混合液合并（总体积500 µL，切勿涡旋，仅通过轻敲混匀），室温孵育15分钟。</li>
		<li>将混合液逐滴小心加入已接种的HEK293T细胞中，避免细胞脱落。轻轻晃动培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过病毒感染建立稳定细胞系。
	<ol>
		<li>转染72小时后，收集含有病毒的上清液。使用0.45 µm滤器小心过滤，以去除细胞碎片和脱落细胞。可选：在病毒上清液中加入8 µg/mL聚凝胺（polybrene），以促进病毒感染。</li>
		<li>将含病毒的上清液加入处于约50%融合度的U-2 OS细胞（接种于10 cm培养皿中，约3 × 106个细胞）。U-2 OS细胞应于前一天接种。</li>
		<li>感染6–16小时后，移除并弃去含病毒的上清液。 
		注：为获得目的基因所需的过表达水平，可使用一系列病毒稀释液进行固定时间的感染。通过Western blot检测各新建立细胞系中外源基因的表达水平，并与内源表达水平进行比较。</li>
		<li>在适当抗生素存在下进行细胞筛选（如使用嘌呤霉素时，终浓度为2 μg/mL，筛选3–4天），并在显微镜下验证荧光蛋白标记的目的基因的表达情况。</li>
		<li>重复上述步骤以建立双标记细胞系。在本研究中，mPlum-PCNA由逆转录病毒载体（pBABE）表达，EXO1B-AcGFP也由另一逆转录病毒载体（pRetroQ-AcGFP1-N1）表达。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 显微照射前的细胞准备
<ol>
	<li>细胞铺板：实验前24小时，在四孔带盖玻片培养板中，将总计8.0 × 104个细胞接种于500 µL至1 mL培养基中（达到约70%融合度），盖玻片底部应为1.5号硼硅酸盐玻璃，以获得适用于高倍率共聚焦显微镜观察和激光微辐照的理想成像效果。较高的细胞融合度可在单个视野（FOV）中检测更多细胞；但完全融合的细胞层可能引起细胞周期异常。</li>
	<li>成像培养基：微辐照前1小时，将常规生长培养基更换为FluoroBrite DMEM成像培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、15 mM HEPES（pH=7.4）和1 mM丙酮酸钠。该成像培养基有助于最大化信噪比，从而检测到极微弱的荧光信号。由于含有HEPES，该培养基可在无5% CO2环境条件下维持pH稳定。</li>
	<li>在此步骤中可施加其他所需处理。在本实验中，细胞在成像前1小时预先用奥拉帕利（PARP抑制剂，终浓度1 µM）或溶剂对照（DMSO）进行预处理1,8,9。</li>
</ol>
4. 准备显微镜并选择处于S期的细胞进行成像。
<ol>
	<li>为获得最佳结果，请使用与本文所述系统具有相似特性的共聚焦系统。本文所述实验采用安装在倒置显微镜平台上的共聚焦显微镜进行（参见材料表）。 
	注意：本实验所用显微镜配备50 mW 405 nm FRAP激光模块，以及60倍1.4 NA油镜平场复消色差物镜。共聚焦扫描头具有两种扫描选项：用于高分辨率成像的检流计扫描器和用于高速成像的共振扫描器。
	<ol>
		<li>通过软件控制的XY检流计装置将荧光漂白后恢复（FRAP）激光引入样品。使用488 nm激光线激发AcGFP，使用561 nm或594 nm激光线激发mPlum。 
		注意：以下滤光片组合可获得最佳效果：使用560 nm长通滤光片，波长低于560 nm的发射光通过525/50 nm发射滤光片用于AcGFP检测，而波长大于560 nm的发射光通过595/50 nm发射滤光片用于mPlum检测。也可使用任何合适的滤光片组合（例如FITC/TRITC、GFP/mCherry、FITC/TxRed），只要能确保最小的荧光串扰即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启环境培养箱和显微镜组件。
	<ol>
		<li>在实验开始前至少4小时开启加热装置（载物台、物镜，如有可能还包括环境培养箱）、CO2供应和湿度调节器，以确保系统达到热平衡，从而实现稳定的图像采集。</li>
		<li>在将细胞转移至显微镜前至少1小时启动光源及激光线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用荧光标记的PCNA作为标志物，在非同步细胞群体中选择处于S期的细胞。请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>观察mPlum标记的PCNA在S期特有的定位模式，从而识别该细胞周期阶段。在细胞周期的G1和G2期，PCNA在细胞核内呈完全均匀分布，并被排除在核仁之外；而在S期，PCNA在细胞核内复制体所在位置形成焦点。图1展示了S期不同阶段PCNA焦点的分布模式，使得能够进一步区分早期、中期和晚期S期。</li>
		<li>通过目镜观察，选择含有足够数量S期细胞的视野（FOV），以便进行微辐照。非同步生长的U-2 OS细胞通常有30–40%的细胞处于S期。</li>
		<li>应避免PCNA和目标蛋白（本例中为EXO1b-AcGFP）表达水平过高或过低的细胞，以防止产生实验假象。</li>
		<li>在寻找合适视野时，应尽量减少长时间扫描，以降低光漂白和非预期DNA损伤的风险。</li>
		<li>设定用于微辐照的兴趣区域（ROI）。使用配套软件（参见材料表），首先插入二值化线条（设置所需线条数量和间距），点击Binary，然后点击Insert line | Circle | Ellipse绘制所需数量的线条。</li>
		<li>将这些二值化线条转换为ROI，再将这些ROI转换为刺激ROI。具体操作为：先点击ROI，然后点击Move Binary to ROI，接着右键单击任意一个ROI并选择Use as Stimulation ROI: S1。将这些线条放置于视野中，使其穿过细胞核。本方案全程使用长度为1024像素、横跨整个视野的ROI。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于免疫荧光染色或延时成像的微照射。
