Name: 在3D甲基纤维素基水凝胶中培养巨核细胞，以改善细胞成熟并研究僵硬和禁闭的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解在甲基纤维素水凝胶中培养小鼠巨核细胞的方法，用于研究机械限制和基质硬度对细胞分化和成熟的影响。该方案可模拟骨髓微环境，促进前血小板形成并支持流式细胞术和电子显微镜分析。

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作者感谢Fabien Pertuy和Alicia Aguilar在实验室中最初开发了该技术，同时感谢Dominique Collin（斯特拉斯堡查尔斯·萨德隆研究所）对甲基纤维素水凝胶的粘弹性特性进行了表征。本研究得到了ARMESA（医学与公共卫生研究与发展协会）以及ARN基金（ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics）的支持。Julie Boscher获得了法国医学研究基金会资助（FRM基金编号FDT202012010422）。

所有实验均应遵循机构关于实验动物护理和使用的指导方针。视频中展示的所有方案均严格遵守欧洲法律以及法国血液机构（Etablissement Français du Sang，EFS）评审委员会的建议。该方案的首个版本最初于2018年发表在《分子生物学方法》（Methods in Molecular Biology）8。
注意：图1 展示了整个流程的示意图。该流程包括：1）骨组织解剖、骨髓获取及骨髓细胞的机械分离；2）使用磁珠分选法分离谱系阴性（Lin-）细胞；3）在液体培养基或甲基纤维素水凝胶中接种细胞；4）将三维凝胶中培养生成的巨核细胞重新悬浮，以在液体培养基中观察血小板前体的形成。
1. 从成年小鼠中采集骨骼
注意：本节中需尽量减少微生物污染。
<ol>
	<li>准备一个15 mL离心管用于收集骨骼，管中加入含1%总体积青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）抗生素混合液（青霉素10000 U/mL，链霉素100000 µg/mL，L-谷氨酰胺29.2 mg/mL）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。 
	注意：&#160;若使用的所有小鼠基因型相同，可将所有骨骼汇集至同一离心管中，每只小鼠加入1 mL含1% PSG的DMEM。抗生素对于防止骨骼取样期间可能发生的细菌增殖至关重要。</li>
	<li>准备一个50 mL离心管装入70%乙醇用于骨骼消毒，另备一管用于操作过程中冲洗器械。使用灭菌的解剖器械。</li>
	<li>采用异氟烷吸入（4%）对小鼠进行麻醉，并迅速实施颈椎脱位以处死小鼠。随后立即将尸体浸入70%乙醇中进行消毒，以避免微生物污染。</li>
	<li>迅速解剖分离胫骨和股骨。</li>
	<li>使用手术刀切除胫骨踝关节端和股骨髋关节端的骨骺部分。</li>
	<li>将骨骼先在70%乙醇中浸没1秒，随后立即转移至含1% PSG的DMEM培养基中。</li>
</ol>
2. 骨髓解离与Lin-细胞分离
注意：本实验步骤需在层流罩内进行。对于一个培养体系，所有孔均属于同一次实验，不能视为独立的生物学重复。需将所有小鼠的细胞混合在一起，以确保各孔之间的一致性，从而能够相互比较，并消除个体间可能存在的差异。如需设置独立的生物学重复，必须重复进行培养实验。
<ol>
	<li>将骨骼置于培养皿中，用无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗两次，以去除潜在污染物。</li>
	<li>在50 mL离心管中配制DMEM-1% PSG。 
	注意：每只用于实验的小鼠提供 2 mL DMEM - 1% PSG。</li>
	<li>用21号针头的5 mL注射器吸取DMEM - 1% PSG。</li>
	<li>用镊子夹住骨骼，仅将针头斜面从膝侧末端插入。 
	注意：解剖时应保持膝侧骨骺完整，使其中央留有一个小腔隙用于插入针头。残留的骨骺将在灌洗过程中使骨骼保持附着于针头。注意针头插入骨内时，切勿将针尖斜面以上部分深入骨内，以免压碎并损伤骨髓。</li>
	<li>快速按压注射器活塞，将骨髓冲入一个50 mL离心管中。 
	注意：&#160;为避免飞溅并便于操作&#160;将骨的游离端置于管壁处进行骨髓冲洗和释放，并浸入DMEM-1% PSG中。实际操作中，通常使用500 µL至1 mL的体积即可将骨髓完全冲出。当骨髓完全排出后，骨将变为白色。若根据残留的红色判断骨干中骨髓尚未完全排出，可使用新鲜培养基重复冲洗。</li>
