Name: 通过Ussing Chamber技术评估天然组织中肠道紧密连接屏障和离子渗透性的功能评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学习使用Ussing Chamber技术评估肠道紧密连接屏障功能，通过测量跨上皮电导和稀释电位来分析claudin-15敲除小鼠的离子渗透性。该方法为研究生理条件下上皮转运机制提供了可靠手段。

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本工作由17K00860（资助HH）和19K20152（资助NI）支持。WH感谢大塚利子奖学金基金会2018年至2021年提供的经济资助。

本实验所使用的所有动物均饲养于静冈大学的动物饲养设施中，实验过程严格遵循静冈大学规定的动物研究指南。所有实验均获得静冈大学动物护理与使用委员会的批准（许可证号 #205272 和 #656-2303）。
1. NaCl 电极的制备
注意：本实验所用的电极含有浓 NaCl 或 KCl。KCl/甘汞电极为商业购买。实验开始前，需确保所有电极均用浓 NaCl 或 KCl 溶液填充至顶端。
<ol>
	<li>准备带有塑料盖的小玻璃瓶（体积为 20 mL）。</li>
	<li>在塑料盖上钻两个孔，一个用于 NaCl 盐桥（直径 2.5 mm），另一个用于银丝（直径 1 mm；图 1C，NaCl 电极）。</li>
	<li>将玻璃瓶中装满饱和 NaCl 溶液（约 15 mL，直至装满）。</li>
	<li>将银丝（直径 0.8 mm，长 7 cm）插入瓶中，但需确保瓶外的银丝部分可通过小号鳄鱼夹与放大系统连接。</li>
	<li>不使用时，用封口膜包裹电极并盖住孔洞，防止干燥。</li>
</ol>
2. 盐桥的制备
注意：盐桥需至少在实验前一天制备，以确保有充足的时间凝固。盐桥可重复使用，但不建议使用超过2个月后的盐桥。
<ol>
	<li>NaCl 盐桥
	<ol>
		<li>准备 #7 聚乙烯管（外径 2.3 mm，内径 1.3 mm）、19 G 针头和锁紧式注射器、200 mL 1 M NaCl 溶液、2 g 琼脂、用于储存盐桥的可密封塑料容器。</li>
		<li>根据 Ussing 室装置所需的长度裁剪管材，制备适当数量的盐桥（每个腔室需要两个盐桥）。</li>
		<li>在注入琼脂前，将管子弯成 U 形，并置于温水中（以便于形成适合安装盐桥的形状）。</li>
		<li>通过将 11.688 g NaCl 溶解于 200 mL 去离子水中，配制 200 mL 1 M NaCl 溶液。</li>
		<li>将 1 M NaCl 溶液分成两份 100 mL：取其中一份配制含 2% 琼脂的 1 M NaCl 溶液（将 2 g 琼脂加入 NaCl 溶液中，微波加热至完全溶解）。</li>
		<li>使用 19 G 针头和锁紧式注射器，将注射器吸入 1 M NaCl/琼脂混合溶液。轻轻逐滴排出溶液，同时将针头插入管子一端，持续填充至混合物从另一端溢出。</li>
		<li>在继续排出溶液的同时缓慢拔出针头，重复此操作直至完成所有所需盐桥的制备。（若溶液在注射器或针头中凝固，可短暂将其浸入热水中加热，直至溶液恢复流动性。）</li>
		<li>检查盐桥，确保无气泡存在，并将其储存在密封容器中剩余的 1 M NaCl 溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>KCl 盐桥 
	注意：KCl 琼脂盐桥使用更细的管材，以避免因盐桥尖端溶解导致 K+ 泄漏至缓冲液中而引起 K+ 浓度升高。
	<ol>
		<li>准备 #3 聚乙烯管（外径 1.0 mm，内径 0.5 mm）、23 G 针头和锁紧式注射器、200 mL 1 M KCl 溶液、2 g 琼脂、用于储存盐桥的可密封塑料容器。</li>
		<li>根据 Ussing 室装置所需的长度裁剪管材，制备适当数量的盐桥（每个腔室需要两个盐桥）。</li>
		<li>通过将 14.91 g KCl 溶解于 200 mL 去离子水中，配制 200 mL 1 M KCl 溶液。</li>
		<li>将溶液分成两份 100 mL：取其中一份配制含 2% 琼脂的 1 M KCl 溶液（将 2 g 琼脂加入 KCl 溶液中，微波加热至完全溶解）。</li>
		<li>使用 23 G 针头和锁紧式注射器，以与制备 NaCl 盐桥相同的方式，将 2% 琼脂的 1 M KCl 混合液注入管材中（确保管子完全填充且无气泡）。</li>
		<li>检查盐桥，确保无气泡存在，并将其储存在密封容器中剩余的 1 M KCl 溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 林格氏液和HEPES缓冲液的配制
注意：根据安装在尤斯室中的组织类型，林格溶液的成分可能有所不同。此处提供的配方专门适用于小肠和大肠。
<ol>
	<li>按照实验当天所述方法新鲜配制任氏液 表1.</li>