<ol>
	<li>确定最佳微辐照参数。
	<ol>
		<li>在对细胞进行微辐照之前，先获取视野（FOV）的高分辨率图像，以识别PCNA焦点，用于后续分析。为避免在两种波长扫描之间发生细胞移动，应同时记录所使用的两个光学通道（绿色和红色），而非采用顺序扫描。为获得焦点的适当分辨率，请使用至少1024 × 1024像素/视野的分辨率，1倍缩放（本实验所用成像系统上的像素尺寸为0.29 μm&#160;），扫描速度为1/8帧/秒（4.85 μs/像素），并进行2次平均。在A1 LFOV Compact GUI和A1 LFOV Scan Area窗口中设置好这些参数后，点击Capture按钮以记录视野。 
		注意：在整个实验过程中保持相同的像素尺寸非常重要，以确保结果具有可比性。</li>
		<li>为设置微辐照，请在成像软件中打开ND Stimulation选项卡，进入Time schedule (A1 LFOV / Galvano Device)窗口。该功能使用检流计扫描器获取一系列辐照前图像，随后进行刺激（使用LUN-F 50 mW 405 nm FRAP激光），再使用检流计扫描器获取一系列辐照后图像。首先在Time schedule窗口中设置三个阶段。在Acq/Stim列中，分别为三个阶段选择Acquisition | Bleaching | Acquisition。在漂白阶段，将S1设置为感兴趣区域（ROI）。 
		注意：在本实验中，刺激阶段未采集图像。</li>
		<li>在Galvano XY窗口中设置微辐照的关键参数：405 nm激光输出功率、驻留时间（本系统默认迭代次数为1）。在本实验中，细胞使用405 nm FRAP激光（光纤末端功率为50 mW）在100%输出功率下进行辐照，驻留时间为1000–3000 µs。 
		注意：由于激光驻留时间是按每个像素计算的，只要像素尺寸保持不变，不同视野之间的驻留时间与功率密度关系即可比较。图2A展示了利用DNA损伤应答（DDR）通路特异性蛋白（FBXL10用于双链断裂DSBs，NTHL1用于氧化碱基损伤）来优化特定损伤诱导的激光功率设置。这些稳定细胞系是通过病毒感染并按照本方案第2节生成的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延时成像。
	<ol>
		<li>使用Time schedule, A1 LFOV Compact GUI和A1 LFOV Scan Area窗口设置所需的延时成像时间窗口和时间间隔。在本实验中，对EXO1b和PCNA的招募过程进行了12分钟的成像，每5秒扫描一次视野，分辨率为1024 × 1024像素/视野，使用1倍缩放（在本实验所用成像系统上得到0.29 µm像素&#160;尺寸），扫描速度为0.35帧/秒（1.45 µs/像素），不进行平均以减少光漂白。</li>
		<li>在A1 LFOV Compact GUI窗口中优化激光功率%、增益和偏移设置，以减少成像过程中的光漂白。若需同时检测目标蛋白（POI）和PCNA，应使用同步扫描而非顺序扫描，以避免在分别扫描两种荧光染料时发生细胞移动。
		<ol>
			<li>本实验所用成像系统的设置如下：488 nm激光线（20 mW）：7%激光功率，增益：45（GaAsP检测器），偏移值为2；561 nm激光线（20 mW）：4%激光功率，增益：40（GaAsP检测器），偏移值为2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据蛋白动力学特性，可延长或缩短图像采集间隔或总延时成像持续时间。在Time Schedule窗口中，为第三阶段“采集”行设置所需的间隔和持续时间。</li>
		<li>点击Run now以执行微辐照及随后的延时成像。</li>
		<li>延时成像结束后，将刺激ROI保存为单独图像，这将有助于在后续分析软件中识别微辐照坐标的定位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色。 
	注意：步骤5.1.3和图2A展示了利用已知DNA修复蛋白评估微辐照所引入的DNA损伤类型。某些DNA损伤也可在细胞固定后使用特异性抗体进行检测。此外，也可通过抗体检测内源性蛋白来观察目标蛋白（POI）的招募情况。下文展示了利用γH2A.X可视化检测双链断裂（DSBs）的方法（图2B）。图3展示了内源性和外源性标记PCNA在整个细胞周期中定位与招募的一致性。
	<ol>
		<li>在步骤5.1.3之后，仅在微辐照后采集一张图像，以根据mPlum-PCNA的招募情况确认FRAP事件是否成功。记录视野的精确坐标，以便在免疫荧光标记后重新定位该视野。</li>
		<li>将细胞培养腔从显微镜中取出，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育5–10分钟。 
		注意：多聚甲醛（PFA）具有毒性，操作应在通风良好处或通风橱中进行。后续所有洗涤和孵育步骤均在4孔腔载玻片中使用0.5 mL体积进行。孵育结束后，用0.5 mL PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4）洗涤细胞，并在室温（RT）下用0.5 mL含4% PFA的PBS固定10分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞一次，再用50 mM NH4Cl洗涤以淬灭残留的PFA。</li>
		<li>在室温下用含0.1% Triton X-100的PBS对细胞进行15分钟的透化处理。</li>
		<li>用封闭缓冲液（5% FBS，3% BSA，0.05% Triton X-100溶于PBS）在室温下封闭样本1小时。</li>
		<li>去除封闭液，加入用封闭缓冲液稀释的一抗（抗-γH2A.X，1:2000），室温孵育1小时。</li>
		<li>用封闭缓冲液洗涤3次，每次10分钟。</li>
		<li>加入用封闭缓冲液稀释的二抗（抗小鼠Alexa 488 Plus偶联物，1:2000），室温孵育1小时。</li>
		<li>用封闭缓冲液洗涤3次，每次10分钟。</li>
