一种测定谷物和豆类游离可溶性酚酸组成和抗氧化能力的广义方法
2022年6月10日
酚酸是存在于全谷物中的重要植物化学物质。它们具有生物活性特性，如抗氧化保护功能。这项工作旨在报告HPLC鉴定的广义方法，总酚含量估计以及谷物和豆类中酚酸抗氧化能力的测定。
一种测定谷物和豆类的游离可溶性酚酸组成和抗氧化能力的广义方法。全谷物，包括谷物和豆类，构成了人类饮食的重要组成部分。它们与人类的营养相关性早已得到认可。
然而，最近，已经报道了它们的抗氧化保护健康益处。在谷物的外层和豆类的种皮中发现的酚酸有助于全谷物的抗氧化特性。它们清除对生物分子造成氧化损伤的自由基。
在全谷物中发现的两类酚酸是羟基苯甲酸和羟基肉桂酸。本研究为提取全谷物酚酸和测定其体外抗氧化能力提供了一种简单的方法。本研究使用五个全谷物样品，硬质小麦，黄玉米，黑眼豇豆，大豆和红芸豆。
将100毫克的全谷物面粉样品准确称取，直接放入琥珀色的两毫升容量微型离心管中。管子的深色有助于防止混合物暴露在光线下。向每个含有样品的管中加入一毫升80%甲醇水溶液。
短暂涡旋以混合甲醇溶液和样品。将样品超声处理60分钟以提取游离可溶性酚类化合物。在超声处理期间在样品上盖上盖子，以增加对光的保护。
超声处理后，将混合物以20， 000倍G离心5分钟，以沉淀固体残留物，使上清液位于顶部。游离酚类化合物在离心后将存在于上清液中。上清液在注入HPLC仪器之前需要过滤。
要过滤上清液，请取出3 mL注射器的柱塞并连接注射器过滤器。过滤器的孔径应不大于0.22微米。将约0.4毫升上清液移入注射器顶部。
重新插入柱塞并将液体通过过滤器推入含有小瓶插入物的HPLC小瓶中。一旦仪器被设置为运行手稿中概述的HPLC分析方法，将小瓶装入转盘中以与样品列表相对应。获得320纳米和280纳米的HPLC色谱图，显示代表不同酚类化合物的不同峰。
使用适当的标准曲线，量化320纳米的羟基肉桂酸，因为它们在该波长处具有最大的吸光度。通过相同的原理，量化280纳米的羟基苯甲酸。使用Trolox（维生素E的水溶性类似物）作为标准来估计全谷物提取物的体外抗氧化能力。
在猎鹰管中准确称量一毫克的Trolox。用四毫升50%甲醇水溶液溶解，制备每升1毫升的储备溶液，相当于每升1000微摩尔。准备六种浓度的Trolox，即每升50，100，200，400，600和800微摩尔，以绘制标准曲线，以估计DPPH自由基清除能力和Trolox的等效抗氧化能力，TEAC。
类似地，制备每升6.25、12.5、25和50微摩尔的Trolox浓度，用于估计氧自由基吸收能力ORAC。每个浓度的总体积为500微升，如表一所示。分析前用甲醇稀释样品提取物。
在这里，黄玉米和豇豆提取物被稀释了两倍。小麦和芸豆提取物稀释5次，大豆提取物用甲醇稀释10倍。称取8.23毫克ABTS放入一个干净的，容量为两毫升的琥珀色微量离心管中。
接下来，称取1.62毫克的过硫酸钾放入一个干净的、容量为两毫升的琥珀色微量离心管中。通过涡旋将每个称重的化学品溶解在一毫升蒸馏水中。这导致16毫摩尔ABTS溶液和6毫摩尔过硫酸钾溶液。
通过将ABTS和过硫酸钾溶液等体积混合来制备ABTS储备溶液。溶液将立即变为深色。让这种混合物在黑暗中孵育12至16小时。
用200毫摩尔磷酸盐缓冲盐水稀释ABTS储备溶液30倍，形成ABTS工作溶液。为此，将58毫升200毫摩尔PBS添加到两毫升ABTS工作溶液中。工作溶液将含有0.27毫摩尔ABTS和0.1毫摩尔过硫酸钾。
对于分析，将每种稀释的提取物的10微升置于96孔微孔板中。向每个孔中加入190微升ABTS工作溶液，孵育60分钟。在酶标仪中测量750纳米的反应混合物的吸光度。
使用浓度范围为每升100至800微摩尔的Trolox标准品来绘制校准曲线。DPPH抗氧化测定需要一种产生自由基的化合物DPPH。称出1.2毫克DPPH到空的15毫升容量离心管中。
将DPPH溶解在甲醇中以制备60微摩尔溶液。DPPH测定测试样品提取物清除DPPH产生的自由基的能力。将五微升样品提取物加入微孔板孔中。
接下来，加入195微升60微摩尔DPPH甲醇溶液并孵育60分钟。测量515纳米处的吸光度。使用 Trolox 标准品绘制校准曲线。
图一显示了在全谷物中发现的羟基苯甲酸的结构。在目前的这项研究中，香草酸是唯一确定的羟基苯甲酸。图二显示了在全谷物中发现的羟基肉桂酸的结构。
在目前的研究中，在样品中鉴定了香豆酸，咖啡酸和阿魏酸。表二显示了样品中鉴定的酚酸。如前所述，香草酸是样品中唯一鉴定的羟基苯甲酸。
它仅在豇豆提取物中鉴定出来。羟基肉桂酸咖啡酸仅在芸豆中鉴定，而对香豆酸在黄玉米，豇豆和大豆中鉴定。在所有样品中均鉴定出阿魏酸，并且是样品中的主要酚酸。
酚酸的总浓度从大到低的顺序是大豆，豇豆，黄玉米和芸豆或同等物，其次是小麦。表三显示了样品的总酚类含量和抗氧化能力。抗氧化能力包括DPPH自由基清除能力，TEAC，ORAC和样品的总抗氧化能力。
总抗氧化能力是DPPH，TEAC和ORAC值的总和。与表二类似，大豆的总抗氧化能力最高。然而，芸豆不是豇豆，而是芸豆的总抗氧化能力第二高，尽管豇豆的总酚酸含量第二高。
这种异常与单个酚酸的结构以及羟基苯甲酸香草酸对豇豆中羟基肉桂酸的抗氧化作用的可能拮抗作用有关。这项研究得出的结论是，全谷物的酚酸成分不同。在所研究的全谷物中，大豆的酚酸总量最高，相应地，抗氧化能力也最高。
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概述
本研究提出了一种用于识别谷物和豆类中游离可溶酚酸及估算其抗氧化能力的通用方法。存在于全谷物中的酚酸显著地贡献于它们的抗氧化特性，这对人类健康有益。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 食品科学
- 营养科学
背景
- 全谷物是人类饮食的重要组成部分。
- 酚酸是存在于这些谷物中的重要植物化学物质。
- 它们因其抗氧化保护健康的益处而受到认可。
- 这些化合物有助于清除引起氧化损伤的自由基。
研究目的
- 报告一种用HPLC鉴定酚酸的方法。
- 估算谷物和豆类中的总酚含量。
- 确定这些酚酸的抗氧化能力。
使用的方法
- 高效液相色谱（HPLC）用于鉴定。
- 定量分析用于估算总酚含量。
- 通过既定的测定法评估抗氧化能力。
- 评估游离可溶酚酸的组成。
主要结果
- 在谷物和豆类中鉴定出各种酚酸。
- 估算不同样本中的总酚含量。
- 展示与酚酸相关的显著抗氧化能力。
- 对于食用全谷物的健康益处提供见解。
结论
- 该方法为分析酚酸提供了一种可靠的方法。
- 确认全谷物是有益植物化学物质的丰富来源。
