Name: 在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习使用CUT&Tag技术对植物进行表观基因组分析，通过分离完整细胞核和Tn5转座酶原位切割，实现H3K4me3组蛋白修饰的高通量测序。该方法为基因表达调控研究提供了高效工具。

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本工作部分得到了以下资助：国家自然科学基金委员会（NSFC，31900395，31971985，31901430）、中央高校基本科研业务费、海南崖州湾种子实验室（JBGS，B21HJ0403）、中国海南省自然科学基金（320LH002）以及 JCIC-MCP 项目。

1. 准备转座酶和储备溶液（第1天）
注意：在此步骤中，寡核苷酸接头与 Tn5 转座酶结合以形成具有活性的转座酶。
<ol>
	<li>使用退火缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）将引物（引物A、引物B和引物C）稀释至100 µM浓度（引物序列信息参见表1，工作溶液配方参见表2）。保存于-20 °C，待用。</li>
	<li>在PCR管中设置以下两个反应：反应1（接头AB），10 µL 100 µM 引物A，10 µL 100 µM 引物B；反应2（接头AC），10 µL 100 µM 引物A，10 µL 100 µM 引物C。</li>
	<li>在PCR仪中使用以下程序对接头进行退火：加热盖（102 °C），75 °C 15分钟，60 °C 10分钟，50 °C 10分钟，40 °C 10分钟，25 °C 30分钟。 
	注：接头为部分双链DNA分子（浓度 = 50 pmol/µL）。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中设置以下反应：10 µL pA-Tn5转座酶（500 ng/µL 或 7.5 pmol/µL），0.75 µL 接头AB（50 pmol/µL），0.75 µL 接头AC（50 pmol/µL），7 µL 偶联缓冲液。轻轻吹打混匀20次，于30 °C水浴中孵育1小时。最终转座酶浓度 = 4 pmol/µL。保存于-20 °C，待用。 
	&#8203;注：接头AB : 接头AC : 转座酶的摩尔比 = 0.5 : 0.5 : 1。</li>
	<li>根据表2提供的配方配制储备液，并通过高压灭菌或过滤方式对储备液进行灭菌。</li>
	<li>对剪刀、滤纸、不锈钢筛网、研钵、研杵等器具进行高压灭菌和消毒。</li>
</ol>
2. 细胞核分离（第2天）
<ol>
	<li>将离心机预冷至 4 °C。每 1 g 起始材料（棉花叶片），准备 25 mL 核分离缓冲液 A（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）、20 mL 核分离缓冲液 B（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）、50 mL 核洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物 0.1%）和 1 mL 抗体缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，150 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，1 mg/mL BSA，蛋白酶抑制剂混合物 0.1%，0.05% w/v 狄戈辛）。将试管置于冰上备用。</li>
	<li>将新鲜叶片（约 1 g）在液氮中研磨成细粉，并转移至含有 25 mL 预冷核分离缓冲液 A 的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>轻轻混匀缓冲液，将离心管置于冰上孵育 5 分钟，并轻轻振荡以使材料均匀分散。</li>
	<li>在 4 °C 下以 500 rcf 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。</li>
	<li>倾去上清液，用 20 mL 含 0.5% Triton X-100 的预冷核分离缓冲液 B 重悬沉淀。轻轻倒置离心管，确保沉淀完全重悬。 
	注意：20 mL 核分离缓冲液 B 适用于 1 g 起始材料，可根据样品量按比例调整。
	<ol>
		<li>进行预实验，测试不同浓度 Triton X-100 的效果（例如，每 100 mg 研磨组织使用 2 mL 核分离缓冲液 B，分别含 0.1%、0.25%、0.5% 和 1% Triton X-100）。合适的 Triton X-100 浓度表现为裂解后低速离心（&#60; 500 rcf，4 分钟）后底部出现白色/灰色核沉淀，上清液呈深绿色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两层筛网组合过滤所得细胞裂解液：上层为 500 目筛网，用于去除较大组织碎片；下层为 1000 目筛网，用于收集细胞核。 