		<li>用含1 µg/mL DAPI的PBS溶液对细胞核进行复染，孵育15分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞一次。成像可直接在PBS中进行，或使用含抗荧光淬灭试剂（如AFR3）的PBS溶液以减少光漂白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 招募分析
注意：图4A 显示了在DMSO或奥拉帕利（olaparib）存在条件下Exo1b和PCNA募集的代表性图像。图4B 展示了用于数据分析的代表性图像。通过Fiji软件，在不同时间点沿mPlum-PCNA标记的激光轨迹（A，黄色矩形）使用矩形区域测量平均AcGFP荧光强度，从而计算出平均荧光值。PCNA可作为内参，用于指示在感兴趣区域（ROI）坐标内成功实施了辐照。同样，也对细胞核中未受损区域（B，蓝色矩形）计算了平均AcGFP荧光值。背景信号强度在无细胞区域（C，红色矩形）进行测量，并从平均荧光值中扣除（图A 和 B）。因此，每个数据采集点的相对平均荧光单位（RFU）通过公式 RFU = (A − C)/(B − C)8,9 计算得出。微辐照区域所得RFU值被标准化为微辐照前的RFU值。
<ol>
	<li>在定义微辐照区域 A 时，应排除细胞核仁区域、复制位点以及细胞核内的不规则区域，不纳入测量范围。在 Fiji 软件中绘制两个感兴趣区域（ROI）时，按住 shift 键可将两个独立区域组合为一个区域。 
	注意：蛋白质的招募情况会因不同基因和辐照条件而异，因此区域 A 的大小需根据具体情况单独确定。一旦确定了区域 A 的像素宽度，在所有比较性招募分析中应保持该宽度不变。在本研究展示的实验中，采用了宽度为 7 像素的矩形。</li>
	<li>排除在录制视频期间发生移动的细胞。若需纳入高迁移性细胞，必须逐帧进行上述分析。</li>
	<li>为可视化招募动态，使用统计软件将归一化的 RFU 值对时间作图。</li>
	<li>采用 Mann-Whitney 检验，计算 DMSO 与奥拉帕利（olaparib）处理组（n=31）在指定时间点的差异。</li>
</ol>

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作者声明，本论文的发表由尼康公司（Nikon Corporation）提供赞助。作者声明不存在任何竞争利益。

关键步骤及潜在的实验方案故障排除/优化 
用于微辐照的合适组织培养器皿对实验成功至关重要。大多数高分辨率成像系统均针对厚度为 0.17 mm 的盖玻片进行优化。使用厚度更高或更低的成像腔室，或由未针对 405 nm 成像优化的塑料聚合物制成的腔室，会显著降低图像质量。当使用玻璃表面时，应确保其经过组织培养处理，以增强细胞黏附。若未经过组织培养处理，则这些腔室在接种细胞前需进行包被处理，例如使用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）。将细胞接种至带腔室的盖玻片时，理想的细胞密度至关重要，以避免细胞周期异常及对细胞造成额外应激。实验前对显微镜组件进行充分的温度平衡，以维持稳定的温度环境，这对于在延时成像过程中保持焦点稳定，以及确保不同时间和样本间DNA损伤应答（DDR）的一致性均十分关键。
在进行微辐照之前，必须确保细胞处于健康状态，以减少人为假象数据的产生。如果细胞在感染或筛选后形态异常，应让细胞连续传代多次，直至形态恢复正常。务必确保所使用的细胞系无支原体污染。支原体感染具有多种不良影响，其中之一是可导致宿主细胞DNA损伤，并可能影响其DNA损伤应答（DDR）通路14,15。检测细胞培养物中支原体最敏感的方法是PCR法（相较于使用DAPI或Hoechst染色检测）。
目标修复蛋白的过表达水平应与内源性表达水平相当，同时需足够高以实现有效检测。可通过调整病毒载体上的启动子、感染时的病毒滴度以及感染时间，来优化表达水平。为获得一致的结果，建议分离单个细胞克隆，以确保表达水平均一且细胞形态正常。推荐使用不会使带标签PCNA表达水平超过内源性水平的载体构建体，以保证细胞周期及DNA修复标志物的正常功能。即使PCNA的低水平过表达也足以区分S期细胞。逆转录病毒pBABE载体已成功用于此目的（Addgene #1764、#1765、#1766、#1767）。PCNA可标记任何单体红色（例如，mPlum、mCherry、mRuby等）或单体绿色荧光蛋白（例如，mEGFP、AcGFP、mWasabi、mNeonGreen、mEmerald等），之后可与另一种标签标记的目的蛋白（POI）联合使用。过表达荧光标记的目的蛋白存在一些局限性和注意事项：荧光标签可能干扰蛋白的正常功能和定位，因此需考虑标签的位置（N端或C端）。务必使用单体荧光蛋白，因为非单体变体的寡聚化可能影响目的蛋白的功能。
每种成像系统的激光设置必须单独确定，因为光路中的许多组件都会影响实际递送到细胞中的激光功率。激光微辐照可导致多种类型的DNA损伤，具体取决于激发波长、FRAP激光器的输出功率以及是否使用了预致敏剂（如溴脱氧尿苷或Hoechst）。405 nm激光可引起氧化性DNA损伤以及单链和双链断裂16,17。通过使用更高的激光输出设置，双链断裂（DSB）的数量会增加。本方案中未采用预致敏方法，但相关技术在文献中已有广泛报道，并在下文讨论部分进行了简要回顾。我们认为，检验是否产生预期DNA损伤的最佳方法是检测已知DNA损伤通路特异性基因的募集情况。碱基切除修复（BER）通路组分NTHL1或OGG1的募集提示氧化DNA碱基的产生10,11,17,18,19，而FBXL10或XRCC5的募集则表明存在双链断裂（DSB）8,20,21。XRCC1的募集可同时提示氧化DNA碱基和单链断裂（SSB）的存在22,23。XPC（即RAD4）是核苷酸切除修复（NER）的良好标志物，该通路可清除由紫外线（UV）产生的大体积DNA加合物17,24。由于外源蛋白的募集可能引入某些异常，因此可通过免疫荧光染色检测内源性DNA修复蛋白或标志物（如用于双链断裂的γH2A.X）来确认特定DNA损伤的存在。此外，也可使用针对特定类型DNA损伤的抗体进行检测。为调节递送的激光功率，可同时调整驻留时间（dwell time）和激光功率。
