Name: 小鼠新鲜骨髓外植体的丙酸盐形成动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 了解小鼠新鲜骨髓外植体中巨核细胞形成前血小板的动力学过程。该方法可在六小时内实时观察并定量分析前血小板延伸，为研究血栓性疾病提供关键数据。

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作者感谢 Jean-Yves Rinckel、Julie Boscher、Patricia Laeuffer、Monique Freund、Ketty Knez-Hippert 提供的技术支持。本研究得到了法国国家研究署（ANR）项目基金 ANR-17-CE14-0001-01 和 ANR-18-CE14-0037 的资助。

所有动物实验均按照欧洲标准 2010/63/EU 以及斯特拉斯堡大学动物实验伦理区域委员会（Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg，CREMEAS）的规定进行。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>按照表1所述配制试剂。
	<ol>
		<li>配制储备液I时，分别溶解每种粉末。确保配制液的渗透压高于295 mOsm/L。该溶液可在4 °C保存一年。</li>
		<li>配制台氏缓冲液时，按表1所述配制溶液，用蒸馏水定容至100 mL，并加入0.1 g无水D(+)蔗糖。根据需要使用1 N HCl调节pH至7.3，并将渗透压调节至295 mOsm/L。为防止细菌生长，加入青霉素G至终浓度10 U/mL，以及硫酸链霉素至终浓度0.29 mg/mL。将最终溶液经0.22 µm滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验装置的准备
<ol>
	<li>实验当天，将台氏液缓冲液在 37 °C 下预热，并打开显微镜加热腔，使温度升至 37 °C。</li>
	<li>准备好所有必要的工具，例如计时器、孵育腔、5 mL 注射器、21 G 针头、镊子、剃刀刀片、巴斯德吸管、载玻片和 15 mL 离心管（图 1A）。</li>
</ol>
3. 小鼠骨髓的分离
<ol>
	<li>采用 CO2 窒息法及颈椎脱位法对 8–12 周龄的 C57BL/6 小鼠实施安乐死。该操作应由具备资质且熟练的人员迅速完成。</li>
	<li>为避免微生物污染，取出股骨前先将小鼠尸体浸入 70% (v/v) 乙醇中。解剖时使用经 70% 乙醇消毒的器械。收集双侧股骨，并清除附着的组织。快速浸入乙醇后，将其置于含有 2 mL Tyrode's 缓冲液的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>使用锋利的剃须刀片切除骨骺，并用装有 2 mL Tyrode's 缓冲液的 5 mL 注射器冲洗骨髓。操作时将 21 G 针头插入股骨远端（膝关节侧）开口处，缓慢推动活塞，以获取完整的骨髓柱状组织（图 1B，C）。骨髓收集过程应尽可能短暂（不超过 10 分钟）。</li>
</ol>
4. 骨髓切片及放入孵育腔室
<ol>
	<li>使用 3 mL 塑料移液管小心轻柔地将完整的骨髓转移至载玻片上。重要的是，样本必须被缓冲液覆盖，以防止干燥（图 1D）。 
	注意：避免反复流动，以尽量减少可能导致组织解离的剪切力。</li>
	<li>在体视显微镜（10×）下，切除因冲洗时受压而可能受损的骨髓末端。然后使用锋利的剃须刀片切割横截面。切片应足够薄以便详细观察，但需确保巨核细胞不会因受压而受损（通常厚度约为 0.5 mm）（图 1E、F）。 
	注意：切片需在放大镜下使用锋利的剃须刀片进行，以调整其厚度至约 0.5 mm。仅选择厚度均匀的切片。该操作并不复杂，但其标准化需要一定经验。</li>
	<li>使用塑料移液管将 10 个切片收集至含有 Tyrode 缓冲液的 1 mL 离心管中（图 1G）。</li>
	<li>小心地将切片转移至直径为 13 mm 的孵育腔室中（图 1H）。</li>
	<li>吸除缓冲液，并调整体积至 30 µL 含 5% 小鼠血清的 Tyrode 缓冲液。 
	注意：此步骤可加入药理学试剂，以评估其对血小板前体形成的影响。</li>
	<li>将切片适当间隔放置。用尺寸为 22 × 55 mm 的盖玻片密封自粘式腔室。粘贴时倾斜盖玻片，以避免产生气泡（图 1I）。</li>
	<li>将腔室置于 37 °C 的加热腔中。从此时起启动计时器（T = 0 h）。实验在 37 °C 下持续进行 6 小时（T = 6 h）。</li>
</ol>
5. 骨髓外植体的实时观察
<ol>
	<li>使用倒置相差显微镜（放大倍数为40倍物镜）并连接视频摄像机，观察骨髓外植体。在开始观察前，让细胞孵育30分钟。观察过程中需不断调节焦距，因为巨核细胞处于运动状态。 
	注意：也可采用其他观察模式（例如微分干涉差（DIC）显微镜，或利用内源性荧光标记巨核细胞的小鼠进行荧光显微镜观察），但相差显微镜最有利于清晰显示巨核细胞细长的突起结构，从而实现精确量化。孵育30分钟后，骨髓细胞逐渐迁移至外植体边缘，形成单层细胞。孵育1小时后，可通过细胞体积较大及细胞核多叶状等特征识别巨核细胞（图1J，K）。孵育3小时后，巨核细胞数量增加，部分细胞出现细长突起。</li>
	<li>录制视频以记录巨核细胞的形态转变过程。</li>
</ol>
6. 血小板前体延伸的巨核细胞的定量分析
<ol>
	<li>绘制示意图以定位孵育室中的每个切片区域（图 1K）。</li>
	<li>孵育 1 小时后，识别各切片边缘可见的巨核细胞（即巨大的多叶核细胞），并在示意图上标出其位置。在 3 小时和 6 小时后重复此操作。 
	注意：根据示意图，可随时间轻松定位每个巨核细胞，并分析其形态学变化（如大小、形变、前血小板突起等）。另一种方法是使用特定的导航软件。</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+platelet+genesis%3B+in+vitro+study+by+cinemicrophotography%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li>
<li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation%3A+A+scanning+electron+microscopic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li>
<li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+Histologicum+Japonicum%22%5BJournal%5D)">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
<li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3G%2C+through+its+GEF+activity%2C+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li>
<li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+receptors%2C+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