	<li>用95% O₂对溶液进行鼓泡处理2/5% CO₂2 提供 O2 对组织具有缓冲能力。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:508px;" width="507">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>林格液（小肠）</td>
			<td>林格液（大肠）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 – 21.0 mM</td>
			<td>NaHCO3 – 21.0 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4 – 2.4 mM</td>
			<td>K2HPO4 – 2.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 – 0.6 mM</td>
			<td>KH2PO4 – 0.6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl – 119.0 mM</td>
			<td>NaCl – 119.0 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 – 1.2 mM</td>
			<td>MgCl2 – 1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 – 1.2 mM</td>
			<td>CaCl2 – 1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>吲哚美辛 – 10 µM（用 21 mM NaHCO3 配制 1 mM 储存液，每 1 L 林格液加入 10 mL 储存液）</td>
			<td>吲哚美辛 – 10 µM（用 21 mM NaHCO3 配制 1 mM 储存液，每 1 L 林格液加入 10 mL 储存液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM 谷氨酰胺（0.146 g/L）</td>
			<td>10 mM 葡萄糖</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：林格氏液配方。 配制林格氏液时，将所有成分与去离子水混合。林格氏液最好在实验前新鲜配制。配制后置于冰箱中或冰上保存直至使用。使用前用95% O2/5% CO2气体饱和。
<ol start="3">
	<li>按照 表2 所述，在实验当天用去离子水混合试剂，新鲜配制 HEPES 缓冲液。</li>
	<li>在调节 pH 值之前，不要定容至缓冲液的最终体积。</li>
	<li>将 HEPES 缓冲液预热至 37 °C，并在搅拌过程中缓慢滴加 1 M Tris 溶液，调节 pH 至 7.4。</li>
	<li>加入适量去离子水，定容至最终体积。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:508px;" width="507">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES 缓冲液</td>
			<td>稀释用 HEPES 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES – 10 mM</td>
			<td>HEPES – 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖 – 10 mM（大肠）</td>
			<td>葡萄糖 – 10 mM（大肠）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>谷氨酰胺 – 1 mM (0.146 g/L)（小肠）</td>
			<td>谷氨酰胺 – 1 mM (0.146 g/L)（小肠）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl – 150 mM</td>
			<td>NaCl – 75 mM + 150 mM 甘露醇（用于调节渗透压差异）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 – 1 mM</td>
			<td>MgCl2 – 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 – 2 mM</td>
			<td>CaCl2 – 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>吲哚美辛 – 10 µM（用 21 mM NaHCO3 配制 1 mM 储存液，每 1 L 林格液加入 10 mL 储存液）</td>