	注意：应根据植物细胞核的大小选择合适的筛网孔径。</li>
	<li>在筛网背面使用无菌滤纸吸收裂解液中的细小细胞碎片。</li>
	<li>将残留在 1000 目筛网上层的含核裂解液转移至四个新的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟，收集细胞核。</li>
	<li>用移液器吸头尽可能吸除上清液，并用核洗涤缓冲液洗涤沉淀。</li>
	<li>加入 800 µL 核洗涤缓冲液，轻轻倒置离心管以重悬沉淀。再次在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟。</li>
	<li>共进行 3 次洗涤。</li>
	<li>（可选）对细胞核进行 DAPI 染色后在显微镜下观察。
	<ol>
		<li>从步骤 2.11 中取 100 µL 核悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中。加入 900 µL 核洗涤缓冲液和 2 µL DAPI 储存液（1 mg/mL），使 DAPI 的终工作浓度为 2 µg/mL。室温避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>染色完成后，在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟收集细胞核。</li>
		<li>用移液器吸头尽可能吸除上清液，用 800 µL 核洗涤缓冲液洗涤 3 次。</li>
		<li>尽可能吸除上清液，用 100 µL 核洗涤缓冲液重悬细胞核。</li>
		<li>使用荧光显微镜 DAPI 通道观察细胞核。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合并两个离心管中的细胞核（每个 1.5 mL 管中核体积约为 50 µL）。在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟。用移液器吸头尽可能吸除残留缓冲液。</li>
</ol>
3. 抗体孵育
<ol>
	<li>用1 mL抗体缓冲液在1.5 mL离心管中重悬每份50 µL的细胞核。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中设置以下反应：IgG对照组设两个生物学重复，每管加入150 µL细胞核（约含1 µg染色质）和2 µL IgG（1 mg/mL）；H3K4me3检测组设两个生物学重复，每管加入150 µL细胞核和2 µL抗H3K4me3抗体（1 mg/mL）。</li>
	<li>轻轻混匀溶液，并将离心管置于4 °C、12 rpm的水平摇床上过夜杂交。</li>
	<li>将离心机预冷至4 °C。在50 mL离心管中新鲜配制50 mL免疫沉淀（IP）洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，0.05% w/v皂苷），并将该管置于冰上静置。</li>
	<li>在4 °C、300 rcf条件下离心5分钟，弃去每管中的抗体缓冲液。</li>
	<li>向每管中加入800 µL IP洗涤缓冲液，轻轻混匀，然后将离心管置于室温、12 rpm的水平摇床上孵育5分钟。</li>
	<li>洗涤后，在4 °C、300 rcf条件下离心4分钟，用移液器吸头吸除上清液。 
	注意：为避免扰动细胞核沉淀，每管中残留约50–80 µL缓冲液。</li>
	<li>重复步骤3.6–3.7两次。</li>
	<li>第三次洗涤后，在4 °C、300 rcf条件下离心2分钟，尽可能彻底去除残留缓冲液。</li>
</ol>
4. 转座酶孵育
<ol>
	<li>通过将1 mL IP洗涤缓冲液与30 µL 5 M NaCl混合，新鲜配制1 mL转座酶孵育缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，0.05% w/v皂苷）。</li>
	<li>为准备用于孵育的Tn5转座酶混合液，将1 µL转座酶加入每150 µL转座酶孵育缓冲液中。 
	&#8203;注意：首先根据反应数量配制转座酶溶液混合液，然后取150 µL分装至各管中。</li>
	<li>用150 µL转座酶溶液重悬细胞核。</li>
	<li>将各管置于水平摇床上，室温下以12 rpm振荡2–3小时，每10–15分钟混匀一次。</li>
	<li>转座酶孵育结束后，在4 °C下以300 rcf离心4分钟，弃去各管中的转座酶孵育缓冲液。</li>
