利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

本方案用于研究紧密连接的转运特性。通过稀释电位法，可测量其选择透过性，从而了解组织中紧密连接的功能特性。该技术具有特异性，利用天然组织对上皮细胞进行功能性研究。

此外，该技术可测量组织的实时生理特性，具有重要价值。最大的挑战在于组织制备。通过练习该技术并观看本视频将有助于掌握。

确认组织活性也是重要的步骤。首先，将从claudin-15基因敲除小鼠获取的目标肠段组织放入冰冻的通氧Ringer溶液中，去除脂肪和结缔组织。去除脂肪和结缔组织后，沿肠系膜附着处纵向剪开每个肠段，然后将肠段重新放回冰冻Ringer溶液中，并充分清洗组织片段。

为了剥离肌层，将两到三毫升新鲜的冰冻充氧林格液倒入置于解剖显微镜下的硅胶包被解剖盘中，用解剖针固定一段肠组织的两端，使黏膜面朝下。使用精细镊子，钝性分离肌层与下方的黏膜组织，注意避免撕裂或在组织上造成任何孔洞。一旦肌层被去除，裁剪出足够覆盖直径五毫米孔径的组织片，将组织黏膜面朝下放置于经林格液润湿的直径五毫米打孔滤纸上，并使用黑色背景确保滤纸上的孔完全被组织覆盖且无皱褶。

将肠段制备物安装到尤辛室中时，首先在拆卸尤辛室前移除其中的任何溶液。将带有肠段制备物的滤纸黏膜面朝下放置在尤辛室的黏膜侧，利用黑色标记对齐尤辛室窗口与滤纸上的孔。小心地将浆膜侧室与黏膜侧室连接，注意不要移动肠组织片。

用HEPES缓冲液迅速重新充满两个腔室，并将通气的缓冲液置于每个腔室远离膜的另一端。重新连接盐桥，检查电压是否稳定，然后施加脉冲电流以确认连接正常，随后让系统平衡约15分钟。进行稀释电位实验时，首先用每侧5毫升新鲜预热的HEPES缓冲液冲洗腔室的两侧。

打开记录系统并将量程设置为 250 毫伏。设定标记位置，将记录系统设为测量模式，并将 Ussing 室系统设为钳制模式。待测量电位稳定后，即可使用数据进行测量。

迅速将腔面上的 HEPES 缓冲液更换为 5 毫升含 75 毫摩尔氯化钠的预温稀释 HEPES 缓冲液。当膜电位达到峰值后，将腔面上的稀释缓冲液更换为新鲜的 HEPES 缓冲液。为确保组织具有活性，向浆膜侧加入 10 微摩尔佛司可林。

当膜电位差达到峰值并开始下降时，实验即告结束。测量跨上皮电导和基础短路电流时，在按演示方法清洗灌流室两侧后，向每侧加入五毫升新鲜预通氧的林格液，并将记录系统的量程设为2.5伏。设定标记位置，将记录系统设为测量状态，并将尤辛室系统设为钳制模式。

当短路电流和电导稳定后，使用这些数据作为基线测量值。为确保组织具有活性，按所示方法向浆膜侧添加佛司可林（Forskolin）。一旦膜电位差达到峰值并开始下降，实验即告结束。

在此代表性分析中，在短路条件下，与野生型小鼠相比，claudin-15 基因敲除小鼠中段小肠节段的基础跨黏膜电导率较低，而基础短路电流较高。当管腔内氯化钠被稀释时，野生型小鼠相对于浆膜侧出现正电位差，但在 claudin-15 基因敲除小鼠中该电位差减小。类似地，基因敲除动物中氯化钠的相对通透性也降低。

绝对通透性的计算结果显示，在claudin-15基因敲除小鼠中，钠离子的绝对通透性降低，而氯离子的绝对通透性未发生改变，这表明相对通透性的下降是由于钠离子通透性降低所致。正如预期，将Forskolin添加至室腔的浆膜侧后，基因敲除小鼠与野生型小鼠在短路电流变化上未表现出显著差异。由于肠段对Forskolin表现出足够大的反应，因此认为膜制备物具有活性。

进行适当的肌层去除并确保组织具有活性非常重要。无论制备是否可行，都请冲洗小鼠的解剖部位。