			<td>吲哚美辛 – 10 µM（用 21 mM NaHCO3 配制 1 mM 储存液，每 1 L 林格液加入 10 mL 储存液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">使用 1 M Tris 将 pH 调至 7.40（37°C）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：HEPES缓冲液配方。 配制HEPES缓冲液及稀释用HEPES缓冲液时，将所有成分溶解于去离子水中。溶液需用1 M Tris溶液调节pH值，因此不要加入全部体积的水（例如，配制1 L时，先将所有成分溶解于约800 mL水中）。然后将溶液加热至37 °C，调节pH至7.4，最后定容至所需体积。
4. 尤斯室装置设置
注意：本方案中使用的尤辛室为定制的连续灌流室。为评估小鼠肠道屏障功能或营养物质吸收，建议使用直径为 4 或 5 mm 开口的室腔25（图 1A-C）。
<ol>
	<li>为减少边缘效应26并有助于密封腔室，在组装前贴上打有4至5 mm孔的石蜡膜（约4 cm2）（图1B）。</li>
	<li>在开路条件下进行稀释电位测量。将系统设置为电流钳模式。将输出设为电流，并设置电流脉冲为±20 µA。</li>
	<li>在短路条件下测量短路电流和跨黏膜电阻时，将系统设置为电压钳模式。将输出设为电压，并设置电压脉冲为±5 mV。</li>
	<li>确保水浴夹层中循环的水温为37 °C。</li>
	<li>用林格氏液或HEPES缓冲液填充每个腔室（体积取决于所用系统，此处使用的腔室每侧需5 mL），并确保无泄漏。</li>
	<li>连接盐桥和电极。</li>
	<li>确认电压为0且稳定，施加电流脉冲以确保盐桥和电极正确安装。</li>
	<li>让系统和林格氏液温度平衡至少20分钟。</li>
	<li>平衡后，校正KCl电极之间的不对称电压差，并通过调节使其为零来补偿液体电阻（请查阅所用Ussing腔系统的操作手册，以确定正确的校正方法）。</li>
</ol>
5. 肠道组织的解剖
注意：所有动物实验必须在国家和大学规定的监管范围内进行。
<ol>
	<li>在取肠道组织之前，配制新鲜的冰冻林格氏液，并用95% O2 和5% CO2 气体饱和15分钟（步骤3）。</li>
	<li>根据实验动物使用指南对小鼠进行麻醉。本实验中，使用麻醉机给予2%-3%异氟烷进行麻醉。通过轻捏脚趾检查麻醉效果，确保小鼠无疼痛反应。</li>
	<li>用剪刀从骨盆至横膈膜处沿腹部做切口；找到胃部，并切断胃的幽门端。</li>
	<li>用镊子夹住与小肠相连的胃部组织，在剪除肠系膜附着物的同时轻轻牵拉小肠。注意不要切割或损伤肠道组织。</li>
	<li>继续解剖肠道直至肛门。如需完整移除大肠，可剪开骨盆骨以暴露大肠远端，并通过剪除附着组织小心取出剩余肠道。</li>
	<li>测量肠道长度，并按需要分成若干段。本实验中，将小肠分为三段，并使用中间段。</li>
	<li>将所需肠段放入冰冻且已通气的林格氏液中；然后沿肠系膜附着侧纵向剪开每一段肠组织，去除脂肪和结缔组织。</li>
	<li>将肠段重新放回冰冻林格氏液中并充分清洗（即使在冰冻溶液中，腔面上皮的氧合对维持上皮功能仍至关重要）。</li>
</ol>
6. 剥离肌肉层及制备肠片
注意：在使用肠道进行转运研究时，去除浆膜（肌层）非常重要。如果保留浆膜，肠组织可能发生随机性肌肉收缩，从而干扰电生理数据，且可能抑制物质转运。当未剥离浆膜的组织被安装于尤辛室中时，会迅速退化，因为浆膜对底物和氧气具有显著的扩散屏障作用。在某些特殊情况下，可能需要保留肌层，因此是否去除浆膜应由研究人员根据实验设计自行决定。肠组织切片可根据去除的层次不同，采用两种方式进行制备图2）。本实验需要黏膜和黏膜下层组织标本（图2, 2nd 面板）
<ol>
	<li>准备直径为10 cm的解剖板，板上覆盖硅橡胶，并备好小针头（小型针灸针）、5 mm打孔的滤纸片以及石蜡膜方块（2 cm × 2 cm；其他系统可能无需此物）。</li>
	<li>将新鲜、冰浴预冷且通入气体饱和的任氏液倒入解剖板中（液量以覆盖组织为宜，约2–3 mL）。</li>
	<li>在体视显微镜下，用针将肠组织两端固定（黏膜面朝下）。</li>
	<li>使用精细镊子，钝性分离肌层与下方的黏膜层。</li>
	<li>操作时需小心，避免撕裂组织或造成穿孔。</li>
	<li>去除肌层后，裁剪出足够覆盖5 mm直径孔径的组织片。制备小肠组织时，应在10分钟内完成浆膜-肌层的去除，因为在当前条件下腔内供氧较为困难。</li>
	<li>将5 mm打孔的滤纸片用任氏液润湿，然后将肠组织置于其上（黏膜面朝下），因为黏膜下层制备物会自发卷曲，使黏膜面朝外。</li>
	<li>确保组织完全覆盖孔洞，且无皱褶。可在制备物下方放置黑色背景，以便观察孔洞是否被完全覆盖。</li>
	<li>根据所需数量重复上述步骤制备黏膜组织（本实验需制备两份：一份用于测量稀释电位，另一份用于测量基础电生理参数）。</li>
</ol>
7. 将肠道组织样本安装至尤斯灌流室中
注意：设置将取决于所使用的 Ussing 室系统和记录系统的类型。
<ol>
	<li>从Ussing室中吸出林格氏液/HEPES缓冲液。</li>
