白细胞消除过滤器衍生的CD34 +细胞作为研究巨核细胞分化和血小板形成的细胞来源

该协议提出了一种获得人类造血祖细胞并诱导其分化为巨核细胞的简单方法。它可以作为更好地了解巨核细胞生成的基础 该技术使用来源，但为造血的实验室研究提供了负担得起和丰富的优势。这种方法用于更好地了解巨核生成，用于治疗的细胞需要在GMP条件下制备，目前情况并非如此。

了解包括PBMC收集在内的步骤只能通过视觉演示才能完全完成。在开始实验之前，将白质还原过滤器连接到空的600毫升转运袋和管路组。在生物安全柜中，将每个白质还原过滤器将25毫升过滤的洗脱缓冲液注入空袋中，并使用30毫升注射器轻轻地通过过滤器吸入袋内物品。

将收集的红细胞转移到新的50毫升管中，并用2%葡聚糖将细胞悬浮液稀释一半。充分混合以聚集血细胞，并使细胞在室温下沉淀30分钟。当红细胞沉降时，将上清液转移到50毫升的管中，并用两毫摩尔PBS EDTA溶液填充管中。

将一半的上清液轻轻覆盖到两个50毫升管中每个25毫升的密度梯度培养基上，而不会干扰梯度表面，并通过密度梯度离心分离细胞。使用一次性移液器将细胞从每个界面转移到新的50毫升管中。每次洗涤2毫升的50毫升PBS EDTA洗涤细胞两次。

第二次洗涤后，将颗粒重悬于单个50毫升体积的新鲜PBS EDTA中以进行计数。在这里，可以通过在夜间将收集的细胞保持在四摄氏度的搅拌下来停止该过程。对于CD34 +细胞选择，确定细胞数量并通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于每10个细胞2毫摩尔PBS EDTA的300微升至第八个细胞中。

向第八个细胞加入适当体积的FC受体阻断试剂和每10个细胞50微升CD34微珠。在4摄氏度下30分钟后，用两毫摩尔PBS EDTA洗涤细胞，并将沉淀重悬于500微升新鲜2毫摩尔PBS EDTA中，每10个细胞至8个细胞。用PBS EDTA加湿并适当尺寸的磁柱，然后将样品添加到色谱柱中。

每次洗涤用三毫升两毫摩尔PBS EDTA洗涤色谱柱两次。在逃避CD34 +细胞之前，每次洗脱用两个五毫升体积的两毫摩尔PBS EDTA。为了评估磁珠所选细胞的纯度，将两微升适当的人抗CD34抗体加入100微升等分试样中分离的细胞中，并在4摄氏度下孵育15分钟之前充分混合。

孵育后，在PBS中洗涤细胞并将沉淀重悬于200微升PBS中，以通过流式细胞术分析细胞样品的纯度。计数后，通过离心收集CD34 +细胞，并立即将沉淀重悬于冷溶液一至密度为10至每毫升6个细胞，然后快速将细胞悬浮液加入冷溶液二中。然后立即将冷冻管置于零下80摄氏度的冰箱中24小时，然后将冷冻管转移到液氮储存中。

在这项具有代表性的研究中，细胞通过白质还原过滤回收，其存活率约为95%。经磁珠选择后，获得纯度大于90%的CD34+细胞群。细胞增殖通常在培养一周后减少，但细胞活力没有显着变化。

到第七天，CD34 +细胞应该开始表达CD41，CD41是一种特异性的早期标志物，或用于巨核细胞和血小板发育。到第10天，培养物中的大多数细胞通常发育成表达巨核细胞的成熟CD41。到第13天，巨核细胞pro血小板的延伸和血小板的释放可以通过光学显微镜观察。

然后可以使用校准数量的荧光珠来定量释放到培养物中的CD41，CD42，8阳性血小板的总数。该方法为增强巨核生成的潜在机制和提高视觉中的血小板产量铺平了道路。即使这种方法看起来很乏味，也很简单，你只需要耐心等待并提前准备所有区域。

虽然我们严重关注巨核生成，但我们获得的CD42细胞可用于造血途径。