	<li>用IP洗涤缓冲液洗涤各管：向每管中加入800 µL IP洗涤缓冲液，轻轻混匀后，将各管置于水平摇床上，室温下以12 rpm振荡5分钟。</li>
	<li>在4 °C下以300 rcf离心4分钟，用移液器吸头吸除上清液。</li>
	<li>重复步骤4.6–4.7两次。</li>
	<li>第三次洗涤后，在4 °C下以300 rcf离心2分钟，尽可能彻底去除残留缓冲液。</li>
</ol>
5. 标签化反应（Tagmentation）
<ol>
	<li>通过将 2 mL IP 洗涤缓冲液与 60 µL 5 M NaCl 和 20 µL 1 M MgCl2 混合，新鲜配制 2 mL 剪切缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物 0.1%，10 mM MgCl2，0.05% w/v 狄高辛素）。</li>
	<li>用 300 µL 剪切缓冲液重悬细胞核。</li>
	<li>混匀溶液，并在 37 °C 水浴中孵育 1 小时以进行片段化。</li>
	<li>加入 10 µL 0.5 M EDTA（终浓度约 15 mM）和 30 µL 10% SDS（终浓度 1%），终止片段化反应。</li>
</ol>
6. DNA 提取与 NGS 文库构建
<ol>
	<li>加入300 µL CTAB DNA提取缓冲液，具体方法见参考文献7。将离心管置于65 °C水浴中孵育30分钟，每约10分钟颠倒混匀一次。</li>
	<li>向每个离心管中加入600 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀。</li>
	<li>将相分离凝胶管在4 °C、13,000 rcf条件下预离心2分钟。将上述溶液转移至相分离凝胶管中。</li>
	<li>在4 °C、13,000 rcf条件下离心10分钟。</li>
	<li>将上清液（约600 µL）转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>向每个离心管中加入600 µL氯仿，充分混匀。</li>
	<li>在4 °C、13,000 rcf条件下离心10分钟。</li>
	<li>将上清液（约600 µL）转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>加入12 µL 100%乙醇和2 µL GlycoBlue共沉淀剂，充分混匀后于-20 °C保存1小时。</li>
	<li>在4 °C、13,000 rcf条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用75%（v/v）乙醇洗涤DNA沉淀，在4 °C、13,000 rcf条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将DNA沉淀空气干燥后溶于25 µL ddH2O中。</li>
	<li>按以下步骤设置PCR反应体系：总体积50 µL，加入24 µL DNA、11 µL ddH2O、10 µL 5x TAE缓冲液、2 µL P5引物（10 µM）、2 µL P7引物（10 µM）和1 µL TruePrep Amplify酶。PCR程序：72 °C延伸3分钟，98 °C变性30秒；随后进行14个循环（98 °C变性30秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C延伸5分钟。 
	注意：第一步72 °C延伸3分钟不可省略。文库过度扩增将导致NGS中PCR重复序列比例升高。当每反应使用约1 µg染色质时，H3K4me3的PCR循环数应从12–14个循环开始。</li>
	<li>取2 µL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。</li>
	<li>使用商品化的DNA纯化磁珠纯化PCR产物。</li>
	<li>使用荧光计和琼脂糖凝胶电泳对文库进行定量。 
	注意：通过qPCR测定，文库的有效浓度应&#62;2 nM，以确保测序质量。</li>
	<li>进行高通量测序（NGS）及数据分析。</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
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<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
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<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