借助数学建模，可进行详细的动力学分析，从而深入了解目标蛋白（POI）的招募特性（例如多个DNA结合结构域的贡献、对不同信号事件的敏感性等）。自动化招募评估与细胞追踪可结合使用，以建立稳健的工作流程1,25。
DNA预致敏的优势与局限性 
在微辐照前对DNA进行预致敏是研究DNA修复蛋白招募的常用工具16,17。在微辐照前对DNA进行致敏处理可使其更易产生DNA双链断裂（DSBs）。目前最常见的两种DNA预致敏方法是使用溴脱氧尿苷（BrdU）或Hoechst染料对细胞进行预处理。对于无法使用高功率激光进行微辐照的系统，这些方法可能是诱导DSB等DNA损伤所必需的。此外，在缺乏透射光检测器或无法通过荧光信号标记细胞核的情况下（例如研究未标记的内源性DNA修复蛋白的招募过程），Hoechst染料既可作为预致敏工具，也可作为荧光核染色剂。然而，DNA预致敏可能引入显著的实验复杂性。BrdU（终浓度为10 µM）需在微辐照前24小时（或相当于所用细胞系一个完整细胞周期的时间）加入细胞，以确保充分掺入DNA，但可能干扰细胞周期26。Hoechst 33342（终浓度为1 µg/mL）在长时间孵育后具有细胞毒性，但需要足够时间以使染料充分饱和细胞核。因此，应仅在微辐照前15–20分钟加入；否则，蛋白招募数据将不一致。经此方法染色的细胞在培养中存活时间不得超过数小时27,28。请注意不要使用Hoechst 33358，因其细胞通透性不如Hoechst 33342染料。预致敏还可能在不同实验间引入不必要的变异，并使实验对细胞密度差异更加敏感（因为这会影响每细胞染料的掺入量）。
共聚焦显微镜的优点与局限性 
与宽场显微镜相比，共聚焦显微镜的成像速度可能成为限制因素。然而，配备谐振扫描器的共聚焦显微镜可显著提高成像速度（以牺牲分辨率为代价），接近转盘显微镜的成像速度。A1R HD25 共聚焦系统具备三个特点，使其成为本实验方案的理想选择。首先，该系统的 25 mm 视场（FOV）使得单次扫描可同时成像 15–20 个细胞（常规配置通常为 5–10 个细胞），从而减少了为获得足够数量细胞进行统计分析所需的成像次数。其次，FRAP 模块与双扫描头的设计使得细胞的成像与微辐照可同时进行，而不仅限于顺序操作。最后，系统同时具备谐振扫描器与检流计扫描器（galvano scanner），提供了灵活切换的能力：既可使用高速谐振扫描实现高时间分辨率成像，最大限度减少荧光探针的淬灭；也可采用较慢扫描速度的检流计模式进行高空间分辨率成像，以获得更高的信噪比。尽管本研究所用系统具备上述灵活性，但为了更贴近目前广泛使用的共聚焦显微镜配置，本实验中仅使用了检流计扫描器（同时用于微辐照和后续成像）。
微辐照技术的优点与局限性 
尽管微辐照技术具有无与伦比的空间和时间分辨率，但它也存在一定的局限性。与自然发生的损伤因子相比，激光微辐照引起的DNA损伤高度集中在细胞核的特定区域。因此，由微辐照引发的染色质反应可能与均匀分布的损伤所引发的反应有所不同。此外，微辐照过程耗时较长，通常只能在数十个细胞上进行，而基于大样本群体的传统生化方法（如染色质分级分离、免疫沉淀、ChIP）则可通过同时研究数千个细胞来提高结果的稳健性。通过传统生化技术验证微辐照所获得的观察结果，是得出可靠结论的有效策略。虽然在特定视野（FOV）内同时对多个细胞进行微辐照是可行的，但成像系统需要更长时间来完成该任务。因此，对于快速募集到DNA损伤位点的蛋白质，其动态过程的测量限制了可同时使用的感兴趣区域（ROI）的数量。在本实验方案所使用的成像系统上，使用1000 μs驻留时间完成单条1024像素长度的ROI微辐照需1032毫秒，而使用3000 μs驻留时间则需3088毫秒。若使用多条ROI，完成微辐照所需时间将显著增加（例如，7条1024像素长度的ROI在1000 µs驻留时间下需14402毫秒，在3000 µs驻留时间下需21598毫秒）。这部分时间将从图像采集时间中扣除，必须在实验设计中予以充分考虑。在观察快速募集事件时，应使用尽可能短的ROI，并且每次仅对一个细胞进行微辐照。
与同步化方法相比的优势与局限性 
对于细胞周期特异性研究，现有方法包括将细胞同步至特定细胞周期阶段，或使用荧光报告分子来识别细胞所处的特定细胞周期阶段。然而，这些方法各自存在一定的挑战与局限性。
FUCCI系统3（依赖于荧光蛋白标记的CDT1和Geminin截短形式）是细胞周期研究中一种特别有用的工具，但在区分细胞周期的S期和G2期时存在局限性。Geminin的水平从中S期开始就已升高，并持续保持高水平直至M期，使得这两个阶段难以区分。使用FUCCI系统还意味着显微镜的两个光学通道无法用于目标蛋白（POI）的成像。
通过去除血清中的生长因子（即血清饥饿法），可将非癌细胞系同步至G0&#160;期，该方法对细胞造成的DNA损伤极小或无损伤。然而，大多数癌细胞系即使在培养基中缺乏足够血清的情况下，仍会部分持续进行细胞周期进程。此外，细胞在晚G1期至早S期阶段会开始部分丧失同步性。除血清饥饿法外，还有多种化学方法可用于实现细胞周期同步。羟基脲、阿非迪霉素和胸腺嘧啶阻断法均可通过抑制DNA复制将细胞同步于早S期。尽管这些方法成本低廉且操作简便，但会引发复制应激，从而导致DNA损伤。已有研究表明，这些DNA复制抑制剂可诱导H2A.X的磷酸化，而H2A.X是DNA双链断裂（DSBs）的公认标志物2,29。使用标记的PCNA作为S期细胞标志物的方法，相较于血清饥饿法，可减少化学同步所引起的潜在人为假象，并适用于更广泛的细胞系。
结论 
DNA 损伤是遗传性疾病发生的重要驱动因素，其中致突变性损伤可导致细胞的恶性转化。靶向 DNA 合成机制是治疗癌症等过度增殖性疾病的基本治疗策略。为了更精准地治疗这些疾病，我们需要更深入地了解修复 DNA 损伤的蛋白质。本文所述方案通过减少传统同步化方法带来的挑战，降低了可能的实验假象，提高了实验的可重复性，从而有助于开展基于显微照射的 S 期研究。

细胞中已进化出多种DNA修复通路，以应对可能出现的不同类型的DNA损伤，这些通路在空间和时间上均受到高度调控。细胞周期中最易受损伤的时期之一是发生DNA合成的S期。尽管增殖对生命至关重要，但它同时也带来重大挑战。细胞必须确保基因组的准确复制，以避免将突变传递给后代。因此，增殖成为肿瘤学领域治疗策略开发中的一个关键干预靶点。