	<li>对所有骨骼重复步骤 2.4 和 2.5，必要时用 DMEM - 1% PSG 重新填充 5 mL 注射器。</li>
	<li>使用同一支5 mL注射器和21号针头，将含有冲洗出的骨髓的全部培养基转移至圆底10 mL试管中。 
	注意：更换为10 mL圆底管并非绝对必要，但有助于后续解离步骤的操作。若怀疑存在污染风险，应毫不犹豫地更换注射器和/或针头。</li>
	<li>通过21号针头将培养基和骨髓细胞反复吹打两次，再通过23号针头吹打三次，最后通过25号针头吹打一次，进行细胞解离。 
	注意：避免产生气泡，因为气泡可能对细胞有害。</li>
	<li>将悬液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或在台盼蓝染色条件下用细胞计数板进行人工计数，测定细胞数量并检测细胞活力，以排除死细胞。</li>
	<li>将15 mL离心管以300 x g离心7分钟 g使用1 mL移液管小心吸出上清液并弃去。</li>
	<li>使用小鼠造血细胞分离试剂盒，通过阴性免疫磁珠分选法分离干细胞和祖细胞。 
	注意：本细胞分选的目的是获取对所有筛选抗体（CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7-4）均为阴性的细胞，从而去除已进入除巨核细胞系以外其他分化谱系的细胞。</li>
	<li>根据试剂盒说明书，将细胞沉淀重悬于新鲜配制的M培养基中（PBS含2%终体积的胎牛血清（FBS）和1 mM EDTA），调整细胞浓度至1 × 108 细胞/mL，并将悬液分装至圆底5 mL聚苯乙烯管中，每管最大体积为2 mL。</li>
	<li>向聚苯乙烯管中加入正常大鼠血清，终浓度为50 µL/mL，以及生物素标记的抗体混合物（CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7-4），每毫升样本加入50 µL抗体混合物，轻轻弹击管壁混匀。 
	注意：这些抗体将结合已进入分化途径（除巨核细胞分化途径外）的细胞。</li>
	<li>将试管置于冰上孵育15分钟。</li>
	<li>加入链霉亲和素包被的磁珠，终浓度为75 µL/mL，通过轻轻弹击管壁混匀。</li>
	<li>再次冰浴孵育10分钟。</li>
	<li>如有需要，用M培养基将每管体积调至终体积2.5 mL。</li>
	<li>轻轻弹击离心管使悬液混匀，然后取下管盖，将离心管放入磁力架中，静置3分钟。 
	注意：已进入分化通路并被磁珠包被的细胞将被保留在磁体内部试管管壁上。</li>
	<li>将磁铁和试管倒置，将试管内容物转移至一个新的圆底5 mL聚苯乙烯管中。 
	注意：&#160;转移时不要将离心管从磁力架上取出；应保持离心管在磁力架内，通过翻转磁力架完成操作。动作需平稳，切勿摇晃离心管。</li>
	<li>弃去含有非目标磁性标记细胞的初始管，将新的管子（不加盖）放入磁铁中，再放置三分钟。</li>
	<li>按照步骤2.20的操作，将分离得到的Lin−细胞转移至新的15 mL离心管中。 
	注意：&#160;如果在之前的步骤中使用了多个5 mL聚苯乙烯管，请将所有细胞汇集到同一个15 mL管中。&#160;分选后获得的细胞为造血干细胞和祖细胞。存在血小板生成素（TPO），即巨核细胞生成的主要生理调节因子 10将引导细胞向巨核细胞系分化。</li>
	<li>按照步骤2.10的方法测定Lin−细胞数量和活力。</li>
	<li>计算所需离心的细胞悬液体积，以获得 1 x 106 活细胞数 × 孔数，其中孔数为每种条件下的接种孔数量。</li>
	<li>每个条件准备一支含有适当体积细胞悬液的离心管，于300 x g离心 g 7 分钟</li>
	<li>对于液体培养，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于完全培养基（DMEM，PSG 为终体积的1%，FBS 为终体积的10%，水蛭素 100 U/mL，TPO 50 ng/mL）中，调整细胞终浓度为 2 × 106 可存活细胞/毫升（等于 1 × 106 每500 µL孔加入细胞。在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。（= 培养第0天） 
