小鼠新鲜骨髓外植体中血小板形成过程的动力学

本实验的总体目标是实时观察在天然环境中成熟的鼠源巨核细胞形成前血小板的过程。该方法具有操作简便、可重复性强和速度快的优点。通过该方法，仅需六小时即可分析大量巨核细胞并观察前血小板的形成过程，而无需像体外培养的鼠源巨核细胞那样等待至少一天。

该方法的一个有趣应用是能够研究药物治疗或基因突变对血小板前体延伸阶段的特异性影响。在此过程中，不会像体外培养那样干扰细胞分化过程。本视频有助于确保骨髓冲洗和切割等关键步骤的准确性。

还详细介绍了如何对形态学和巨核细胞进行分类，这对于血栓性疾病缺陷的表征非常有用。首先，将Tyrode缓冲液在37摄氏度下预热，并打开显微镜加热腔，使温度升至37摄氏度。准备好所有必要的工具，例如计时器、孵育腔、5毫升21号针头注射器、镊子、剃刀刀片、巴斯德吸管、载玻片以及15毫升离心管。

用21号针头插入股骨膝侧的开口，以两毫升Tyrode缓冲液冲洗骨髓，并缓慢推动活塞以获取完整的骨髓柱。使用3 mL塑料移液管小心轻柔地将完整的骨髓转移至载玻片上。切除在冲洗过程中可能受挤压的骨髓两端。

然后使用锋利的剃须刀片切割厚度为0.5毫米的薄横切片，以避免损伤巨核细胞。用塑料移液管将10片切片收集到含有Tyrode缓冲液的1毫升离心管中。小心地将切片转移至直径为13毫米的孵育室中。

吸去缓冲液，并将体积调整为30 µL含5%小鼠血清的Tyrode缓冲液。将切片置于一定距离。用22 mm × 55 mm的盖玻片密封自粘式腔室，倾斜盖玻片以避免产生气泡。

将培养皿置于37摄氏度的恒温培养箱中。启动计时器，在37摄氏度下持续进行实验六小时，拍摄视频以记录巨核细胞的转变过程。30分钟后，骨髓细胞逐渐迁移至外植体周边，形成单层结构。

孵育1小时后，可通过其较大的体积和多叶核形态来鉴定巨核细胞。孵育3小时后，巨核细胞数量增加，部分细胞具有较长的突起。绘制示意图以定位孵育腔室中每个区域的位置。

一小时后，识别每个切片边缘可见的巨核细胞（体积巨大且具有多叶核的细胞），并在绘图上标出其位置。在三小时和六小时后重复此操作。在孵育腔室封闭后三小时和六小时，根据巨核细胞的形态特征对其进行人工计数并分类。

它们被分为小型、大型伴厚实凝块以及延伸出前血小板三种类型。借助成像分析，可随时间推移追踪其演化过程。结果以每次观察时间点各类型所占百分比表示。

传统上，在六小时时间点，野生型小鼠骨髓中可见的巨核细胞有一半在边缘区延伸出前血小板突起。通过随时间连续拍摄图像来追踪圆形巨核细胞的命运，以观察其如何形成前血小板突起。进行此操作时需注意的重要事项是，在整个实验过程中需将外植体保持在37摄氏度。

不同的温度可能会改变实验结果。有趣的是，外植体实验方案可在完成内向显微镜实验后使用。最终，骨髓外植体中的巨核细胞将自然发出荧光，其行为可被轻松研究。

这使得能够在同一动物上结合不同的处理方法，从而减少小鼠的使用数量。总之，外植体方法快速、简便，可提供大量关于天然巨核细胞产生血小板能力的信息。所获得的定性和定量结果对于我们理解血栓性疾病至关重要。

在生理或病理背景下。