用于研究DNA损伤位点蛋白质招募的所有主要技术都有其优势和局限性。与免疫荧光成像电离辐射诱导的焦点（IRIF）、染色质免疫沉淀（ChIP）或生物化学分级等大多数其他方法相比，显微照射具有更高的空间和时间分辨率1。然而，显微照射在同时取样大量细胞方面的稳健性不及上述技术。
为了研究S期的DNA修复，必须能够在非同步细胞培养群体中区分出处于S期的细胞。目前已有多种成熟的方法可用于实现这一目标，包括细胞同步化或直接可视化不同细胞周期阶段。然而，这两种方法均存在显著的技术挑战和潜在的人为假象。广泛使用的化学同步化方法（如双胸苷阻断、阿非迪霉素处理或羟基脲处理）通过诱导复制应激，最终导致DNA损伤本身，从而实现早期S期细胞的富集。这限制了这些方法在S期DNA修复过程研究中的应用2。&#160;通过血清饥饿及再刺激实现同步化的方法仅适用于少数细胞系，尤其不适用于多数癌细胞系，因为这些细胞系相比非转化细胞系对生长因子的依赖性较低。荧光泛素细胞周期指示系统（FUCCI）是研究细胞周期的一种非常有用的工具，但在区分S期与G2期方面存在根本性局限3。
本文表明，使用荧光标记的PCNA作为S期的非侵入性标志物，可避免化学法细胞周期同步化带来的诸多缺陷，同时相比FUCCI系统具有更高的特异性和灵活性。作为一种单一标记物，PCNA不仅能够在非同步化细胞群体中识别处于S期的细胞，还能显示细胞在S期内的精确进展阶段（即早期、中期或晚期S期）4。外源性标记PCNA的低水平表达可最大程度减少对细胞周期进程和DNA修复过程的干扰。重要的是，PCNA还可作为DNA损伤诱导是否成功的内部对照，因为它参与多种DNA损伤的修复，并会被招募至局部诱导的DNA损伤位点1,4。
本文所示实验演示了如何测量EXO1b在S期的招募动态，以及这一过程如何受到已确立的PARP抑制剂奥拉帕利（olaparib）的影响。EXO1b核酸酶活性参与多种DNA修复通路，包括错配修复（MMR）、核苷酸切除修复（NER）和双链断裂（DSB）修复。在S期，EXO1b通过DNA末端切除过程中形成3'单链DNA（ssDNA）突出端，在同源重组（HR）中发挥重要作用5。此外，EXO1b还参与DNA复制过程，其功能包括激活检查点以重启停滞的复制叉，以及在复制过程中的链置换阶段参与引物去除和滞后链上冈崎片段的成熟5。EXO1b向DNA损伤位点的招募受到其与多聚（ADP-核糖）（PAR）直接相互作用的调控6,7。由于EXO1b在细胞周期中具有多种特异性功能，因此是利用PCNA开展S期特异性招募研究的理想对象。

<table><tbody><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>用于淬灭甲醛</td></tr><tr><td>抗EXO1兔多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体，克隆JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>一抗</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>用于封闭的BSA</td></tr><tr><td>BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>预致敏剂</td></tr><tr><td>Citifluor&amp;trade; 封片剂溶液AFR3</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17973-10</td><td>含PBS的抗荧光淬灭成像溶液</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>核酸染料</td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>HEK293T细胞的细胞培养基</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>溶剂对照及溶解溶剂</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>EGFP-FBXL10的病毒表达载体</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&amp;nbsp;（在pRetroQ中）</td><td>定制克隆</td><td>na</td><td>EXO1b cDNA被克隆至pRetroQ-AcGFP1-N1载体的NheI和BamHI位点。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>用于显微镜观察的酚红-free培养基</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>二抗</td></tr><tr><td>HEK293T细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>用于病毒包装的细胞系</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>活细胞成像培养基的缓冲剂补充物</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>预致敏剂</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>McCoy&amp;rsquo;s 5A（改良型）培养基</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>U-2 OS细胞的细胞培养基</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>适用于细胞周期标记的非病毒PCNA构建体</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>适用于细胞周期标记的非病毒PCNA构建体</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA（在pBABE中）</td><td>定制克隆</td><td>na</td><td>从Addgene #55994中克隆mPlum-PCNA cDNA至pBABE（puro）载体的BamHI和SalI位点</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25共聚焦扫描头及控制器</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>共聚焦成像系统</td></tr><tr><td>Nikon LUN4激光单元</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>激发系统</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP激光单元</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>FRAP激光单元</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements共聚焦控制器软件</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>共聚焦控制软件</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>倒置落射荧光显微镜主机</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP模块化照明系统</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>照明系统</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry（在pRetroQ中）</td><td>定制克隆</td><td>na</td><td>NTHL1 cDNA被克隆至pRetroQ-mCherry-N1载体的NheI和SalI位点。</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II腔室载玻片（4孔）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>活细胞显微镜细胞培养腔室</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>PARP抑制剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>瞬时转染的稀释培养基</td></tr><tr><td>多聚甲醛水溶液（32%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>pBABE（hygro）</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>逆转录病毒表达载体（用于低表达水平）</td></tr><tr><td>pBABE（neo）</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>逆转录病毒表达载体（用于低表达水平）</td></tr><tr><td>pBABE（puro）</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>逆转录病毒表达载体（用于低表达水平）</td></tr><tr><td>pBABE（zeo）</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>逆转录病毒表达载体（用于低表达水平）</td></tr><tr><td>PCNA抗体（PC10）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td>一抗</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>提高病毒感染效率</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>逆转录病毒表达载体</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>逆转录病毒表达载体</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>逆转录病毒表达载体</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>逆转录病毒表达载体</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>病毒包装载体</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>活细胞成像培养基的补充物</td></tr><tr><td>曲拉通X-100水溶液（10%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>用PBS稀释后作为细胞通透缓冲液</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA溶液（10倍浓缩）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>用PBS稀释后用于细胞传代</td></tr><tr><td>U-2 OS细胞</td><td>ATCC</td><td>&amp;nbsp;HTB-96</td><td>显微镜实验的理想细胞系</td></tr><tr><td>通用支原体检测试剂盒</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>基于PCR的支原体检测试剂盒</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>病毒包膜蛋白载体</td></tr></tbody></table>

利用激光显微照射研究s期dna的招募过程

