Name: 一种测定谷物和豆类游离可溶性酚酸组成和抗氧化能力的广义方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习使用高效液相色谱法和多种抗氧化测定法分析谷物和豆类中游离可溶性酚酸的组成与抗氧化能力。该方法通过提取、分离和定量检测，为评估全谷物的健康营养价值提供了简单可重复的实验方案。

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作者们衷心感谢 Alison Ser 女士和 Hannah Oduro-Obeng 女士提供的技术支持，以及 Janice Fajardo 女士和 Miguel del Rosario 先生在视频剪辑方面给予的帮助。

1. 样本类型
<ol>
	<li>本研究使用五种全谷物样品，包括两种谷物（例如硬质小麦和黄玉米）和三种豆类（例如黑眼豇豆、大豆和红芸豆）。</li>
	<li>使用咖啡研磨机将每种谷物各50 g研磨成粉，每种样品设三个重复，研磨后过500 µm筛。</li>
	<li>将样品储存在-20 °C条件下。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>干物质含量测定及干重基础表达 
	注意：根据 AOAC (2000)12 的方法测定每种粉末样品的干物质含量。
	<ol>
		<li>开启鼓风干燥箱，并将温度设定为 130 °C。</li>
		<li>将干燥剂（硅胶）在烘箱中干燥 30 分钟至 1 小时，然后将干燥后的硅胶转移至干燥器中。</li>
		<li>准确称取 2 g 每种样品，放入已预先干燥并称重的洁净铝盒中。</li>
		<li>将称量好的样品在鼓风干燥箱中于 130 °C 下干燥 1 小时。</li>
		<li>将干燥后的样品转移至干燥器中，冷却至室温。</li>
		<li>称量干燥并冷却后的样品，记录其质量。</li>
		<li>按以下公式计算每一样品的干物质含量： 
		<img alt="干物质含量计算公式，用于分析样品中水分含量的方程，% 含量。" src="/files/ftp_upload/62467/62467eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>使用以下公式将各参数以干重为基础进行表达： 
		<img alt="分析化学中干重基础参数的方程；含乘法因子的比值公式。" src="/files/ftp_upload/62467/62467eq02v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>酚酸提取 
	注意：采用 Y. Qiu 等人5 方法的改进法提取谷物样品中的可溶性游离酚类化合物，该方法可实现从毫克级全谷物样品中提取酚类物质。
	<ol>
		<li>准确称取 100 mg 全谷物面粉样品，直接加入 2 mL 容量的棕色微量离心管中。管壁的深色有助于防止混合物暴露于光线下。</li>
		<li>向每个含有样品的离心管中加入 1 mL 80% 的 HPLC 级甲醇水溶液。</li>
		<li>短暂涡旋振荡，使甲醇溶液与样品充分混合。</li>
		<li>超声处理样品 60 分钟，以提取游离可溶性酚类化合物。超声过程中用盖子覆盖样品，进一步避免光照。</li>
		<li>超声处理后，在 20,000 × g 下离心 5 分钟，使固体残渣沉淀，上清液位于上层。游离酚类化合物将存在于离心后的上清液中。</li>
		<li>将上清液转移至洁净的微量离心管中。 
		注意：上清液在注入 HPLC 仪器前需进行过滤。过滤时，取一个 3 mL 注射器，拔除活塞，安装一个注射式滤器。滤器孔径不得超过 0.22 µm。</li>
		<li>用移液器吸取约 0.4 mL 上清液加入注射器顶部。重新插入活塞，推动液体通过滤膜，收集至含有内插管的 HPLC 进样瓶中。</li>
		<li>当仪器已设置为运行文中所述 HPLC 分析方法后，将进样瓶按样品列表顺序装入自动进样器的样品盘中。</li>
		<li>在 320 nm 和 280 nm 处获取 HPLC 色谱图，显示代表不同酚类化合物的明显色谱峰。</li>
		<li>利用适当的标准曲线，在 320 nm 处定量羟基肉桂酸类化合物，因其在此波长下具有最大吸收。同理，在 280 nm 处定量羟基苯甲酸类化合物。</li>
		<li>将剩余提取物于 -20 °C 保存，用于其他分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 酚类成分
<ol>
	<li>使用高效液相色谱仪（材料表）鉴定并定量样品中提取的酚类化合物，方法依据 J. Xiang、F. B. Apea-Bah、V. U. Ndolo、M. C. Katundu 和 T. Beta 的研究4。</li>
	<li>配制酚酸标准品（香草酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸），用于鉴定和定量提取物中的组分酚类化合物。</li>
	<li>具体操作为：准确称取每种标准品各 1 mg，溶于 1 mL 的 50% 甲醇水溶液中，配制成浓度为 1,000 µg/mL 的各标准品溶液。</li>
	<li>取上述五种标准品溶液等体积混合于 2 mL 棕色离心管中，配制成混合标准品溶液（鸡尾酒标准液），使每种标准品在混合液中的浓度均为 200 µg/mL。</li>
	<li>通过取一定体积的混合标准品溶液转移至新管中，并加入等体积的甲醇水溶液进行稀释，制备系列稀释的混合标准品溶液。</li>
	<li>依次进行系列稀释，直至浓度降至 3.125 µg/mL。</li>
	<li>此外，将每种标准品单独用溶剂稀释 40 倍，获得浓度为 25 µg/mL 的各单个标准品溶液。</li>
	<li>设定色谱柱温度为 35 °C，样品室温度为 15 °C。</li>
	<li>配制流动相 A（0.1% 甲酸水溶液）：取 1 mL 甲酸加入 1 L 容量瓶中，用 HPLC 级水定容至 1 L 刻度线，充分摇匀。</li>