	&#8203;注意：有关甲基纤维素培养，请参见下一段。例如，为制备一个孔的完全培养基，使用435 µL DMEM、50 µL 100% FBS（终浓度10%）、5 µL 100% PSG（终浓度1%）、5 µL 10 000 U/mL（终浓度100 U/mL）以及5 µL 5 µg/mL TPO（终浓度50 ng/mL）。通常使用4孔或24孔培养板，因其孔径适合每孔所需的500 µL体积。</li>
</ol>
3. 细胞包埋于甲基纤维素水凝胶中
注意：以下方案描述的是制备单孔水凝胶细胞培养的方法，请根据所需孔数进行相应调整。
<ol>
	<li>在室温下解冻 1 mL 的 3% 甲基纤维素储备溶液。&#160;额外准备一份单独的甲基纤维素样品用于注射器涂层。 
	注意：在浓度为 3% 时，甲基纤维素在室温（20–25 °C）下保持液态。</li>
	<li>使用额外的甲基纤维素样品，通过吸取 1 mL 甲基纤维素将配备 18 号针头的 1 mL 鲁尔锁式注射器内壁进行涂层处理，然后完全排出甲基纤维素。 
	注意：此涂层步骤可确保在步骤 3.3 中收集的甲基纤维素体积准确无误。</li>
	<li>使用同一注射器和针头，但换用一份新的甲基纤维素样品，吸取所需体积的甲基纤维素（图 2A）。 
	注意：为在每孔终体积为 500 µL 时达到 2% 的终浓度，需使用 333 µL 的 3% 甲基纤维素。</li>
	<li>小心取下针头。使用灭菌镊子将鲁尔锁接头拧紧至注射器末端（图 2B-C）。</li>
	<li>将第二个未经涂层处理的 1 mL 鲁尔锁式注射器连接至鲁尔锁接头，以实现两个注射器的连接（图 2D）。 
	注意：该第二个注射器无需进行涂层处理。</li>
	<li>将甲基纤维素均匀分配至两个注射器中（图 2E），并暂时放置一旁，待步骤 3.11 时使用。</li>
	<li>配制浓缩 DMEM 培养基，以便在最终甲基纤维素体积（步骤 3.11）中，各组分浓度与液体培养基中的浓度一致（PSG 占终体积的 1%，FBS 占 10%，水蛭素为 100 U/mL，TPO 为 50 ng/mL）。
	<ol>
		<li>每孔终浓度为 1 × 106 个细胞时，需准备 167 µL 的浓缩培养基。该体积的计算依据是使甲基纤维素终浓度为 2%。每孔总反应体积为 500 µL（167 µL 含浓缩培养基的细胞悬液 + 333 µL 甲基纤维素），所有组分的浓度均与液体培养孔中的浓度相同。</li>
		<li>例如，为配制一个孔的完全培养基，可使用 102 µL DMEM、50 µL 100% FBS（终浓度 10%）、5 µL 100% PSG（终浓度 1%）、5 µL 10 000 U/mL 水蛭素（终浓度 100 U/mL）以及 5 µL 5 µg/mL TPO（终浓度 50 ng/mL）。最终得到 167 µL 的培养基用于重悬细胞，加入 333 µL 甲基纤维素后，终体积为 500 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成步骤 2.26 的离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀以每 167 µL 浓缩培养基重悬 1 × 106 个细胞的比例进行重悬。</li>
	<li>取回注射器，并将其中一个从接头处断开。</li>
	<li>用移液器吸取 167 µL 细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液直接加入注射器接头中（图 2F），注意避免引入气泡。 
	注意：&#160;在加入细胞悬液的同时，应缓慢拉动注射器活塞，以腾出空间容纳细胞悬液。</li>
	<li>小心地将两个注射器重新连接（图 2G），避免在螺纹处损失任何悬液。 
	注意：在重新连接前，先拉动活塞，使接头部分留出一半空间，以便第二个注射器顺利连接而不导致悬液溢出。</li>
	<li>通过在两个注射器之间来回推动活塞十次，缓慢混匀甲基纤维素培养基与细胞悬液（图 2H）。</li>
	<li>将全部液体吸入一个注射器中，然后断开两个注射器，将接头保留在空的注射器上。</li>
	<li>将注射器中的内容物排入 4 孔板的一个孔中（图 2I）。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养（即培养的第 0 天）。 