所有作者均与上述提及产品的任何贸易公司无利益冲突。

本文中，我们介绍了CUT&amp;#38;Tag技术，该技术通过简化的操作流程，仅需少量细胞即可实现高分辨率、极低背景的DNA文库构建，相较于染色质免疫沉淀（ChIP）具有显著优势。我们在棉花叶片中成功实现了H3K4me3的图谱分析，表明最初为动物细胞设计的CUT&amp;#38;Tag技术同样适用于植物细胞。在植物细胞核中进行CUT&amp;#38;Tag实验时，ChIP实验常用的Tris缓冲体系8以及动物CUT&amp;#38;Tag中使用的HEPES缓冲体系均有效4,9。完整植物细胞核的分离是CUT&amp;#38;Tag在植物中成功应用的关键步骤。在先前报道的细胞核分离方法中4，研磨组织的溶液在细胞裂解前需通过两层Miracloth滤布过滤。我们发现，当使用相对较老的叶片（例如两个月大的棉花植株叶片）或棉纤维（例如20-DPA纤维）时，该方法获得足够细胞核的效率降低，原因是Miracloth会截留大部分研磨后的组织。在...

转录因子结合的DNA位点以及与组蛋白修饰标记相关的开放染色质区域在调控基因表达中发挥关键功能作用，是表观遗传学研究的主要焦点1。传统上，染色质免疫沉淀实验（ChIP）结合深度测序（ChIP-seq）被广泛用于全基因组范围内特异性组蛋白修饰或特定蛋白质结合DNA靶标的鉴定，是表观遗传学领域广泛应用的技术2。靶位点切割与标签化（Cleavage under targets and tagmentation, CUT&amp;Tag）技术最初由Henikoff实验室开发，用于捕获全基因组中与蛋白质结合的DNA片段5。与ChIP相比，CUT&amp;Tag能够在细胞用量较少的情况下，通过更简化的实验流程，生成高分辨率且背景信号极低的DNA文库3。迄今为止，利用CUT&amp;Tag分析具有特定组蛋白修饰的染色质区域的方法已在动物细胞中建立4,5。特别是单细胞CUT&amp;Tag（scCUT&amp;Tag）技术也已成功应用于人类组织和细胞6。然而，由于植物细胞壁结构复杂且含有多种次生代谢物，CUT&amp;Tag在植物组织中的应用仍面临较大的技术挑战。
此前，我们报道了一种CUT&amp;利用异源四倍体棉花叶片中分离的完整细胞核进行标签化实验方案4为展示利用植物组织进行细胞核分离和DNA捕获的效率，本文呈现了相应的分析流程。主要步骤包括完整细胞核的分离、 原位 染色质修饰抗体孵育、转座酶孵育、接头整合及DNA文库构建。问题排查重点针对CUT&amp;植物细胞核分离及质量控制的标签文库制备 
本研究中，我们提出了一种适用于植物的优化 CUT&amp;Tag 技术。我们不仅提供了棉花叶片中 H3K4me3 分析的逐步实验方案，还优化了植物细胞核分离的方法，包括选择合适浓度的去污剂以实现有效细胞裂解的策略，以及过滤细胞核的策略。本更新版方案还包含了带有关键注释的详细操作步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td></td><td></td><td>配制10 mg/mL BSA储存液，-20&amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>皂苷（~50%（TLC））</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>配制5%皂苷储存液（将200 mg皂苷（~50%纯度）溶于2 mL DMSO中）。注意：使用0.22微米滤膜过滤除菌，-20&amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td></td><td></td><td>配制0.5 M EDTA（pH = 8.5）储存液。注意：配制100 mL 0.5 M EDTA（pH = 8.5）需约2 g氢氧化钠（NaOH）颗粒调节pH</td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue共沉淀剂（15 mg/mL）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td></td><td></td><td>配制1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;储存液</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td></td><td></td><td>配制1 M KCl储存液</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v:v:v）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td></td><td></td><td>配制5 M NaCl储存液</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td></td><td></td><td>配制2 M亚精胺储存液，-20&amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td></td><td></td><td>配制10% SDS储存液。注意：勿高压灭菌，使用0.22微米滤膜过滤除菌</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td></td><td></td><td>配制1 M Tris（pH = 8.0）储存液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>配制20% Triton X-100储存液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUT&amp;Tag用高活性pG-Tn5/pA-Tn5转座酶</td><td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>检查与Tn5融合的蛋白A或蛋白G对抗体的亲和力。通常，蛋白A和蛋白G具有广泛的抗体结合能力，但蛋白A对兔源抗体亲和力较高，蛋白G对鼠源抗体亲和力较高。请根据所用抗体选择合适的转座酶产品。</td></tr><tr><td>TruePrep扩增酶</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&amp;nbsp;分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr></tbody></table>

利用靶向切割与标签化技术对植物中h3k4me3修饰进行分析

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

染色质水平的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰、转录因子行为以及非编码RNA与其招募蛋白的相互作用，可实现基因表达的时间和空间控制。靶位点切割与标签化（CUT&amp;#38;Tag）是一种染色质蛋白锚定技术，该方法首先通过特异性抗体识别目标染色质蛋白，随后抗体结合蛋白A-转座酶（pA-Tn5）融合蛋白，由该融合蛋白对目标染色质进行切割 原位 通过镁离子的激活。在此，我们提供我们先前发表的CUT&amp;#38; 使用异源四倍体棉花叶片中分离的完整细胞核进行标签化实验的改良方案。该逐步操作流程可用于植物表观基因组学研究。此外，还提供了针对植物细胞核分离的大量改良步骤及关键性评注。

图1 描述了CUT&amp;Tag实验流程。图2 显示了完整细胞核的DAPI染色结果。“细胞核分离”步骤的目标是获得足量完整的细胞核，以用于后续的CUT&amp;Tag反应。图3 显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。在实验设置中，需平行设立IgG阴性对照组。与IgG对照组相比，使用H3K4me3抗体样品拉下的DNA片段主要集中于约280至500个碱基对之间。图4 显示了抗H3K4me3抗体组与IgG阴性对照组相比所获得的下一代测序结果。
<img alt="细胞核分离与抗体孵育示意图；DNA提取、NGS文库构建流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62534/62534fig01.jpg" data-altup...