	<li>配制流动相 B（甲醇中含 0.1% 甲酸）：取 1 mL 甲酸加入 1 L 容量瓶中，用 HPLC 级甲醇定容至 1 L 刻度线，充分摇匀。</li>
	<li>必要时调整体积至 1 L 刻度线。</li>
	<li>将两种流动相均通过 0.45 µm 亲水性滤膜过滤。</li>
	<li>分析时，分别进样 10 µL 提取物或标准品溶液（25 µg/mL 单个标准品及混合标准品溶液）至反相色谱柱中。</li>
	<li>按照以下线性梯度程序进行洗脱，运行时间为 25 分钟：0–3.81 分钟，9%–14% B；3.81–4.85 分钟，14%–15% B；4.85–5.89 分钟，15%–15% B；5.89–8.32 分钟，15%–17% B；8.32–9.71 分钟，17%–19% B；9.71–10.40 分钟，19%–19% B；10.40–12.48 分钟，19%–26% B；12.48–13.17 分钟，16%–28% B；13.17–14.21 分钟，28%–35% B；14.21–15.95 分钟，35%–40% B；15.95–16.64 分钟，40%–48% B；16.64–18.37 分钟，48%–53% B；18.37–22.53 分钟，53%–70% B；22.53–22.88 分钟，70%–90% B；22.88–25.00 分钟，90% B。</li>
	<li>比较 25 µg/mL 真实标准品在 280 nm 和 320 nm 波长下所得色谱峰的保留时间与提取物色谱峰的保留时间，以鉴定样品中的组分酚类化合物。</li>
	<li>绘制酚酸混合标准品的校准曲线，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标。</li>
	<li>利用校准曲线，通过比较提取物中各化合物在 280 nm 和 320 nm 波长下的峰面积与校准曲线上对应峰面积，估算已鉴定酚类化合物的浓度。</li>
</ol>
4. 总酚含量
注意：使用 F. B. Apea-Bah 等人13所述的福林-酚法（Folin-Ciocalteu 法）测定提取物的总酚含量。
<ol>
	<li>配制浓度范围为 0.025 至 0.150 mg/mL 的阿魏酸和没食子酸标准品，用于绘制校准曲线，以估算总酚含量。</li>
	<li>准确称取 1 mg 阿魏酸标准品和 1 mg 没食子酸标准品，分别置于 2 mL 容量的离心管中。</li>
	<li>向每种标准品中加入 1 mL 50% 的甲醇水溶液，涡旋振荡至溶解，得到每种标准品浓度为 1 mg/mL 的储备液。</li>
	<li>将每种储备液系列稀释至总体积为 500 µL。</li>
	<li>用移液器分别吸取 18.2 µL 提取物或标准品溶液，加入至 96 孔微孔板的不同孔中。</li>
	<li>向每个提取物或标准品孔中加入 36.4 µL 10% (v/v) 的福林-酚试剂水溶液。</li>
	<li>随后，向每个反应体系中加入 145.4 µL 700 mM 碳酸钠溶液。</li>
	<li>将反应混合物在室温（20–25 °C）避光条件下孵育 2 小时。</li>
	<li>使用微孔板读数仪在 750 nm 波长下测定吸光度。</li>
	<li>以酚酸标准品浓度为横坐标、吸光度变化值为纵坐标绘制校准曲线，并据此估算总酚含量。</li>
	<li>结果以每克粉碎样品中阿魏酸当量的毫克数（mg FAE/g）和每克粉碎样品中没食子酸当量的毫克数（mg GAE/g）表示，按干重基础计算。</li>
</ol>
5. 抗氧化活性检测
注意：使用以下三种方法测定谷物提取物的抗氧化能力：2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除能力；2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除能力，也称为Trolox当量抗氧化能力（TEAC）；以及氧自由基吸收能力（ORAC）。
<ol>
	<li>制备用于标准曲线的Trolox标准品
	<ol>
		<li>使用水溶性维生素E类似物Trolox作为标准品来估算 体外 全谷物提取物的抗氧化能力</li>
		<li>准确称取1 mg Trolox至15 mL离心管中，加入4 mL 50%甲醇水溶液溶解，涡旋混匀至完全溶解，配制成1 mM的储备液（1000 µM).</li>
		<li>制备六种浓度的Trolox，即50、100、200、400、600和 800 µM 用于绘制DPPH自由基清除能力和Trolox当量抗氧化能力（TEAC）的标准曲线。同样，配制6.25、12.5、25和 50 µM 用于评估氧自由基吸收能力（ORAC）的Trolox浓度。将每种浓度的总体积定容至 500 µL 如图所示 表1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品提取液的稀释
	<ol>
		<li>在分析前用甲醇稀释样品提取物。此处，黄玉米和豇豆提取物用甲醇稀释2倍，小麦和芸豆提取物稀释5倍，而大豆提取物则用甲醇稀释10倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trolox当量抗氧化能力（TEAC）检测
	<ol>
		<li>采用 F. B. Apea-Bah 等人先前所述的方法测定样品的 Trolox 当量抗氧化能力（TEAC）。14.</li>
		<li>称取 8.23 mg ABTS 置于洁净的 2 mL 棕色离心管中。</li>
		<li>接下来，将1.62 mg过硫酸钾称量至另一支洁净的2 mL棕色离心管中。</li>
		<li>向每个样品中加入 1 mL 蒸馏水，涡旋振荡以溶解。 
		注意：这将得到含有6 mM过硫酸钾水溶液的16 mM ABTS储备液。</li>
		<li>将ABTS溶液与过硫酸钾溶液等体积混合，配制ABTS储备液。溶液会立即变为深色。</li>