	注意：&#160;可使用一对注射器制备两个甲基纤维素培养孔。此时应将甲基纤维素和细胞悬液的体积均加倍，使细胞总数达到 2 × 106 个。完成步骤 3.13 后，将总体积均分至两个注射器中，使每个注射器含 500 µL。断开连接后，将不含接头的注射器中的液体排入第一个培养孔。然后重新连接两个注射器，将保留接头的注射器中的液体转移至另一个注射器。再次断开连接，此时含 500 µL 液体的注射器不应带有接头，将细胞接种至第二个培养孔中。&#160;3% 甲基纤维素以 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）中的储备液形式购得，而浓缩细胞则悬浮于 DMEM 中。最初已进行对比测试，以确认该混合培养基对实验结果无影响，尤其是与 100% DMEM 的液体培养相比。</li>
</ol>
4. 用于血小板前体分析的细胞重悬
注意：在液体培养基和甲基纤维素培养的巨核细胞之间，必须在可比较的条件下进行血小板前体形成能力的分析。甲基纤维素水凝胶施加的物理限制会抑制血小板前体的延伸。因此，在培养的第3天，将甲基纤维素中生长的细胞重悬于新鲜液体培养基中，以允许其延伸血小板前体。甲基纤维素水凝胶是一种物理水凝胶，加入液体培养基后可轻易稀释。重要的是，为了避免重悬和离心带来的假象，液体培养基对照组的细胞必须与甲基纤维素培养的细胞同时以相同方式处理。参见实验的示意图（图1）。
<ol>
	<li>为每个孔准备一个15 mL离心管，其中加入10 mL预热至37 °C的DMEM-1% PSG培养基，用于重悬细胞。</li>
	<li>将每个孔中的细胞小心地用10 mL DMEM-1% PSG培养基重悬。 
	注意：轻柔地进行数次上下吹打，以彻底溶解甲基纤维素。对于液体孔，确保收集沉积在孔底的所有细胞。</li>
	<li>将离心管以300 × g 离心5分钟。</li>
	<li>同时准备完全培养基（DMEM，终体积1%的PSG，终体积10%的FBS，水蛭素100 U/mL，TPO 50 ng/mL）。 
	注意：在此步骤中，每个孔的样品将被等量稀释，因此需为每个孔准备1 mL完全培养基。</li>
	<li>弃去上清液，并将每个离心管中的细胞沉淀重悬于1 mL培养基中。</li>
	<li>将500 µL细胞悬液重新接种至4孔或24孔板的每个孔中，于37 °C、5% CO2条件下培养。 
	注意：从一个初始孔中可获得两个孔，用于重复观察血小板前体结构。请注意，由于这些重复样本来源于同一原始样品，因此不能视为独立重复。</li>
	<li>重新接种24小时后（即培养第4天），使用明场显微镜和20×物镜，随机采集每个孔的10张图像。 
	注意：细胞倾向于聚集在孔的中央区域，确保视野中细胞数量不过多，以免影响血小板前体的观察与定量。每个视野至少应包含5个巨核细胞。</li>
	<li>在每张图像中计数巨核细胞总数以及延伸出血小板前体的巨核细胞数量，并计算延伸出血小板前体的巨核细胞比例。 
	注意：&#160;该定量过程未实现自动化，需手动计数。可借助ImageJ软件的细胞计数插件，通过点击细胞进行标记以辅助计数。每个孔采集10个视野，且每个样本设两个重复孔，每种条件下总计约可观察到150–300个巨核细胞。</li>
</ol>
5. 细胞固定与保存以备后续分析
警告：本方案使用的固定剂必须在通风橱中操作，并佩戴防护装备。
注意：目的是在细胞完全固定之前，始终保持凝胶对细胞的约束状态。因此，无论使用何种固定剂，都必须将其直接加入孔中并覆盖在甲基纤维素上层，注意不要扰动凝胶。液体培养物也采用相同的实验步骤。
<ol>
	<li>加入与接种体积相等的固定液（本方案中为 500 µL），轻轻加在甲基纤维素上方，避免破坏凝胶。根据所用固定液的要求等待相应时间（至少 10 分钟）。 
	注意：固定剂在凝胶中的扩散应非常迅速，可通过凝胶颜色的快速变化（从粉红色变为黄橙色）来确认。通常使用多聚甲醛（8% 溶于 DPBS，每孔 500 µL）进行免疫标记，而电子显微镜分析则使用戊二醛（5% 溶于卡可基酸盐缓冲液，每孔 500 µL）。</li>
	<li>使用 P1000 移液器轻轻吹打固定液和凝胶数次，使甲基纤维素均匀稀释。</li>
	<li>使用同一支移液器和枪头，将孔中的全部液体转移至含有10 mL DPBS的15 mL离心管中，并进行匀浆。</li>
	<li>将混合物在300 × g条件下离心 g 7 分钟 
	注意：可能需要进行第二次洗涤步骤，以彻底去除所有甲基纤维素</li>
	<li>弃去上清液，根据所需的分析类型（免疫标记、流式细胞术），将巨核细胞沉淀重悬于适当的培养基中9，电子显微镜……）（关于电子显微镜，亦可参见纸质方法） &#34;原位 利用透射电子显微镜探索巨核细胞生成的主要步骤&#34; 本期 JoVE 中）。</li>
</ol>