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA损伤修复在高反应性环境中维持细胞的遗传完整性。由于代谢活动或紫外线辐射等内源性和外源性因素，细胞可能积累多种类型的DNA损伤。若缺乏DNA修复，细胞的遗传密码将受到破坏，从而影响蛋白质的结构与功能，并可能引发疾病。
了解不同细胞周期阶段中各种DNA修复通路的时空动态，对于DNA损伤修复领域至关重要。目前的荧光显微镜技术为测量DNA损伤诱导后不同修复蛋白的招募动力学提供了有力工具。细胞周期S期的DNA合成是细胞命运在DNA修复方面的一个特殊节点，它为全基因组错误筛查提供了独特窗口。同时，DNA合成过程中的错误也对DNA完整性构成威胁，而这种威胁在非分裂细胞中并不存在。因此，S期的DNA修复过程与其他细胞周期阶段存在显著差异，而这些差异目前尚不明确。
以下方案描述了细胞系的制备，以及利用配备405 nm激光线的激光扫描共聚焦显微镜，在局部诱导的DNA损伤位点处检测S期DNA修复蛋白动态变化的方法。使用标记了mPlum的PCNA作为细胞周期标志物，并结合标记了AcGFP的目标DNA修复蛋白（例如EXO1b），以检测S期中DNA损伤位点的蛋白招募情况。

细胞以特定方式处理每种类型的DNA损伤，该方式还取决于细胞所处的细胞周期阶段。例如，在微辐照后，双链断裂（DSB）将根据细胞周期阶段的不同，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）进行修复。在细胞周期的S期和G2期广泛发挥作用的核酸酶会产生对正确进行HR至关重要的DNA单链突出末端。为了便于评估处于S期的细胞，本研究采用PCNA作为单色细胞周期标记物。图1A展示了mPlum-PCNA在细胞周期进程中的定位模式。在G1期和G2期，PCNA在细胞核内呈完全均匀分布（同时主要被排除在核仁之外）。在S期，PCNA定位于DNA复制位点，在细胞核内表现为明亮的斑点。在早期S期细胞中，这些斑点相对较小，并均匀分布在细胞核内。进入中期S期后，斑点变得模糊，并更多地向细胞核边缘和核仁周围聚集。在晚期S期，斑点数量减少，但体积逐渐增大，因为PCNA在晚期复制位点发生富集（图1B）。重要的是，由pBABE载体骨架介导的外源性PCNA表达水平低于内源性表达水平，但足以通过显微镜检测到，从而最大限度地减少了对细胞周期进程和DNA损伤应答（DDR）可能产生的干扰。图1C展示了与内源性水平相比PCNA过表达的程度。请注意，由于mPlum-PCNA分子量较大，其对应的蛋白条带迁移速度较慢。
我们旨在通过微辐照诱导DNA双链断裂（DSB），以研究S期中EXO1b在这些损伤位点的PARP1/2依赖性招募。图2A显示，低能量剂量（1000 µs驻留时间）不足以诱导EGFP-FBXL10（一种DSB响应蛋白，FRUCC复合物的组分8）的招募，但足以诱导NTHL1-mCherry（一种碱基切除修复（BER）通路蛋白）在氧化性DNA损伤位点的聚集10,11,12。当驻留时间增至3000 µs时，EGFP-FBXL10和NTHL1-mCherry均被招募，表明该激光输出可同时产生氧化性损伤和DSB。进一步支持该结果的是，图2B显示了针对γH2A.X（DSB标志物）的免疫荧光染色，在使用较高能量剂量时信号更为明显。PCNA既可作为细胞周期标志物，也可作为微辐照成功的标志物，因其在两种激光驻留时间设置下均能有效招募。重要的是，外源性或内源性荧光蛋白标记的PCNA均可用于此报告功能，因其行为相似（图3）。内源性标记的PCNA是通过将mRuby插入PCNA基因座的一个等位基因第一外显子中实现的，保持阅读框完整13（该细胞系由Jörg Mansfeld惠赠）。
图 4A 和 图4C 显示S期细胞中AcGFP标记的EXO1b的招募情况。EXO1b在显微照射位点的积累水平约在1分钟时达到峰值，随后逐渐从DNA损伤位点解离。显微照射位点的富集区域以箭头指示 &gt; 图中1个相对荧光单位。在存在奥拉帕利的情况下，EXO1b在激光条带处1分钟时的累积量显著低于溶剂对照组。这些结果与文献报道一致6,7. 图4B 展示了方案第6步所述用于定量分析的代表性区域（区域A、B和C）。 图 4D 显示了用于显微照射的细胞中内源性EXO1b与外源性EXO1b-AcGFP的表达水平相当。
<img alt="细胞周期荧光显微镜；S期DNA合成；显微镜图像；蛋白质分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：PCNA的定位模式。（A）图像显示在U-2 OS细胞中，稳定整合的外源PCNA在整个细胞周期中的定位模式。（B）图像显示U-2 OS细胞中S期不同阶段（早期、中期和晚期）PCNA焦点的分布模式。（C）Western blot检测用于成像实验的U-2 OS细胞中外源性和内源性PCNA的表达水平。比例尺为20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像，EGFP-FBXL10 和 NTHL1-mCherry，停留时间研究，细胞周期阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：通过优化激光输出功率诱导双链断裂（DSBs）。 （A）可通过优化激光设置以诱导不同类型的DNA损伤。实验使用稳定表达EGFP-FBXL10和NTHL1-mCherry的U-2 OS细胞，分别用于识别双链断裂（DSBs）和氧化性损伤位点。对非同步化的U-2 OS细胞使用405 nm激光线进行显微照射，停留时间分别为1000 µs或3000 µs。比例尺为20 µm。（B）对内源性PCNA标记有mRuby的人视网膜色素上皮细胞（hTERT RPE-1）进行γH2A.X的免疫荧光染色。细胞经显微照射后5分钟固定并处理，照射停留时间分别为1000 µs或3000 µs。比例尺为20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；mRuby-PCNA，mPlum-PCNA；细胞周期，G1/G2，S期，停留时间。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：内源性mRuby-PCNA与外源性mPlum-PCNA在1000 µs或3000 µs激光停留时间下向微辐照位点的招募能力相当。 