		<li>在避光条件下孵育试剂混合物 12-16 小时。</li>
		<li>将 ABTS 储存液用 200 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释 30 倍，配制 ABTS 工作液。具体操作为：向 2 mL ABTS 储存液中加入 58 mL 200 mM PBS。所得工作液含有 0.27 mM ABTS 和 0.1 mM 过硫酸钾。</li>
		<li>用于分析时，放置 10 µL 将每种稀释后的提取物或Trolox加入96孔微孔板中。</li>
		<li>添加 190 µL 向每孔中加入ABTS工作液，并将反应混合物孵育60分钟。</li>
		<li>在微孔板读数仪中测定反应混合物在 750 nm 处的吸光度。</li>
		<li>使用浓度范围为100至 800 µmol/L 绘制校准曲线。</li>
		<li>根据标准曲线估算ABTS自由基清除能力。</li>
		<li>以每克微摩尔 Trolox 当量表示结果（µmol TE/g）样品（以干重计）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DPPH 检测 
	注意：采用 F. B. Apea-Bah 等人先前描述的方法测定样品的 DPPH 自由基清除能力。13DPPH抗氧化实验需要一种自由基生成化合物DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）。
	<ol>
		<li>准确称取1.2 mg DPPH至一个空的50 mL离心管中。加入30 mL甲醇溶解DPPH，以配制 60 µmol/L 甲醇溶液 
		注意：DPPH 实验用于检测样品提取物对 DPPH 产生的自由基的清除能力。</li>
		<li>用于分析，加入 5 µL 将样品提取物或 Trolox 溶液加入微孔板孔中。</li>
		<li>接下来，加入 195 µL 的 60 µmol/L DPPH 甲醇溶液，孵育 60 分钟。</li>
		<li>在515 nm处测定反应混合物的吸光度。</li>
		<li>使用 Trolox 标准品（50-800 µmol/L以吸光度变化值为纵坐标，Trolox 浓度为横坐标，绘制标准曲线。</li>
		<li>根据标准曲线估算DPPH清除能力。</li>
		<li>以每克微摩尔 Trolox 当量表示结果（µmol 以干重计的每克样品中TE含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氧自由基吸收能力
	<ol>
		<li>根据 F. B. Apea-Bah 等人的方法测定样品的氧自由基吸收能力（ORAC）13.</li>
		<li>首先，配制浓度分别为 6.25、12.5、25 和 50 µM 从一个 1,000 µM 75 mM 磷酸钾（K2HPO4/KH2PO4）缓冲液。</li>
		<li>为此，称取1 mg Trolox粉末，在超声条件下溶于4 mL缓冲溶液中以配制 1,000 µM 储备液</li>
		<li>然后，取 50 µL 将贮存液移入一支2 mL容量的离心管中，并用水稀释至刻度 950 µL 缓冲溶液以获得 1,000 µL 的 50 µM Trolox 溶液</li>
		<li>移液器 500 µL 的 50 µM 将溶液转移至新离心管中，加入等体积缓冲液混匀，以获得 25 µM Trolox 溶液</li>
		<li>重复进行该系列稀释 25 µM 以获得 12.5 µM，然后以相同方式重复稀释步骤 12.5 µM 以获得 6.25 µM.</li>
		<li>制备样品提取液的适当稀释液。</li>
		<li>将玉米和豇豆提取物用缓冲液稀释20倍，小麦和芸豆提取物稀释50倍，大豆提取物稀释100倍。</li>
		<li>转移 200 µL 将每个样品或Trolox标准品加入黑色96孔微孔板的孔中，用于自动移液。</li>
		<li>然后，将ORAC设备配备的三个试剂罐分别加入以下试剂：（1）缓冲溶液；（2）含0.816 nM荧光素的缓冲液；（3）含153 mM 2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride（AAPH）的缓冲液。</li>
		<li>将它们放入自动移液装置的容器中。</li>
		<li>根据标准操作程序，设置ORAC仪器和自动移液系统以进行分析。</li>
		<li>用于分析时，设置自动化移液系统以进行转移 25 µL 向黑色96孔微孔板（透明底）的各孔中加入等量稀释后的提取物或标准品。</li>
		<li>然后，自动添加 150 µL 缓冲液中0.816 nM荧光素</li>
		<li>将反应混合物置于 37 °C 在ORAC仪器中持续15分钟。</li>
		<li>随后，自动添加 25 µL 向每份反应混合物中加入AAPH。</li>
		<li>在 37 °C 在ORAC仪器中反应50分钟。</li>
		<li>设置ORAC仪器，以485 nm和520 nm分别为激发波长和发射波长，在孵育期间测定荧光衰减。</li>
		<li>测量结束后，绘制Trolox标准曲线，以Trolox（6.25-50 µM横轴为时间，纵轴为荧光衰减。</li>
		<li>根据Trolox标准曲线估算提取物的氧自由基吸收能力。</li>
		<li>以……表示结果 µmol 以干重计，每克样品中的TE含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>以至少三个重复实验的均值 ± 标准差形式呈现所有结果。</li>
		<li>采用方差分析（ANOVA）确定谷物类型对响应变量的影响。</li>
		<li>在 p 值存在显著差异处 &lt; 0.05，采用最小显著差异法（LSD）进行均值比较。</li>
		<li>进行皮尔逊相关性分析，以评估酚类物质含量与抗氧化能力之间的关系。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