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<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在过去的十年中，力学生物学在生物学的许多领域引起了越来越多的关注。目前普遍认为，细胞周围的机械环境在其行为中确实发挥作用，这凸显了研究巨核细胞如何感知和响应细胞外机械信号的重要性。准确测量骨髓组织在体内的刚度具有挑战性in situ11，特别是当考虑造血性红骨髓时，因为在大型哺乳动物中，红骨髓位于骨小梁内部，而较易获取的骨干骨髓主要由脂肪细胞（黄骨髓）组成12。对于小鼠的分离骨髓而言，尽管其骨干主要含有红骨髓，但另一个问题是骨髓一旦从骨中提取出来便不再保持结构完整性。然而，Shin 及其合作者利用原子力显微镜测定了小鼠骨干骨髓的刚度，得到的值为 Emarrow = 0.3 ± 0.1 kPa，表明骨髓属于体内最柔软的组织之一6。
本方案的关键在于比较巨核细胞在液体培养基与水凝胶中的行为差异。在液体环境中，细胞均沉降至孔板底部，接触坚硬的塑料表面，并可能与其他细胞接触。相比之下，嵌入甲基纤维素水凝胶中...

细胞在体内经历复杂的三维微环境，并受到化学信号与力学物理信号之间相互作用的影响，包括来自组织的刚度以及邻近细胞和周围基质造成的空间限制 1,2,3刚度和空间限制对细胞行为的重要性直到最近几十年才被认识到。2006年，Engler 等人的开创性研究 4 强调了机械环境在细胞分化中的重要性。作者证明，细胞基质刚度的变化可引导干细胞向不同的分化谱系定向。自此，机械信号对细胞命运和行为的影响日益受到重视并被广泛研究。. 尽管骨髓是机体最柔软的组织之一，但它具有被骨骼限制在内的三维结构组织。骨髓的硬度虽然在技术上难以精确测量，但估计介于15至300 Pa之间 5, 6在基质中，细胞彼此之间紧密相邻。此外，其中大多数细胞正向窦状血管迁移，以进入血液循环。这些条件对邻近细胞产生了额外的机械约束，细胞必须适应这些力学作用力。力学信号是一个重要的参数，其对巨核细胞分化和血小板前体形成的影响直到最近才开始被研究。尽管巨核细胞能够分化 体外 在传统液体培养中，它们无法达到所观察到的成熟程度 体内，部分原因在于缺乏来自三维环境的机械信号刺激 7在水凝胶中培养祖细胞可提供液体环境中所缺乏的三维力学信号。
几十年来，水凝胶在血液学领域得到了广泛应用，尤其是在集落形成实验中用于培养细胞，以定量造血祖细胞。然而，这类水凝胶很少被用于研究三维力学环境对造血细胞成熟和分化过程的生物学影响。近年来，本实验室开发了一种基于甲基纤维素的三维培养模型8。这种非反应性物理凝胶是模拟原代巨核细胞所处物理约束环境的有效工具。它由纤维素通过羟基（-OH）被甲氧基（-OCH3）取代而制得。甲基取代程度以及甲基纤维素的浓度共同决定了水凝胶凝固后的刚度。在该技术的开发过程中，已证实当杨氏模量在30至60 Pa范围内时，是巨核细胞生长的最佳凝胶刚度9。
以下方案描述了一种在三维甲基纤维素水凝胶中培养小鼠巨核系祖细胞的方法。先前的研究表明，与标准的液体培养相比，该水凝胶培养可提高巨核细胞多倍体化的程度，改善细胞成熟度和细胞内结构组织，并增强巨核细胞在重悬于液体培养基后延伸前血小板的能力9。本文详细描述了从小鼠骨髓中分离Lin−细胞、将其包埋于甲基纤维素水凝胶中进行三维培养的实验步骤，以及对其产生前血小板能力的定量分析和细胞回收以用于后续检测的方法。