这里我们介绍一种简单且低成本的方法 体外 评估在骨髓中生长的巨核细胞延伸前血小板效率的方法。小鼠骨髓外植体模型具有四个主要优势。第一，该方法无需高级技术操作技能。第二，获得延伸前血小板的巨核细胞所需时间较短，外植体方法仅需6小时，而从小鼠前体细胞开始的传统培养方法至少需要4天。第三，由于所需组织量较少且实验结果具有可重复性，该方法将所需实验小鼠数量降至最低（通常每实验条件仅需6只小鼠），从而使实验在经济和伦理上均具高效性。最后但同样重要的是，该方法的优势在于使用了在其天然环境中完全发育成熟的巨核细胞，这可能在揭示那些在其他条件下可能被掩盖的表型方面具有重要价值 体外 由培养条件可能带来的假象所致。这一点此前已在巨核细胞受限的小鼠中有所记载 MYH9 失活过程中，关于血小板前体形成的研究发现了相互矛盾的结果 体外 （形成增加）10 和 体内 （形成减少）分化的巨核细胞11这些看似矛盾的结果可通过肌球蛋白IIA在受限环境中对正常巨核细胞分化具有必要性来解释，...

骨髓外植技术最初由 Thiéry 和 Bessis 于 1956 年建立，用于描述大鼠巨核细胞胞质突起的形成，这是血小板生成的初始事件1利用相差显微镜和电影摄影技术，这些作者表征了成熟圆形巨核细胞向 &#34;类似鱿鱼的&#34; 具有细胞质突起的血小板生成细胞，其突起表现出伸长和收缩的动态运动。这些突起逐渐变细，最终呈丝状，沿突起及其末端可见少量肿胀。这些典型的巨核细胞突起，经获得 体外 在液体培养基中，这些细胞与固定骨髓中观察到的血小板具有一定的相似性，其中巨核细胞通过窦状壁向血循环中延伸出长长的突起2,31994年促血小板生成素（TPO）的发现与克隆，使得在培养中能够分化出可形成前血小板突起的巨核细胞，这些突起与骨髓外植体中所描述的结构相似。4,5,6然而，在培养条件下，巨核细胞的成熟效率要低得多，尤其是与骨髓中成熟的巨核细胞相比，培养的巨核细胞其复杂的内部膜网络发育不全，从而阻碍了对血小板生成机制的研究7,8.
我们在此详细介绍了基于Thiéry和Bessis方法的骨髓外植体模型，用于实时观察在天然微环境中完全成熟的鼠源巨核细胞的血小板前体形成过程，从而避免了可能的 体外 伪影与误读。结果以野生型成年小鼠为例，展示了巨核细胞延伸前血小板的能力、前血小板的形态及其结构复杂性。我们还引入了一种快速定量策略，用于质量验证，以确保巨核细胞记录过程中的数据准确性和稳健性。本方案为该方法的最新版本&#160;此前已作为书籍章节出版9.