	<li>拆开Ussing室，将带有肠段组织的滤纸黏膜面向下放置在黏膜侧室上，并进行调整，使腔室的窗口与滤纸上的孔对齐（图1A，腔室窗口周围的黑色标记有助于组织样本的对齐）。</li>
	<li>小心地将浆膜侧室放置到黏膜侧室上并紧密闭合，确保在连接过程中肠组织未发生移位。</li>
	<li>迅速用林格氏液或HEPES缓冲液重新充满两个腔室，并将通气棒置于腔室远离组织膜的对侧（林格氏液：95% O2/5% CO2；HEPES缓冲液：100% O2），避免在组织附近过度通气，以免影响测量结果。</li>
	<li>重新连接盐桥，检查电压是否稳定，并施加脉冲电流以确认连接正常（图1C）。</li>
	<li>对每个肠段组织重复上述步骤。</li>
	<li>让系统平衡约15分钟。若使用记录系统，需待电导和短路电流（Isc）/膜电位差稳定后再开始实验。</li>
</ol>
8. 稀释潜力实验（开路条件）
<ol>
	<li>通过抽吸 HEPES 缓冲液清洗腔室的两侧，并向每侧加入 5 mL 新鲜预温的 HEPES 缓冲液。</li>
	<li>打开记录系统。将量程设为 250 mV（此处使用的系统放大输出电压 10 倍），设置标记位置，并将记录系统设为测量模式。</li>
	<li>将 Ussing 室系统切换至钳制模式并开始测量。待膜电位稳定后（约 15–20 分钟），即可开始评估。</li>
	<li>从黏膜侧抽吸 HEPES 缓冲液，并迅速替换为 5 mL 含 75 mM NaCl 的预温稀释 HEPES 缓冲液。</li>
	<li>待膜电位达到峰值后（5–10 分钟），从“黏膜”侧移除稀释缓冲液，并重新加入 HEPES 缓冲液。</li>
	<li>如有必要，对浆膜侧重复步骤 3，向浆膜侧加入稀释 HEPES 缓冲液。</li>
	<li>为确保组织具有活性，向浆膜侧加入腺苷酸环化酶激活剂佛司可林（终浓度 10 µM）。</li>
	<li>当跨膜电位差达到峰值并开始下降时，实验结束。</li>
</ol>
9. 跨上皮电导与基础值的测量 Isc （短路条件）
<ol>
	<li>通过抽吸林格液并分别向两侧加入 5 mL 新鲜通气的林格液，清洗室的两侧。</li>
	<li>打开记录系统。将量程设为 2.5 V（此处使用的系统放大输出电压 10 倍），设置标记位置，并将记录系统设为测量模式。</li>
	<li>将 Ussing 室系统切换至钳制模式并开始测量；待短路电流（Isc ）和电导稳定后（约 15–20 分钟），即可获取基线测量值。</li>
	<li>为确保组织具有活性，向浆膜侧加入腺苷酸环化酶激活剂佛司可林（终浓度 10 µM）。</li>
	<li>当跨膜电位差达到峰值并开始下降时，实验结束。</li>
</ol>
10. 分析结果
<ol>
	<li>在开路条件下，根据欧姆定律，通过电流脉冲引起的电压变化计算跨黏膜电导。确定等效短路电流（Isc根据欧姆定律，通过跨黏膜电压和电导计算。</li>
	<li>利用 NaCl 的稀释电位来计算相对离子选择性（PNa/PCl）与Goldman-Hodgkin-Katz方程10.</li>
	<li>使用 Kimizuka-Koketsu 方程估算紧密连接对每种离子的绝对选择性11.</li>
	<li>计算 PNa/PCl 使用稀释电位的Goldman-Hodgkin-Katz方程，并测定绝对通透性PNa 和 PCl 根据Yu等描述的Kimizuka-Koketsu方程10 如下所示： 
	<img alt="能斯特方程；电化学势公式；示意图；用于热力学研究。" src="/files/ftp_upload/62468/62468eq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	<img alt="用于膜电位计算的离子通透性比率公式，β=PCl/PNa。" src="/files/ftp_upload/62468/62468eq2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 
	<img alt="电化学中电压与温度关系的指数方程示意图" src="/files/ftp_upload/62468/62468eq3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3"> 
	<img alt="渗透性方程公式；符号：RT/F² GM/α(1+β)；生物化学计算" src="/files/ftp_upload/62468/62468eq4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4"> 
	其中，V：稀释电位（mV）；α：活度比，即HEPES缓冲液中NaCl的计算活度与稀释用HEPES缓冲液中NaCl的计算活度之比（本实验中计算为1.8966）；e：数学常数，2.71828；GM：跨黏膜电导（mS/cm）2）；F：法拉第常数（96,485.3329 C/mol）；R：气体常数（8.314 J/mol K）；T：温度（310.15 K）</li>
</ol>

