去白细胞滤器来源的CD34+细胞作为研究巨核细胞分化与血小板形成的细胞来源

本方案提出了一种获取人类造血祖细胞并诱导其分化为巨核细胞的简单方法。该方法可作为深入理解巨核细胞生成过程的基础。该技术使用一种来源，但具有价格低廉且材料丰富的优势，适用于造血研究领域的实验室研究。此方法可用于进一步研究巨核细胞生成过程，但若要将细胞用于治疗，则需在GMP条件下进行制备，而目前尚未达到这一标准。

只有通过视觉演示，才能完全理解包括PBMC采集在内的各个步骤。在开始实验之前，将一个白细胞去除滤器连接到一个空的600毫升转移袋和一段管路上。在生物安全柜中，向每个白细胞去除滤器中加入25毫升过滤后的洗脱缓冲液至空袋中，并使用30毫升注射器通过滤器轻轻抽吸袋内液体。

将收集的红细胞转移至一个新的50毫升离心管中，用2%右旋糖酐将细胞悬液稀释一半。充分混匀以促进血细胞聚集，并在室温下静置沉降30分钟。当红细胞完全沉淀后，将上清液转移至另一个50毫升离心管中，并用2毫摩尔的PBS EDTA溶液定容至满管。

用移液管将上清液的一半轻轻覆盖在两个50毫升离心管中各25毫升的密度梯度介质上，注意不要扰动梯度液表面，通过密度梯度离心法分离细胞。使用一次性移液管将每个界面处的细胞转移至新的50毫升离心管中。用50毫升含2毫摩尔EDTA的PBS缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤使用50毫升缓冲液。

第二次洗涤后，将沉淀重悬于50毫升新鲜PBS EDTA中进行计数。此时可通过将收集的细胞在4摄氏度下持续振荡过夜，暂停实验流程。对于CD34+细胞的分选，需确定细胞数量，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于每10^8个细胞加入300微升含2毫摩尔EDTA的PBS溶液中。

每10的8次方个细胞加入适量体积的FC受体阻断试剂和50微升CD34微珠。在4摄氏度孵育30分钟后，用含2毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于每10的8次方个细胞加入500微升新鲜的含2毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液中。用PBS EDTA润湿并适当大小的磁性柱，然后将样品加入柱中。

用三毫升的2毫摩尔PBS EDTA溶液洗涤柱子两次，每次洗涤使用三毫升。在洗脱CD34+细胞前，每次用两个五毫升的2毫摩尔PBS EDTA溶液进行洗脱。为评估磁珠分选细胞的纯度，取100微升分离的细胞，加入两微升适当的人源抗CD34抗体，充分混匀后，在4摄氏度孵育15分钟。

孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于 200 µL PBS 中，通过流式细胞术分析细胞样本的纯度。计数后，通过离心收集 CD34+ 细胞，并立即用预冷的溶液一将沉淀重悬至浓度为 10⁶ 个细胞/毫升，随后迅速将细胞悬液加入预冷的溶液二中。然后立即将冻存管置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 24 小时，之后转移至液氮中长期保存。

在此代表性研究中，通过白细胞减少过滤法回收细胞，其存活率约为 95%。经磁珠分选后，获得纯度超过 90% 的 CD34+ 细胞群体。细胞增殖通常在培养一周后下降，但细胞存活率无显著变化。

到第7天，CD34+细胞应开始表达CD41，这是巨核细胞和血小板发育的特异性早期标志物。到第10天，培养物中的大多数细胞通常会发育为成熟的表达CD41的巨核细胞。到第13天，可通过光学显微镜观察到巨核细胞的前血小板延伸及血小板释放。

随后可使用已校准的荧光微球数量来定量培养物中释放的 CD41、CD42、8 阳性血小板总数。该方法为深入阐明巨核细胞生成的潜在机制以及提高血小板产量提供了途径。尽管该方法看似繁琐，但实际上非常简单，您只需保持耐心并提前准备好所有试剂即可。

尽管我们的研究重点是巨核细胞生成，但所获得的CD42阳性细胞也可用于其他造血通路的研究。