<table><tbody><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>21 号针头</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwall 培养室</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70324-02</td><td>深度：0.2 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td>pH 调至 7.5</td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>VIALEBEX</td><td>授权药品编号：n&amp;deg; 3400956446995</td><td>20% (200 mg/mL - 100 mL)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>BVBW8448</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72200-40</td><td>22 mm × 55 mm</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td><td>DMI8 - 514341</td><td>空气镜</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Germany</td><td>K5 CMS GmbH -14401137</td><td>图像分辨率：420 万像素</td></tr><tr><td>小鼠血清</td><td>BioWest</td><td>S2160-010</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100×</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10,000 单位/mL 青霉素，10,000 &amp;mu;g/mL 链霉素和 29.2 mg/mL 谷氨酰胺</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖 D (+)</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠新鲜骨髓外植体中血小板形成过程的动力学

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

巨核细胞生成的最后阶段会导致成熟巨核细胞形成细胞质突起，即所谓的前血小板（proplatelets）。通过体外（in vitro）分化的巨核细胞，人们对前血小板的形成已有较多了解；然而，越来越多的证据表明，传统的培养系统并不能真实再现发生在骨髓内部的分化/成熟过程。在本论文中，我们介绍了一种最初由 Thiéry 和 Bessis 于1956年描述的组织块培养法，用于观察在天然微环境中成熟的巨核细胞，从而避免潜在的人为假象和误读。新鲜骨髓通过冲洗小鼠股骨获得，切成0.5 mm的横截面，置于含生理缓冲液的培养腔中，在37 °C下孵育。巨核细胞逐渐在组织块边缘可见，并可在倒置显微镜耦合摄像系统下连续观察长达6小时。随着时间推移，巨核细胞形态发生改变，部分细胞呈球形，另一些则形成粗大的突起，或延伸出大量具有广泛分支的细长前血小板。可同时进行定性和定量分析。该方法的优点在于操作简单、可重复性强且快速高效，因组织块中含有大量巨核细胞，通常在6小时内约有一半细胞形成前血小板，而体外培养的小鼠巨核细胞则需4天。除了用于突变小鼠的研究外，该方法另一个有价值的应用是可直接评估药理学试剂对前血小板延伸过程的影响，而不会干扰可能在培养过程中发生的分化过程。

定性结果。 实验开始时，所有细胞均聚集在骨髓区域。30分钟后，细胞在组织块边缘变得清晰可见。巨核细胞因其体积较大而可被识别，随后可随时间观察其动态变化（如大小、形态、运动性、前血小板突起的延伸及血小板释放）（图2A）。小型巨核细胞直径在20至30 µm之间，细胞核呈多叶状；而成熟的圆形巨核细胞体积更大（直径&gt; 30 µm），胞质扩张。偶尔可见少量深色巨核细胞（图2C），代表死亡细胞，其比例不应超过0.5%。若该比例高于此值，则提示样本制备存在问题。通过调节焦距可清晰观察细胞核的形态。
定量结果。巨核细胞的计数按6.2节所述进行人工计数，并在培养室封闭后3小时和6小时根据其形态进行分类。图2A总结了四种主要的巨核细胞类别：（1）小型巨核细胞，（2）大型巨核细胞，（3）具有粗大突起的巨核细胞，（4）具有细长且分支状突起的巨核细胞。后者为...