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</ol>

作者无潜在利益冲突需披露。

在本实验中，使用尤斯室（Ussing chamber）测量了Cldn15-/-小鼠和野生型（WT）小鼠小肠的基线电生理参数以及NaCl稀释电位。进行尤斯室实验时，验证实验所用组织膜制备物是否具有活性至关重要。通常通过添加葡萄糖或腺苷酸环化酶激活剂佛司可林（forskolin），观察短路电流（Isc）是否出现适当升高（在小鼠中为100–300 µA/cm2）来判断组织活性。另一种评估肠道组织制备物是否适用于实验的方法是检测组织的电导率。受损组织的电导率通常高于正常值（小鼠正常电导率约为20–60 mS/cm2），而肌层未充分剥离的组织则往往表现出低于正常的电导率（图2）。所有尤斯室实验方案中最关键的步骤是组织制备，必须确保组织无任何损伤。此外，对于小肠组织，理想情况下应在解剖后10分钟内将膜制备物安装至尤斯室中，以避免组织降解。组织安装完成后，不应尝试重新调整，以免造成损伤。实验过程中，在从尤斯室中移除缓冲液、调节盐桥或搅拌棒时，必须避免以任何方式触碰肠道组...

Ussing室法最初由丹麦科学家Hans Ussing开发。Ussing首次利用该方法测量钠离子通过蛙皮肤的短路电流，此前已观察到NaCl能够逆浓度梯度跨皮肤转运1。他的系统将蛙皮肤固定在两个腔室之间，使皮肤两侧均可接触溶液。每个腔室中含有循环并通气的任氏液（Ringer's solution）。靠近皮肤处设有两根细小的琼脂任氏液桥，连接至饱和KCl-甘汞电极，用于通过电位计测量电位差。另外一对琼脂任氏液桥位于每个腔室的另一端，连接至含有被AgCl饱和的饱和KCl溶液的烧杯，以接入由电池提供的电动势。通过使用电位分压器调节电压，使跨皮肤的电位差保持为零，从而实现短路条件。同时连接微安表以读取通过皮肤的电流（原始腔室设计参见参考文献1中的图示）。
在过去的70年中，该技术已被应用于多种不同的组织，尤其是肠道组织，用于研究营养物质和离子的转运。例如，通过将兔回肠组织置于此类 chamber 中，研究了霍乱引起腹泻的机制，发现霍乱毒素诱导的腹泻是由cAMP2介导的。此外，这些chamber还被用于研究通过Na+-葡萄糖共转运蛋白1（SGLT1）进行葡萄糖转运的机制3。我们实验室专注于肠道上皮细胞的跨细胞和旁细胞转运。利用Ussing chamber方法，在旁细胞钠离子转运受损的Claudin 15基因敲除小鼠中，通过Ussing chamber测量不可水解二肽甘氨酰肌氨酸的吸收，评估了肽类物质的转运。研究发现，管腔内Na+稳态对质子偶联的肽类转运具有重要作用4。此外，这些chamber还被用于研究在丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶激活黏膜下蛋白酶激活受体1（PAR1）后，小鼠盲肠中的阴离子分泌机制5。
最近，尤斯室（Ussing chambers）也被用于评估上皮组织中的细胞旁通路。细胞旁通路由紧密连接（tight junctions）调控，紧密连接是在两个或多个细胞相接处形成的蛋白质复合物6。屏障功能和离子选择性（即阴离子或阳离子是否能够选择性地通过紧密连接）由claudin家族蛋白的存在决定；其中一些蛋白起屏障作用（如claudin 3和7），一些形成阴离子孔道（如claudin 10a），另一些则形成阳离子孔道（如claudin 2、10b和15）7。其他用于评估细胞旁通路的方法包括经口灌胃给予FITC并检测血浆中FITC浓度8，或使用EDTA-Cr9；然而，这些技术分辨率较低，无法评估离子选择性或肠道特定节段的通透性。相比之下，尤斯室可用于测定目标离子的稀释电位，从而确定紧密连接的离子选择性。例如，在NaCl体系中，可通过稀释膜的一侧（通常为黏膜侧）并测量跨上皮电位差的变化，来计算紧密连接对Na+和Cl-的选择性。Na+和Cl-的相对通透性可通过Goldman-Hodgkin-Katz方程10估算，而紧密连接的选择性则可利用Kimizuka-Koketsu方程11进行估算。因此，尤斯室具有能够测量组织电生理参数的优势，相较于其他低分辨率方法，可提供关于离子通过紧密连接过程的更丰富信息。
Ussing室法不仅限于肠道研究，尽管该方法在肠道相关研究中被广泛应用，但也具有许多其他应用。例如，这些 chamber已被用于研究囊性纤维化，特别是氯离子通道——囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）12。囊性纤维化由CFTR基因突变引起13，导致呼吸道上皮细胞的氯离子分泌和液体转运功能受损，从而形成更厚、更干燥的黏液层14。利用这些 chamber 对气道上皮细胞中的CFTR进行研究，不仅有助于理解该疾病的机制，还有助于发现治疗策略。例如，对于因罕见突变导致囊性纤维化的患者，已通过分析其呼吸道上皮细胞来评估Orkambi及一种扩增剂联合疗法等治疗方案的效果15。
Ussing室还被用于研究药物递送途径，例如利用人体活检组织研究药物吸收和药代动力学16。肠道吸收并非唯一的药物递送途径。这些室也已被用于研究鼻腔药物递送系统17。针对眼部的药物递送研究也已使用Ussing室开展。在兔角膜中，研究人员使用Labrasol进行了通透性和吸收研究，该药物旨在提高药物在组织间的吸收18。另一项研究探讨了氯化苄烷铵对兔巩膜经巩膜药物递送的影响19。
Ussing chamber 方法的优势在于可以使用天然组织，因此优于 Caco-2 细胞系等体外（in vitro）模型。然而，该技术在样本制备方面需要较高的操作技巧和时间，因此不适用于高通量应用。利用这些 chamber 中的细胞培养小室，可研究细胞单层的电生理特性。近年来的研究进展使得类器官（organoid）的培养成为可能，类器官是由上皮或内皮干细胞分离后在体外培养生成的微型器官20。通过调控培养条件，可使类器官以单层形式生长，从而使其能够被安装于 Ussing chamber 中进行研究21。各种上皮和内皮组织来源的类器官均可用于此类研究，这有助于减少实验动物的使用数量，因为类器官培养可长期维持。此外，由于无需耗时且繁琐的组织解剖与制备步骤，研究通量也将得以提高。未来，Ussing chamber 研究在组织转运机制研究中仍将持续发挥重要作用，并将在个体化医学领域中具有特别重要的意义。
以下方案演示了使用尤辛室法评估 Claudin 15 基因敲除（knockout）小鼠小肠紧密连接通透选择性及屏障功能的应用。Cldn15-/-)小鼠与野生型（WT）对照组，通过测量NaCl的稀释势能进行评估。紧密连接（TJ）形成于上皮和内皮组织中两个或多个细胞的交汇处。双细胞紧密连接（bTJ）尤其是其中的claudin家族蛋白，被认为决定了TJ的屏障功能和通透选择性。7. Cldn15-/- 小鼠具有巨大小肠22 由于肠道Na丢失导致营养吸收能力下降+ 通过claudin 15介导的再循环4,23,24. Cldn15-/-&#160;小鼠的Na功能受损+ 稳态，这使得它们成为研究紧密连接（TJ）选择性通透性的理想模型。以下方案通过测量 NaCl 的稀释电位（PNa/PCl) 在中段小肠。简而言之，通过稀释膜的一侧（M侧或S侧，以下方案中均进行测量）所引起的膜电位差变化，可用于计算Na的通透性+ (PNa）和 Cl- (PCl）以及稀释潜力（PNa/PCl将显示紧密连接对阳离子或阴离子的选择性。
本方案中的实验使用定制的尤斯室（图1A）进行，该装置由两个半室组成，肠段垂直固定于其间，并配备电压钳放大器、电记录仪、电极、盐桥、林格氏液、HEPES缓冲液（150 mM NaCl）、稀释HEPES缓冲液（75 mM NaCl）以及肠段标本（有关设备的详细信息，请参见材料表）。

