通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

本方案将使研究人员能够解答有关神经元连接模式及电路功能背后的空间组织的重要问题。该技术的主要优势在于能够对完整三维组织深部的神经元形态进行可视化观察。该方法操作简便，因而易于重复。

初次进行实验的研究人员应能够熟练操作本技术。为获得高质量的数据，必须确保组织样本透明清晰。通过直观展示适当的组织透明化及澄清技术，将有助于实现结果的轻松重复。

首先，将浸泡在水凝胶中的脑组织置于真空孵育箱中，在 37 摄氏度、负 90 千帕真空条件下孵育 3 小时。保持管盖未拧紧，以确保真空环境正常形成。随后在室温下用 PBS 轻柔振荡洗涤组织 10 分钟。

将聚合的组织样本放入电泳室中，并记录组织在电泳室内的方向。向电泳室和储液槽中加入提供的电泳SDS缓冲液。以70伏、1安培、35摄氏度的恒定电流运行，每毫升组织约运行两小时。

定期检查样本，通过将样本从腔室中取出并以相同方向放回，观察脑组织是否已充分透明。样本透明完成后，在室温下用 PBS 缓冲液浸泡过夜，尽可能频繁地更换新鲜 PBS。最后一次 PBS 洗涤后，在室温下用去离子水洗涤组织三次，每次五分钟。

组织将变得不透明并可能膨胀。将组织在室温下于折射率匹配溶液中孵育至少四小时。孵育期间，构建合适的样品成像腔室。

首先使用载玻片作为安装的基底，然后放置橡胶或塑料垫片，并用超级胶水固定，确保没有孔洞。将透明组织放入预先装有折射率匹配溶液的安装腔室中。通过在上方放置盖玻片并用指甲油密封，牢固地固定组织。

通过在玻璃上方直接滴加一滴折射率匹配的封片液来成像该组织。对于厚度超过五毫米的组织，构建大型组织成像腔时，使用一个带有高壁的10厘米玻璃培养皿。将一个50毫升的锥形管置于中央，确保该管的直径足够大，能够容纳所用物镜镜头的镜筒部分。

将3%琼脂糖溶于水中，倒入玻璃培养皿与锥形管之间的空隙，静置冷却一小时，形成固态琼脂糖环。使用强力胶将组织牢固地粘附在腔室底部，并向腔室内加入折射率匹配溶液；该溶液若未隔绝空气并在4°C条件下保存，可能开始发生聚合。

使用共聚焦显微镜采集图像。打开所有相关的成像设备。将样品放置在载物台上。

小心地将物镜接近浸液介质，并形成连续的介质柱。使用落射荧光找到合适的成像视野。首先设置分辨率和扫描速度参数。

若使用共聚焦显微镜进行成像，应完全关闭针孔以获得最小的光学切片，从而实现最佳的Z轴分辨率。逐步增加激光功率或传感器增益，直至获得信噪比较高的合适图像。若采用标准的EGFP或tdTomato双色成像，请设置光收集参数。

根据观察到的组织起始点和终止点设置Z轴层厚参数。根据所需的Z轴分辨率设置步进大小。较小的步进大小将获得更高的Z轴分辨率，但可能导致样本漂白。

当对图像采集参数满意后，开始采集图像。确保图像具有较高的信噪比，并能清晰显示结构的边界。图像采集完成后，使用分析软件中的嵌入式统计工具和分类脚本对代表性细胞形态进行分析。

收集的数据表明，与神经元1相比，神经元2具有更大的树突结构以及更高密度的树突棘。为验证该结果，进行了标准的Sholl分析，结果证实神经元2的树突复杂性高于神经元1，表现为从胞体起始50至100微米范围内的Sholl交叉次数增加。神经元1含有更高比例的具有丝状突起样形态的树突棘，属于未成熟的树突棘亚型。

具有明确头部的棘突，即蘑菇状棘突，可能含有更发达且更成熟的突触。因此，神经元2更为成熟，且成熟棘突的密度更高。透明化处理后，组织块可采用传统的免疫组织化学方法进行染色。