内源性和外源性标记的PCNA均在S期形成复制焦点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="EXO1b 和 PCNA 的荧光显微镜图像，DMSO 与 olaparib 处理的比较，相对荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：S 期中依赖 PARP1/2 的 EXO1b 招募。 稳定表达 EXO1b-AcGFP 和 mPlum-PCNA 的 U-2 OS 细胞使用 405 nm FRAP 激光线进行微辐照，停留时间为 3000 µs。(A) 经溶剂对照（DMSO）或 olaparib（1 µM）预处理后，在指定时间点拍摄的微辐照细胞代表性图像。比例尺为 20 µm。(B) 用于招募分析的 A、B 和 C 区域的代表性局部图像。比例尺为 20 µm。(C) 通过活细胞成像记录 DNA 损伤后的招募动态。每 5 秒采集一次相对平均荧光值和图像，持续 12 分钟。每种条件下评估了 ≥30 个细胞。将相对平均荧光值（实心黑线）和标准误差（阴影区域表示范围）对时间作图。虚线表示微辐照后 1 分钟时的招募值。DMSO（n=32）与 olaparib（n=31）处理组之间的差异采用 Mann-Whitney 检验进行计算。星号表示 p&lt;0.0001。(D) Western blot 比较了用于微辐照实验的细胞中内源性 EXO1b 与外源性 EXO1b-AcGFP 的表达水平。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种非侵入性方法，可高效地鉴定处于S期的细胞，用于后续显微镜研究，例如通过激光微辐照检测DNA修复蛋白的招募情况。

利用激光显微照射研究S期DNA的招募过程

DNA损伤修复在高反应性环境中维持细胞的遗传完整性。细胞可能因内源性和外源性因素而积累多种类型的DNA损伤……

本方案有助于在考虑细胞周期时相的前提下，理解DNA损伤修复蛋白在空间和时间上的招募过程。为区分细胞周期时相，我们采用荧光蛋白标记的PCNA作为S期标志物，从而避免了其他细胞周期同步化方法所引入的人为假象。该方法结合基于激光的显微辐照技术，可对DNA损伤修复蛋白的动力学过程提供无与伦比的时空分辨率。成功常规应用本方案需具备共聚焦成像的基础知识。在微辐照前24小时，将总计8×10⁴个细胞接种于四孔板内的带孔盖玻片上，每孔加入500 µL至1 mL培养基。微辐照前1小时，将常规生长培养基更换为含奥拉帕利（olaparib）或溶剂对照（如DMSO）的成像培养基。成像前至少四个小时，打开环境培养箱和显微镜组件。启动加热装置、二氧化碳供应系统和湿度调节器。在将细胞转移至显微镜前至少一小时，启动光源以及激光线路。将显微镜物镜涂上油，并将带腔室的盖玻片置于显微镜下。为了在非同步化细胞群体中选择处于S期的细胞，需通过目镜观察mPlum标记的PCNA在S期特有的定位模式，并选择一个含有足够数量S期细胞的视野进行微辐照。通过配套软件绘制二值化线条，设定微辐照的兴趣区域。为设置所需的线条数量和间距，单击“binary”，然后选择“insert line”、“circle”和“ellipse”以绘制所需数量的线条，再通过单击“ROI”、“move binary to ROI”将这些二值线条转换为刺激ROI。随后右键单击任意一个ROI并选择“use as stimulation ROI S1”。将这些线条放置在视野中，使其穿过细胞的细胞核。在进行微辐照前，为识别PCNA焦点以便后续分析，需在A1 LFOV compact GUI和A1 LFOV扫描区域窗口中设置必要参数，然后点击“capture”按钮，获取该视野的高分辨率图像。为设置微辐照，打开ND刺激选项卡，然后进入时间计划窗口，使用Galvano扫描器采集一系列辐照前图像和一系列辐照后图像。在时间序列窗口中设置三个阶段。在采集与刺激列中，分别为三个阶段选择采集、刺激和采集。对于刺激阶段，将 S1 设置为感兴趣区域（ROI）。在 Galvano XY 窗口中，将 405 纳米激光线的激光功率输出设置为 100%，并设定微辐照的驻留时间。使用 A1 LFOV compact GUI 和 A1 LFOV 扫描区域窗口，设置所需时间范围和时间间隔的延时成像。在 A1 LFOV compact GUI 窗口中，优化激光功率百分比、增益和偏移设置，以减少成像过程中的光漂白。根据蛋白质的动力学特性，通过在时间计划窗口中设置第三阶段采集行所需的间隔时间和总时长，延长或缩短图像间的时间间隔或整个延时成像的持续时间。按下“立即运行”以执行微辐照及随后的延时成像。延时成像结束后，将刺激的感兴趣区域（ROI）保存为单独的图像，以便在后续分析所用的任何软件中识别微辐照的位置坐标。在G1期和G2期，PCNA在细胞核内呈完全均匀分布。在S期，PCNA定位于DNA复制位点，可在细胞核内观察到明亮的斑点。在早期S期细胞中，这些斑点相对较小，并均匀分布于细胞核内。进入S期中期时，这些斑点变得模糊，并更多地定位于细胞核及核仁的周边区域。在S期晚期，斑点数量减少，但因PCNA在晚期复制位点富集而逐渐增大。较低的能量剂量（例如1,000微秒的停留时间）不足以诱导双链断裂响应蛋白EGFP-FBXL10的招募，但足以诱导碱基切除修复通路蛋白NTHL1-mCherry的招募，后者会定位于氧化性DNA损伤位点。在3,000微秒的停留时间下，EGFP-FBXL10和NTHL1-mCherry均被招募，表明激光输出可同时产生氧化性损伤和双链断裂。EXO1b在约一分钟后达到在微辐照位点的最大富集水平，随后开始缓慢脱离DNA损伤部位。在存在奥拉帕尼（olaparib）的情况下，EXO1b在一分钟时于激光条带处的富集程度显著低于溶剂对照组。确保显微镜有充足的时间预热，并且每次实验的培养条件均处于最佳状态，这对于获得一致的实验结果至关重要。此外，使用不同的DNA损伤报告系统时，需优化激光参数，以检测特定的DNA损伤位点。在显微辐照后，建议通过经典的生物化学方法（如细胞组分分离、免疫共沉淀或染色质免疫沉淀）对结果进行验证。这些方法可对更大规模的细胞群体进行取样，从而提供更强的统计效力。

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