全谷物被选为具有广泛食品应用的代表性谷物和豆类。尽管每种谷物的不同栽培品种之间可能存在差异，但本研究的重点是展示一种适用于全谷物的游离酚酸提取与分析的通用方法。该提取方法经过改进，显著减少了样品和溶剂的用量，从而在进行此类实验时降低释放到环境中的化学物质数量。该改进还使得能够从毫克量级的全谷物样品中进行酚类物质的提取。
高效液相色谱（HPLC）分析可生成样品中各酚酸组分的色谱图。通过将每个代表酚酸的色谱峰在预设波长下的保留时间与标准品酚酸的保留时间进行比较，即可鉴定其种类。通常使用紫外（UV）检测器在紫外波长范围内鉴定酚酸。羟基苯甲酸类通常在254–280 nm波长范围内鉴定，而羟基肉桂酸类通常在300–330 nm波长范围内鉴定15。光电二极管阵列检测器可用于扫描整个紫外-可见光波长范围，对于确定从未研究过的样品中所含化合物的紫外-可见吸收光谱特别有用。R. J. Robbins 和 S. R. Bean15 报道了香草酸、咖啡酸、p-香豆酸和阿魏酸的最大吸收波长分别...

酚酸是植物中研究最为重要的植物化学物质之一，因其在植物抵御食草动物和真菌感染方面发挥关键作用，同时维持植物组织的结构支撑与完整性1,2。它们广泛存在于谷物的麸皮和豆类的种皮中3。从结构上可分为两类：羟基苯甲酸（图1）和羟基肉桂酸（图2）。谷物和豆类中常见的羟基苯甲酸包括没食子酸、p-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草酸和丁香酸，而常见的羟基肉桂酸则包括咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸3。酚酸还具有抗氧化特性，因其能够清除导致脂肪氧化酸败以及在生理系统中引发并传播自由基诱导的氧化应激的自由基4,5。由于其作为抗氧化剂的重要生理功能，酚酸已成为近期研究的焦点。这是因为当作为植物性食物的组成部分被摄入时，它们可提供抗氧化保护作用。
谷物及其制品是全球人类和动物主要的碳水化合物食物来源6。谷物包括小麦、水稻、玉米（玉蜀黍）、大麦、小黑麦、小米和高粱。其中，玉米的利用量最高，2019/2020年度全球利用量估计为11.357亿吨，其次是小麦，同期全球利用量估计为7.575亿吨7。谷物食品为消费者提供了丰富的能量，因其富含碳水化合物，同时还提供一定量的蛋白质、脂肪、膳食纤维、维生素和矿物质6。除营养价值外，谷物也是植物化学抗氧化剂的良好来源，尤其是酚酸类物质，具有保护生理系统免受自由基诱导的氧化损伤的潜力3。豆类同样富含营养成分，通常其蛋白质含量高于谷物，还含有多种维生素和矿物质，广泛用于各类食品的制备8。此外，豆类也是多种植物化学抗氧化剂的良好来源，包括酚酸、黄酮类、花青素和原花青素9,10。不同品种的谷物和豆类可能具有不同的酚酸组成。因此，有必要研究谷物、豆类及其品种的酚酸组成，以了解其在酚酸类抗氧化剂方面的潜在健康益处。
已有多种检测方法用于测定谷物和豆类籽粒中酚酸的含量及其抗氧化活性。全谷物酚酸分析最常用的方法是分光光度法和液相色谱法11。本研究旨在展示一种通用的高效液相色谱法，用于测定部分全谷物谷物和豆类中游离可溶性酚酸的组成，以及采用分光光度法测定其总酚含量和抗氧化能力。