<table><tbody><tr><td>#3 聚乙烯管</td><td>Hibiki</td><td></td><td>外径 1.0 mm；内径 0.5 mm</td></tr><tr><td>#7 聚乙烯管</td><td>Hibiki</td><td></td><td>外径 2.3 mm；内径 1.3 mm</td></tr><tr><td>10 mL 带锁注射器</td><td>Terumo</td><td>SS-10LZ</td><td>使用锁定式注射器可防止填充过程中针头脱落</td></tr><tr><td>19 号针头</td><td>Terumo</td><td>NN-1938R</td><td>操作针头时请小心谨慎，并将其丢弃至锐器容器中</td></tr><tr><td>23号针头</td><td>Terumo</td><td>NN-2332R</td><td>操作针头时请小心谨慎，并将其丢弃至锐器容器中</td></tr><tr><td>5 mm 打孔器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于在滤纸和封口膜上打孔</td></tr><tr><td>针灸针</td><td>Seirin</td><td>NS</td><td>用作解剖针，将组织固定在解剖板上</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fujifilm Wako</td><td>010-15815</td><td></td></tr><tr><td>鳄鱼夹</td><td>NA</td><td>NA</td><td>将电极连接至放大器</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fujifilm Wako</td><td>038-00445</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-甘露醇</td><td>Fujifilm Wako</td><td>133-00845</td><td>用于校正稀释用 HEPES 缓冲液中的渗透压差异</td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Fujifilm Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具包</td><td></td><td></td><td>您将需要：剪刀和弯头镊子</td></tr><tr><td>解剖板</td><td></td><td></td><td>我们使用了10 cm的细胞培养板，并用硅橡胶覆盖</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301-500ML</td><td>用于配制佛司可林储备液</td></tr><tr><td>电生理记录仪</td><td>TOA Electronics</td><td>PRR-5041</td><td>市面上可购得其他等效的电生理记录仪</td></tr><tr><td>上皮电压钳放大器</td><td>Nihon Kohden</td><td>CEZ9100</td><td>其他等效的放大器可商业获得</td></tr><tr><td>滤纸，切成方形</td><td>NA</td><td>NA</td><td>使用5 mm打孔器打孔，用于固定肠道标本</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>快速基因</td><td>FG-B50476</td><td>用于肌肉层的钝性分离</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Alomone Labs</td><td>F-500</td><td>用DMSO配制10 mM储备液，终浓度为10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma</td><td>I7338-5G</td><td>在21 mM NaHCO₃中配制1 mM储存液，终浓度为10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fujifilm Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>KCl/甘汞电极</td><td>Asch Japan Co.</td><td>SCE-100</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>关东化学</td><td>32379-00</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-谷氨酰胺</td><td>Fujifilm Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fujifilm Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>混合气体（95% O₂，5% CO₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>静冈氧气公司</td><td></td><td>用于使用林格溶液时对林格溶液和腔室进行通气</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fujifilm Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NaCl电极</td><td>NA</td><td>NA</td><td>需要浓 NaCl 溶液和银丝的手工电极</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fujifilm Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体</td><td>静冈氧气公司</td><td></td><td>用于使用 HEPES 缓冲液时的鼓泡室</td></tr><tr><td>帕拉菲膜</td><td>贝米斯</td><td>PM-996</td><td>用于帮助密封尤西 chamber</td></tr><tr><td>pH计</td><td>DKK-TOA Corp</td><td>HM-305</td><td>HEPES 缓冲液需在 37 ℃ 下调节至 pH 7.4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>pH计电极</td><td>DKK-TOA Corp</td><td>GST-5311C</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶</td><td>Shinetsu Chemical</td><td>KE-12</td><td>用于填充解剖板</td></tr><tr><td>银丝</td><td></td><td></td><td>用于制备 NaCl 电极</td></tr><tr><td>带塑料盖的小罐子</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于 NaCl 电极</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td>体视显微镜可提供立体视觉，使您能够更轻松地解剖组织</td></tr><tr><td>Tris（Trizma 试剂）</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>配制1M溶液以调节HEPES缓冲液的pH值</td></tr><tr><td>尤斯灌流室</td><td>先进化学工业</td><td></td><td>这些灌流室为定制的连续灌流式尤辛室，窗口直径为5 mm</td></tr><tr><td>水泵和加热系统</td><td>东京理化工业株式会社</td><td>NTT-110</td><td></td></tr></tbody></table>