<table><tbody><tr><td>18号针头</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>21号针头</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>23号针头</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>25号针头</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>4孔培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>细胞夹</td><td>Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>带滤纸片的细胞沉降漏斗</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>细胞离心涂片机</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>无菌 Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>EasySep 磁力架</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠造血祖细胞分离试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19856A</td><td>生物素标记抗体（CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7&amp;ndash;4）和链霉亲和素包被的磁珠</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Healthcare Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁扣 1 mL 注射器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>或 BD MEDICAL 的 309628 型注射器</td></tr><tr><td>鲁尔锁扣注射器连接头</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R&amp;D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸包被载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10,000 单位/mL 青霉素，10,000 &amp;mu;g/mL 链霉素，29.2 mg/mL 谷氨酰胺</td></tr><tr><td>大鼠血清</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>重组水蛭素</td><td>Transg&amp;egrave;ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>重组人血小板生成素 (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10,000 单位/mL</td></tr><tr><td>圆底 10 mL 塑料管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>圆底 5 mL 聚苯乙烯管</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于甲基纤维素的三维水凝胶培养巨核细胞以促进细胞成熟并研究刚度与空间限制的影响

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

三维环境所导致的限制性条件和力学约束正日益被视为影响细胞行为的重要决定因素。因此，三维培养技术已被开发出来，以更接近地模拟 体内 情况。巨核细胞由骨髓（BM）中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化而来。骨髓是人体最柔软的组织之一，被包裹在骨内。由于骨在细胞尺度上几乎不可延展，巨核细胞因此同时处于低刚度和高度受限的环境中。本方案介绍了一种通过免疫磁珠分选法分离小鼠谱系阴性（Lin-）HSPCs，并在由甲基纤维素构成的三维（3D）培养基中将其分化为成熟巨核细胞的方法。甲基纤维素对巨核细胞无反应性，其刚度可调节至与正常骨髓相当的水平，或提高以模拟病理性纤维化骨髓。本方案还详细描述了后续细胞分析所需的巨核细胞回收步骤。尽管在三维环境中血小板前体的延伸受到抑制，但本文将说明如何将巨核细胞重悬于液体培养基中，并定量评估其延伸血小板前体的能力。相较于在液体环境中培养的巨核细胞，在三维水凝胶中培养的巨核细胞具有更强的形成血小板前体的能力。该三维培养体系能够：i）促进祖细胞向更高成熟阶段的巨核细胞分化；ii）重现可能在 体内 但在传统的液体培养中容易被忽视，以及 iii) 研究由三维环境提供的机械信号所诱导的转导通路。

使用本方案获得的数据最初于2016年发表在《血液》杂志上9。
根据实验方案，细胞被接种于液体培养基或甲基纤维素水凝胶培养基中。在液体培养基中，细胞全部沉降至孔板底部，与坚硬的塑料表面接触，有时也与其他细胞接触。相比之下，包埋在甲基纤维素水凝胶中的细胞则在凝胶中均匀分布，并与邻近细胞相互隔离（图3A）。与液体培养相比，终浓度为2%的甲基纤维素凝胶使巨核细胞的平均直径略有增加（图3B），这与文献报道中较高的倍性水平一致9。相反，将甲基纤维素浓度再提高0.5%则会抑制巨核细胞的分化，表现为平均直径减小（图3B）。
液体培养中分化的巨核细胞与在其他条件下分化的巨核细胞在超微结构上存在明显差异 体内 在骨髓内。成熟巨核细胞的一个特征是存在复杂的胞质...

目前公认，细胞的三维环境在其行为、成熟和/或分化过程中可能发挥重要作用。本方案描述了一种三维细胞培养模型，旨在研究物理限制和机械约束对巨核细胞的影响。

三维环境所导致的限制效应和力学约束正日益被视为影响细胞行为的重要决定因素。三维...