<table><tbody><tr><td>15 mL Falcon 锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 棕色玻璃 ID Surestop 瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>C5000-2W</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 棕色微量离心管</td><td>VWR</td><td>20170-084</td><td></td></tr><tr><td>2,2&amp;prime;-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐 (AAPH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440914-100G</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-偶氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸] (ABTS) (C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) &amp;ge;98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1888-2G</td><td></td></tr><tr><td>2,2-二苯基-1-苦肼基 (DPPH) (C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D913-2</td><td></td></tr><tr><td>6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸 (Trolox) (C&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)，&amp;ge;98%</td><td>Fluka Chemika</td><td>56510</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动进样瓶螺纹盖</td><td>Thermo Scientific</td><td>60180-670</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioTek ELx800 微孔板读板仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>BT-ELX800NB</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioTek Precision 2000 96/384 自动化微孔板移液系统</td><td>Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioTek FLx800 微孔板荧光读板仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>分析天平 SI-114</td><td>Denver Instrument</td><td>SI-114.1</td><td></td></tr><tr><td>自动进样器，Waters 717 Plus</td><td>Waters</td><td>WAT078900</td><td></td></tr><tr><td>BD 3 mL 带鲁尔锁头式注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Bransonic 超声清洗器，Branson 5510</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z245143</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE 涡旋混合器</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 滤膜 (0.45 &amp;micro;m PVDF 膜)</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>HVLP04700&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 膜滤器 (0.45 &amp;micro;m HV)</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>HVHP04700</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;nbsp;plus，0.5–10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;nbsp;plus，0.5–5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3123000071</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;nbsp;plus，100–1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;nbsp;plus，10–100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯，HPLC 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>E195-4</td><td></td></tr><tr><td>阿魏酸标准品</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128708-5G</td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC119245000</td><td></td></tr><tr><td>福林-酚试剂 (Folin &amp; Ciocalteu 酚试剂)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，99%</td><td>Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a</td><td>27048-0010</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸标准品</td><td>Sigma</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪 (HPLC)，Waters 2695</td><td>Waters</td><td>960402</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，HPLC 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头，0.5–10 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>21-197-2F</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机 Sorvall Legend Micro 21 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002435</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器，Proline Plus，30–300 &amp;micro;L</td><td>Sartorius</td><td>728240</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管阵列检测器，Waters 2996</td><td>Waters</td><td>720000350EN</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1000 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1–5 mL</td><td>VWR</td><td>82018-840</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸钾 (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;)，&amp;ge;99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216224-100G</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钾 (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>PYREX 250 mL 短颈圆底烧瓶</td><td>Corning</td><td>4321-250</td><td></td></tr><tr><td>反相 C18 分析柱 (100 × 3 mm) Accucore aQ</td><td>Thermo Scientific</td><td>17326-103030</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪，IKA RV 10</td><td>IKA</td><td>&amp;nbsp;0010005185</td><td></td></tr><tr><td>无水碳酸钠 (NaCO3)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Mallinckrodt AR&amp;reg;</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钠 (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher bioreagents</td><td>BP329-500</td><td></td></tr><tr><td>标准化移液器吸头 0–200&amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-134</td><td></td></tr><tr><td>注射器式滤器单元 (0.22 &amp;micro;m)</td><td>&amp;nbsp;Millex&amp;reg;-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Target 微量内插管 (400 &amp;micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-631</td><td></td></tr><tr><td>超纯水 (Direct Q-3 UV 系统配泵)</td><td>Millipore</td><td>ZRQSVP030</td><td></td></tr></tbody></table>