本文详细介绍了骨髓外植体方法，从样本制备到显微镜玻片分析，用于评估在生理环境中已分化的巨核细胞形成前血小板的能力。

巨核细胞生成的最后阶段会导致成熟巨核细胞伸出胞质突起，即所谓的前血小板。关于这一过程，已有大量研究揭示了……

本实验的总体目标是实时观察在天然环境中成熟的鼠源巨核细胞形成前血小板的过程。该方法具有操作简便、可重复性强和速度快的优点。通过该方法，仅需六小时即可分析大量巨核细胞并观察前血小板的形成过程，而无需像体外培养的鼠源巨核细胞那样等待至少一天。该方法的一个有趣应用是能够研究药物治疗或基因突变对血小板前体延伸阶段的特异性影响。在此过程中，不会像体外培养那样干扰细胞分化过程。本视频有助于确保骨髓冲洗和切割等关键步骤的准确性。还详细介绍了如何对形态学和巨核细胞进行分类，这对于血栓性疾病缺陷的表征非常有用。首先，将Tyrode缓冲液在37摄氏度下预热，并打开显微镜加热腔，使温度升至37摄氏度。准备好所有必要的工具，例如计时器、孵育腔、5毫升21号针头注射器、镊子、剃刀刀片、巴斯德吸管、载玻片以及15毫升离心管。用21号针头插入股骨膝侧的开口，以两毫升Tyrode缓冲液冲洗骨髓，并缓慢推动活塞以获取完整的骨髓柱。使用3 mL塑料移液管小心轻柔地将完整的骨髓转移至载玻片上。切除在冲洗过程中可能受挤压的骨髓两端。然后使用锋利的剃须刀片切割厚度为0.5毫米的薄横切片，以避免损伤巨核细胞。用塑料移液管将10片切片收集到含有Tyrode缓冲液的1毫升离心管中。小心地将切片转移至直径为13毫米的孵育室中。吸去缓冲液，并将体积调整为30 µL含5%小鼠血清的Tyrode缓冲液。将切片置于一定距离。用22 mm × 55 mm的盖玻片密封自粘式腔室，倾斜盖玻片以避免产生气泡。将培养皿置于37摄氏度的恒温培养箱中。启动计时器，在37摄氏度下持续进行实验六小时，拍摄视频以记录巨核细胞的转变过程。30分钟后，骨髓细胞逐渐迁移至外植体周边，形成单层结构。孵育1小时后，可通过其较大的体积和多叶核形态来鉴定巨核细胞。孵育3小时后，巨核细胞数量增加，部分细胞具有较长的突起。绘制示意图以定位孵育腔室中每个区域的位置。一小时后，识别每个切片边缘可见的巨核细胞（体积巨大且具有多叶核的细胞），并在绘图上标出其位置。在三小时和六小时后重复此操作。在孵育腔室封闭后三小时和六小时，根据巨核细胞的形态特征对其进行人工计数并分类。它们被分为小型、大型伴厚实凝块以及延伸出前血小板三种类型。借助成像分析，可随时间推移追踪其演化过程。结果以每次观察时间点各类型所占百分比表示。传统上，在六小时时间点，野生型小鼠骨髓中可见的巨核细胞有一半在边缘区延伸出前血小板突起。通过随时间连续拍摄图像来追踪圆形巨核细胞的命运，以观察其如何形成前血小板突起。进行此操作时需注意的重要事项是，在整个实验过程中需将外植体保持在37摄氏度。不同的温度可能会改变实验结果。有趣的是，外植体实验方案可在完成内向显微镜实验后使用。最终，骨髓外植体中的巨核细胞将自然发出荧光，其行为可被轻松研究。这使得能够在同一动物上结合不同的处理方法，从而减少小鼠的使用数量。总之，外植体方法快速、简便，可提供大量关于天然巨核细胞产生血小板能力的信息。所获得的定性和定量结果对于我们理解血栓性疾病至关重要。在生理或病理背景下。

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科研

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Biology

生物学

小鼠新鲜骨髓外植体的丙酸盐形成动力学

本视频展示了一种巨核细胞分化及血小板形成的实验技术。从人脐带血中分离的造血干祖细胞在血小板生成素存在条件下，可分化为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞产生称为前血小板的胞质突起，进而形成单个血小板。...

一种体外分化巨核细胞及形成血小板的方法

在本视频中，我们演示了骨髓来源巨噬细胞在细菌脂多糖和静脉注射免疫球蛋白刺激下的活化过程。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞对抗体刺激的活化

本文报道了一种荧光活体显微技术，用于在活体小鼠的血管炎症和血栓形成过程中，可视化活化内皮上血小板与中性粒细胞之间的异型相互作用。该显微技术将有助于研究血管疾病的分子机制，并可在病理生理条件下评估药理学试剂的作用。...

活体小鼠血管炎症和血栓形成过程中活化内皮上血小板-中性粒细胞异型相互作用的实时成像

可从脐带血来源的CD34+细胞中获得高纯度的巨核细胞群体。本文介绍了一种CD34+细胞分离及巨核细胞分化的实验方法。...

从人脐血来源的CD34+细胞诱导巨核细胞分化及血小板生成

本文描述了一种分离和培养破骨细胞的实验方案 体外...

基于RANKL的小鼠骨髓破骨细胞培养实验，用于研究mTORC1在破骨细胞形成中的作用

血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。...

基于层流的检测方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集作用

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本文描述了利用双光子显微镜对活体小鼠颅骨骨髓中的巨核细胞及其血小板前体（proplatelets）进行成像的方法。...

体内 小鼠颅骨骨髓中巨核细胞与前血小板的双光子成像

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

在此，我们介绍一种易于实施、标准化的微生理系统，该系统能够反映人类骨髓的复杂性 体内...

用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。...

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

了解小鼠新鲜骨髓外植体中巨核细胞形成前血小板的动力学过程。该方法可在六小时内实时观察并定量分析前血小板延伸，为研究血栓性疾病提供关键数据。

小鼠新鲜骨髓外植体中血小板形成过程的动力学

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