- 进一步的研究可以探索这些发现的健康影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative profiling of free soluble phenolic acids and antioxidant capacity in cereals and legumes enables robust assessment of bioactive compound diversity in food matrices. This method supports early-stage discovery and validation of nutritional biomarkers relevant to functional food and nutraceutical R&D. Standardized extraction and analytical workflows facilitate cross-study comparability and portfolio-level decision-making for ingredient selection and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of phenolic acid diversity across grain and legume matrices.
- Supports functional validation of antioxidant mechanisms through quantitative in vitro assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking compound identity to antioxidant capacity outputs.
- Provides a reproducible platform for hypothesis-driven nutritional biomarker discovery.
Screening & Assay Development
- Delivers validated extraction and HPLC protocols for high-confidence compound identification.
- Standardizes antioxidant capacity measurement using DPPH, TEAC, and ORAC assays.
- Enables reproducible, quantitative outputs for cross-sample and cross-study comparison.
- Prepares extracts and data for downstream screening of bioactive compound efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenolic acid profiling with translational biomarker strategies in food and nutrition research.
- Supports continuity from analytical discovery to preclinical validation of antioxidant effects.
- Provides mechanistic data to inform risk-adjusted advancement of candidate ingredients.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for functional food and nutraceutical R&D, supporting ingredient triage and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Quantitative HPLC and antioxidant assays clarify compound-function relationships and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Standardized extraction and assay protocols enable reproducible, scalable screening of grain and legume matrices.
- Analytics: Provides robust quantitative outputs for phenolic acid content and antioxidant capacity, supporting comparative analytics.
- Translational Research: Facilitates alignment of analytical findings with preclinical models of antioxidant efficacy.
- Enterprise Reuse: The generalized workflow is adaptable across diverse grain and legume systems for portfolio-wide application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antioxidant mechanism validation and ingredient selection.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable analytical workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage risk in ingredient development pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidate bioactive compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in analytical chemistry and HPLC operation.
- Needs access to HPLC instrumentation and microplate-based antioxidant assay platforms.
- Demands cross-team standardization of extraction and assay protocols for reproducibility.
- Adaptable to various grain and legume matrices with protocol optimization as needed.
- Dependent on validated calibration standards and quantitative analytical controls.