一种测定谷物和豆类中游离可溶性酚酸组成及抗氧化能力的通用方法

A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes

酚酸是一类同时含有酚基和羧基的有机化合物。它们存在于谷物中，主要集中于谷物的麸皮或豆类的种皮中。酚酸具有抗氧化特性，近年来因其潜在的抗氧化保护健康功能而受到广泛研究关注。本研究介绍了一种从全谷物中提取游离可溶性酚酸并分析其抗氧化能力的通用方法。实验选用了五种全谷物样品，包括两种谷类（小麦和黄玉米）和三种豆类（豇豆、肾豆和大豆）。将谷物研磨成粉后，使用甲醇水溶液提取其中的游离可溶性酚酸。随后采用高效液相色谱法（HPLC）对化合物进行鉴定。采用福林-酚法测定总酚含量，通过DPPH自由基清除能力、Trolox当量抗氧化能力（TEAC）和氧自由基吸收能力（ORAC）三种检测方法评估其抗氧化能力。鉴定出的酚酸包括香草酸、咖啡酸、p-香豆酸和阿魏酸。其中，香草酸仅在豇豆中检出，咖啡酸仅在肾豆中检出；p-香豆酸在黄玉米、豇豆和大豆中均有检出，而阿魏酸在所有样品中均被检出，且为最主要的酚酸成分。各样品中酚酸总浓度的递减顺序为：大豆 &gt; 豇豆 &gt; 黄玉米 = 肾豆 &gt; 小麦。总抗氧化能力（DPPH、TEAC和ORAC测定值之和）的递减顺序为：大豆 &gt; 肾豆 &gt; 黄玉米 = 豇豆 &gt; 小麦。本研究表明，HPLC分析以及DPPH、TEAC和ORAC测定方法可为全谷物中酚酸组成及其抗氧化特性提供有价值的信息。