利用ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

Ussing chamber 技术最初由丹麦科学家 Hans Ussing 于 1951 年发明，用于研究钠离子通过蛙皮肤的跨细胞转运。此后，该技术已被应用于多种不同组织，以研究跨膜转运的生理参数。与其他方法相比，Ussing chamber 方法更具优势，因其可使用天然组织，因而更接近体内（in vivo）的实际状况。然而，由于使用的是天然组织，通量较低，实验时间有限，且组织制备需要熟练的技术和培训。该技术已被用于研究各种组织中的特定转运蛋白，阐明囊性纤维化等疾病的病理生理机制，研究药物的转运与吸收，尤其促进了对肠道营养物质转运的理解。鉴于组织的整体上皮转运过程，不仅跨上皮途径重要，旁细胞途径也同样重要。紧密连接是决定肠道组织特异性旁细胞通透性的关键因素。本文将采用 Ussing chamber 技术，通过测量跨上皮电导和稀释电位，评估离子的旁细胞选择性通透性。

本文所示结果属于一个已完成的较大项目的一部分（参见参考文献4,23,24）。
在Cldn15-/-小鼠中，小肠跨上皮电导率降低。 
在短路条件下，Cldn15-/-小鼠中段小肠的初始跨黏膜电导率低于野生型小鼠（图3A；Cldn15-/-小鼠和野生型小鼠分别为22.3 mS/cm2和48.7 mS/cm2）。同时测定了Cldn15-/-小鼠的初始短路电流（Isc...

肠上皮不仅具有营养吸收功能，还能防止有害物质侵入。位于上皮细胞间连接最顶端的紧密连接可调节溶质和离子的细胞旁通透性。本文介绍了一种制备黏膜片并利用尤斯 chamber 技术评估紧密连接离子选择性的实验方案。