本方案可用于体外评估骨髓中天然巨核细胞所处的限域环境和培养基刚度对其行为和成熟过程的影响。该技术的主要优势在于采用了一个简化的模型，消除了细胞-细胞和细胞-基质相互作用，专注于力学因素的影响。实验过程中必须严格遵守良好的实验室规范和无菌操作条件。事实上，即使微量的水凝胶污染也会对巨核细胞的分化产生显著影响。要制备单孔水凝胶细胞培养，首先在室温下解冻两份1毫升的3%甲基纤维素溶液，然后用甲基纤维素预润涂1毫升鲁尔锁式注射器：先吸取1毫升，再完全排出。接着，使用同一注射器和针头，从新的甲基纤维素 aliquot 中吸取333微升。小心移除针头后，使用灭菌镊子将鲁尔锁接头拧到注射器末端，然后将第二个未包被的1毫升鲁尔锁注射器连接到该接头上。将甲基纤维素均匀分配至两个注射器中，并暂时放置一旁。接下来，将先前分离的小鼠谱系阴性造血干细胞和祖细胞以每167微升含1×10⁶个细胞的密度重悬于浓缩培养基中。从连接器上断开其中一个注射器，用移液器将167微升细胞悬液直接注入连接器中，同时缓慢拉动另一个注射器的活塞，为细胞悬液腾出空间。将全部细胞悬液加入连接器后，继续拉动活塞，将悬液从连接器中抽出，并小心重新连接第二个注射器，注意避免悬液在螺纹处损失。为使甲基纤维素培养基与细胞悬液充分混匀，缓慢来回推动两个注射器的活塞10次，然后将全部液体吸入其中一个注射器，断开两个注射器，将连接器保留在空的注射器上。将注射器中的内容物排入四孔板的一个孔中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育该板。为了分析前血小板，在培养的第三天，小心地将一个孔中的所有细胞转移至含有10毫升添加1%PSG的DMEM的15毫升离心管中。通过轻柔吹打重悬细胞，以充分稀释甲基纤维素，然后在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升完全培养基中，并将细胞以每孔500微升接种至4孔板中。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。次日，使用20倍物镜的明场显微镜，每孔随机采集10张图像，确保视野中细胞数量不过多，并且每个视野至少包含五个巨核细胞。使用 ImageJ 对每张图像中巨核细胞的总数以及延伸前血小板突起的巨核细胞数量进行计数，以计算延伸前血小板突起的巨核细胞比例。为固定细胞以供后续分析，将固定液直接加入甲基纤维素表面，注意不要破坏凝胶结构。根据所用固定液的要求等待适当时间后，使用 P1000 移液器轻轻吹打固定液和凝胶，直至甲基纤维素被均匀稀释。使用同一枪头，将孔中的全部内容物转移至含有10毫升DPBS的15毫升离心管中，并通过混匀进行匀浆。离心混合物。弃去上清液，将巨核细胞沉淀重悬于适合所需分析的培养基中。培养至第三天时，液体培养基中的巨核细胞已沉降至孔板底部，与坚硬的塑料表面及其他细胞接触。相比之下，包埋在甲基纤维素水凝胶中的细胞则呈均匀分布，并与邻近细胞相互隔离。在不同培养条件下对巨核细胞平均直径的分析显示，与液体培养相比，2%甲基纤维素可轻微增加巨核细胞的平均直径。然而，将甲基纤维素浓度提高0.5%会损害巨核细胞的分化，表现为平均直径减小。在具有代表性的透射电子显微镜图像中，骨髓内体内分化的巨核细胞胞质内膜结构紧密排列，胞质区域界限清晰。而在液体培养条件下，内膜结构多呈小的圆形或椭圆形，或为无明确胞质区域分界的长条状囊泡。相比之下，2%甲基纤维素培养体系中的细胞膜紧密相邻，细胞质区域界限分明，更接近体内结构。培养至第四天时，此前在水凝胶中培养的巨核细胞比在液体培养基中培养的巨核细胞表现出更明显的前血小板形成。采用液体预培养时，伸出前血小板的巨核细胞平均比例通常约为15%至20%，而采用甲基纤维素水凝胶预培养时，该比例可达35%至40%。进行此操作时，必须非常精确地移取适当的体积，因为甲基纤维素终浓度的微小变化都可能显著改变培养基的硬度。细胞在水凝胶中成熟后，可通过流式细胞术回收巨核细胞以进行倍性及细胞标志物分析，或进行固定后用于电镜观察或目标蛋白的免疫染色。

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科研

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生物学

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