表2 显示了在谷物和豆类籽粒中鉴定出的酚酸。根据现有的标准品，样品中鉴定出四种酚酸，分别为：香草酸、咖啡酸、p-香豆酸和阿魏酸。香草酸属于羟基苯甲酸，其余三种属于羟基肉桂酸。香草酸仅在黑眼豇豆中被检出，而咖啡酸仅在肾豆中被检出。p-香豆酸在黄玉米、豇豆和大豆中均有检出，其浓度范围为7.57至12.48 µg/g面粉（以干重计），其中黄玉米含量最低，大豆含量最高。阿魏酸是唯一在所有样品中均被检出的酚酸，其浓度范围为5.69至41.76 µg/g面粉（以干重计）。在各样品中，阿魏酸含量以大豆最高，其次为豇豆，而小麦、黄玉米和肾豆的含量相近（表2）。当将各样品中所有酚酸浓度加总后，其总含量按以下顺序递减：大豆 &gt; 豇豆 &gt; 黄玉米 = 肾豆 &gt; 小麦。
表3展示了谷物和豆类籽粒的总酚含量（TPC）及抗氧化能力。抗氧化能力包括DPPH自由基清除能力、TEAC和ORAC。因此，这三项数值的总和即为样品的总抗氧化能力。为便于比较，TPC以阿...

酚酸是存在于全谷物中的重要植物化学物质，具有抗氧化保护功能等生物活性特性。本研究旨在报道一种通用方法，用于谷物和豆类中酚酸的高效液相色谱鉴定、总酚含量测定以及抗氧化能力的确定。

酚酸是一类同时含有酚基和羧基的有机化合物。它们存在于谷物中，并在……中富集。

一种测定谷物和豆类中游离可溶性酚酸组成及抗氧化能力的通用方法。全谷物，包括谷类和豆类，是人类膳食的重要组成部分。其对人类的营养重要性早已被认识。然而，最近有报道称，它们具有抗氧化保护作用，对健康有益。谷物外层和豆类种皮中含有的酚酸有助于全谷物的抗氧化特性。这些酚酸能够清除对生物大分子造成氧化损伤的自由基。全谷物中发现的两类酚酸为羟基苯甲酸和羟基肉桂酸。本研究提供了一种提取全谷物酚酸并测定其体外抗氧化能力的简单方法。本研究使用五种全谷物样品：硬粒小麦、黄玉米、黑眼豇豆、大豆和红芸豆。将100毫克全麦面粉样品直接准确称量至一个2毫升容量的棕色微量离心管中。管子的深色有助于防止混合物暴露于光线下。向每个含有样品的管中加入1毫升80%的水-甲醇溶液。涡旋混匀甲醇溶液与样品。将样品超声处理60分钟，以提取游离可溶性酚类化合物。超声过程中用盖子覆盖样品，以提供额外的避光保护。超声处理后，将混合物在20,000 × g条件下离心5分钟，使固体残渣沉淀，上清液位于上层。离心后，游离酚类化合物存在于上清液中。在注入HPLC仪器前，需将上清液过滤。过滤上清液时，取下3 mL注射器的活塞，并安装一个注射器滤器。滤器的孔径不应大于0.22微米。用移液器将约0.4毫升的上清液加入注射器顶部。重新插入推杆，将液体通过滤膜推入含有小瓶插件的高效液相色谱小瓶中。在仪器已设置为运行手稿中所述的高效液相色谱分析方法后，将小瓶按样品列表顺序装入自动进样盘。在320纳米和280纳米波长下获取高效液相色谱图，图中应显示代表不同酚类化合物的明显色谱峰。使用适当的标准曲线，在320纳米波长处定量羟基肉桂酸，因为它们在此波长下具有最大吸收峰。依据相同原理，在280纳米波长处定量羟基苯甲酸。采用Trolox（一种水溶性维生素E类似物）作为标准品，以评估全谷物提取物的体外抗氧化能力。准确称取1毫克Trolox至一个Falcon管中。加入4毫升50%的水-甲醇溶液溶解，配制成1毫摩尔/升（即1000微摩尔/升）的储备液。配制6个浓度的Trolox溶液，分别为50、100、200、400、600和800微摩尔/升，用于绘制标准曲线，以评估DPPH自由基清除能力和Trolox当量抗氧化能力（TEAC）。同样，配制用于评估氧自由基吸收能力（ORAC）的 6.25、12.5、25 和 50 微摩尔/升的 Trolox 溶液。每种浓度的总体积定容至 500 微升，如表一所示。在分析前，用甲醇稀释样品提取物。此处，将黄玉米和豇豆提取物稀释2倍，小麦和芸豆提取物稀释5倍，大豆提取物用甲醇稀释10倍。称取8.23毫克ABTS，加入洁净的、容量为2毫升的棕色微量离心管中。接下来，将1.62毫克过硫酸钾称量至一个洁净的、容量为2毫升的棕色微量离心管中。通过涡旋振荡使每种称量好的化学物质溶于1毫升蒸馏水中。由此得到16毫摩尔的ABT