利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

Ussing室技术最初由丹麦科学家Hans Ussing于1951年发明，用于研究钠离子通过蛙...的跨细胞转运

本方案用于研究紧密连接的转运特性。通过稀释电位法，可测量其选择透过性，从而了解组织中紧密连接的功能特性。该技术具有特异性，利用天然组织对上皮细胞进行功能性研究。此外，该技术可测量组织的实时生理特性，具有重要价值。最大的挑战在于组织制备。通过练习该技术并观看本视频将有助于掌握。确认组织活性也是重要的步骤。首先，将从claudin-15基因敲除小鼠获取的目标肠段组织放入冰冻的通氧Ringer溶液中，去除脂肪和结缔组织。去除脂肪和结缔组织后，沿肠系膜附着处纵向剪开每个肠段，然后将肠段重新放回冰冻Ringer溶液中，并充分清洗组织片段。为了剥离肌层，将两到三毫升新鲜的冰冻充氧林格液倒入置于解剖显微镜下的硅胶包被解剖盘中，用解剖针固定一段肠组织的两端，使黏膜面朝下。使用精细镊子，钝性分离肌层与下方的黏膜组织，注意避免撕裂或在组织上造成任何孔洞。一旦肌层被去除，裁剪出足够覆盖直径五毫米孔径的组织片，将组织黏膜面朝下放置于经林格液润湿的直径五毫米打孔滤纸上，并使用黑色背景确保滤纸上的孔完全被组织覆盖且无皱褶。将肠段制备物安装到尤辛室中时，首先在拆卸尤辛室前移除其中的任何溶液。将带有肠段制备物的滤纸黏膜面朝下放置在尤辛室的黏膜侧，利用黑色标记对齐尤辛室窗口与滤纸上的孔。小心地将浆膜侧室与黏膜侧室连接，注意不要移动肠组织片。用HEPES缓冲液迅速重新充满两个腔室，并将通气的缓冲液置于每个腔室远离膜的另一端。重新连接盐桥，检查电压是否稳定，然后施加脉冲电流以确认连接正常，随后让系统平衡约15分钟。进行稀释电位实验时，首先用每侧5毫升新鲜预热的HEPES缓冲液冲洗腔室的两侧。打开记录系统并将量程设置为 250 毫伏。设定标记位置，将记录系统设为测量模式，并将 Ussing 室系统设为钳制模式。待测量电位稳定后，即可使用数据进行测量。迅速将腔面上的 HEPES 缓冲液更换为 5 毫升含 75 毫摩尔氯化钠的预温稀释 HEPES 缓冲液。当膜电位达到峰值后，将腔面上的稀释缓冲液更换为新鲜的 HEPES 缓冲液。为确保组织具有活性，向浆膜侧加入 10 微摩尔佛司可林。当膜电位差达到峰值并开始下降时，实验即告结束。测量跨上皮电导和基础短路电流时，在按演示方法清洗灌流室两侧后，向每侧加入五毫升新鲜预通氧的林格液，并将记录系统的量程设为2.5伏。设定标记位置，将记录系统设为测量状态，并将尤辛室系统设为钳制模式。当短路电流和电导稳定后，使用这些数据作为基线测量值。为确保组织具有活性，按所示方法向浆膜侧添加佛司可林（Forskolin）。一旦膜电位差达到峰值并开始下降，实验即告结束。在此代表性分析中，在短路条件下，与野生型小鼠相比，claudin-15 基因敲除小鼠中段小肠节段的基础跨黏膜电导率较低，而基础短路电流较高。当管腔内氯化钠被稀释时，野生型小鼠相对于浆膜侧出现正电位差，但在 claudin-15 基因敲除小鼠中该电位差减小。类似地，基因敲除动物中氯化钠的相对通透性也降低。绝对通透性的计算结果显示，在claudin-15基因敲除小鼠中，钠离子的绝对通透性降低，而氯离子的绝对通透性未发生改变，这表明相对通透性的下降是由于钠离子通透性降低所致。正如预期，将Forskolin添加至室腔的浆膜侧后，基因敲除小鼠与野生型小鼠在短路电流变化上未表现出显著差异。由于肠段对Forskolin表现出足够大的反应，因此认为膜制备物具有活性。进行适当的肌层去除并确保组织具有活性非常重要。无论制备是否可行，都请冲洗小鼠的解剖部位。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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有机电化学晶体管与活细胞集成，用于监测胃肠道上皮屏障的离子流。本研究中，通过添加钙螯合剂EGTA（乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸）破坏紧密连接，从而引起离子流增加，并对此进行了测量。...

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我们介绍了一些简单的方法，用于研究肠内5-羟色胺转运体（SERT）功能及其表达的调控，使用一种 体外 Caco-2细胞的三维细胞培养模型 和一个 离体...

研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法

本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.

体外 与 体内 评估肠上皮细胞通透性的方法

本文介绍一种用于量化小肠类器官屏障完整性的技术。该方法基于活体类器官，能够以时间分辨的方式连续检测不同屏障完整性调节物质或其组合的影响。...

研究活体类器官中肠道屏障的破坏

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

肠道上皮屏障功能和免疫反应失调是炎症性肠病的特征，但由于缺乏生理相关模型，这些特征迄今研究尚不充分。本文介绍一种小鼠肠道环模型，该模型利用血供良好且外置于体外的肠段，在活体条件下研究黏膜通透性和白细胞募集。...

利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

在本研究中，向小鼠给予荧光素异硫氰酸酯标记的（FITC）葡聚糖 通过 口服灌胃以评估肠道通透性 体内...

利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

本研究介绍了一种从类器官生成牛肠道二维单层细胞的实验方案，为研究宿主与病原体相互作用提供了更便捷的途径。方案包括评估膜完整性和功能性的方法，推动了 体外...

利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

我们将演示如何研究单个点突变对离子通道功能的影响。...

在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

学习使用Ussing Chamber技术评估肠道紧密连接屏障功能，通过测量跨上皮电导和稀释电位来分析claudin-15敲除小鼠的离子渗透性。该方法为研究生理条件下上皮转运机制提供了可靠手段。

利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

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