a-generalized-method-for-determining-free-soluble-phenolic-acid

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

一种测定谷物和豆类游离可溶性酚酸组成和抗氧化能力的广义方法

本文介绍了一种利用自由区带毛细管电泳法检测和定量植物材料中有机酸的方法。文中提供了一个该方法潜在应用的示例，即测定二次发酵对咖啡种子中有机酸含量的影响。...

利用毛细管电泳定量植物组织中的有机酸：以Coffea arabica种子为例的研究

本文所述的实验方案为测定植物组织中可溶性蛋白质和可消化（非结构性）碳水化合物含量提供了清晰且易于操作的方法。准确量化这两种植物宏量营养素，对于推动植物生理学、营养生态学、植物与植食性动物相互作用以及食物网生态学等领域的研究具有重要意义。...

量化植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量——以玉米（Zea mays）为例

我们提出了一种利用UPLC-UV快速、可靠地定量Lactuca...

改良的UPLC-UV法用于测定莴苣品种（Lactuca sativa L.）及作物野生近缘种（Lactuca spp.）中维生素C的含量

本实验方案的目的是采用半靶向色谱-质谱联用方法检测血浆中的酚类代谢物。...

老年人血浆中酚类代谢物的半靶向超高效液相色谱-质谱联用分析

本文描述了几种旨在对Gracilaria...

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我们展示了一种利用超高效液相色谱法对单粒花生种子中黄曲霉毒素和芪类植物抗毒素进行中通量定量分析的方法。该方法专为野生种 花生属 由产毒黄曲霉菌挑战的物种 曲霉属...

基于非破坏性SPE-UPLC法对单粒花生（Arachis spp.）种子中黄曲霉毒素和芪类植物抗毒素的定量分析

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基于多元醇技术的微波辅助提取酚类化合物及抗氧化剂在化妆品中的应用

本研究比较了多糖含量 Hippophae rhamnoides 亚种. sinensis 鲁西和 Hippophae gyantsensis (Rousi) Y. S. Lian 通过热水提取法获得，并采用苯酚-硫酸比色法进行定量。我们还研究了 体外 这两种多糖的抗氧化活性 沙棘...

中国台湾地区植物Hippophae rhamnoides subsp. sinensis与Hippophae gyantsensis多糖含量及抗氧化活性的比较研究

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通过微波辅助酸催化法制备二氧化硅纳米颗粒

学习使用高效液相色谱法和多种抗氧化测定法分析谷物和豆类中游离可溶性酚酸的组成与抗氧化能力。该方法通过提取、分离和定量检测，为评估全谷物的健康营养价值提供了简单可重复的实验方案。

一种测定谷物和豆类中游离可溶性酚酸组成及抗氧化能力的通用方法

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