靶点切割与标签化（CUT&amp;Tag）是一种高效的染色质表观基因组分析策略。本方案介绍了一种优化的CUT&amp;Tag方法，用于植物中组蛋白修饰的分析。

利用靶向切割与标签化技术对植物中H3K4me3修饰进行分析

染色质水平上的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰、转录因子行为，以及非编码RNA及其……

本实验的总体目标是鉴定遍布基因组的与蛋白质结合的DNA片段，以反映染色质的状态。为实现这一目标，需进行三项特殊操作。首先，从植物细胞中分离出完整的细胞核。其次，在原位通过特异性抗体识别染色质的修饰。第三，该抗体结合了蛋白A-转座酶融合蛋白（Tn5转座酶），在镁离子激活下原位切割染色质。随后，DNA片段与染色质修饰结合位点被整合上接头序列，准备进行DNA文库构建。聚合酶链式反应富集增强型测序。染色质水平的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰、转录因子行为以及非编码RNA与其招募蛋白的相互作用，可实现基因表达的时间和空间控制。由Henikoff实验室开发的CUT&Tag技术是一种高效染色质表观基因组分析的酶锚定方法。本研究以棉花叶片为实验材料，以组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（Histone H3 Lysine-4 Trimethylation）抗体为例，进行染色质谱型分析。我们提供了一套优化的植物CUT&Tag实验流程，并配有操作视频。每次进行CUT&Tag样品制备时，需采集一克棉花叶片组织。将叶片与液氮研磨成细粉，转移至含有25 mL预冷的细胞核分离缓冲液A的50 mL Falcon管中。轻轻混匀缓冲液，将管子置于冰上孵育5分钟，并轻轻振荡以使材料均匀分散。随后在4°C下以500 × g（相对离心力，rcf）离心5分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液，沉淀用20 mL含有0.5%吐温-100（Triton）的预冷细胞核分离缓冲液B重悬。轻轻颠倒离心管，以充分重悬沉淀。随后使用两种筛网组合过滤所得的细胞裂解液，上层使用500目筛网去除较大的组织碎片，下层使用1000目筛网收集细胞核。选择合适孔径的筛网取决于植物细胞核的大小。在筛网背面使用无菌滤纸，以吸收部分裂解液和微小的细胞碎片。将含有细胞核的裂解液转移至新的1.5毫升离心管中，在4°C下以300 ×g离心4分钟，以收集细胞核。离心后，使用移液枪头尽可能吸除上清液。加入800 µL的细胞核洗涤缓冲液，轻轻颠倒离心管以重悬细胞核。将离心管在4摄氏度下以300 rcf离心4分钟。经过总共三次洗涤后，将所得的细胞核合并至一个新的1.5毫升离心管中，在4摄氏度下以300 rcf再次离心4分钟。使用移液器吸头尽可能吸除残留的缓冲液。下一步是抗体的孵育。取50微升的细胞核重悬于1毫升抗体缓冲液中，缓冲液中添加了EDTA、BSA、蛋白酶抑制剂混合物和皂苷。每个反应取150微升细胞核悬液置于新的1.5毫升离心管中，每管加入2微升抗体。本实验中，加入抗组蛋白H3赖氨酸4三甲基化抗体和免疫球蛋白G阴性对照抗体后，分别设置两个生物学重复。轻轻混匀溶液，将离心管置于4°C、12 rpm条件下，在水平摇床上过夜孵育进行杂交。次日早晨取出离心管，使用800 µL免疫沉淀洗涤缓冲液洗涤细胞核。轻轻颠倒试管以混匀，并在室温下以12 rpm置于水平摇床上5分钟。洗涤后，将试管在4℃下以300 rcf离心4分钟。离心后，使用移液器吸头弃去上清液。重复上述步骤，共洗涤三次。第三次洗涤后，将离心管在4°C、300 rcf条件下离心两分钟，并用移液枪头尽可能吸除残留的缓冲液。接下来配制Tn5转座酶反应混合物用于孵育。向每150 µL转座酶孵育缓冲液中加入1 µL转座酶。我们建议根据反应数量预先配制转座酶溶液混合物，然后向每根试管中加入150 µL等份溶液。将溶液轻轻混匀，并在室温下以12 rpm置于水平摇床上孵育2小时。每10至15分钟轻轻混匀一次试管。孵育结束后，使用800 µL免疫沉淀洗涤缓冲液在室温下洗涤细胞核三次，以去除未结合的Tn5转座酶。第三次洗涤后，将离心管在4 °C条件下以300 × g离心两分钟，并用移液器吸头吸除残留的缓冲液。进行标签化（tagmentation）步骤时，向反应管中加入300 µL标签化缓冲液。充分混匀溶液，并在37 °C孵育1小时。孵育后，加入10微升0.5摩尔/升EDTA和30微升10% SDS以终止反应。随后加入300微升DNA提取缓冲液。进行不规则DNA提取。将DNA片段溶解于25 µL无菌水中，其中24 µL用于NGS文库构建中的PCR扩增。该图显示了在显微镜下成像的DAPI染色完整细胞核；获得足量且相对纯净的完整细胞核是CUT&Tag实验的关键步骤。PCR 后，取 2 µL 进行转移，并在 1.5% 琼脂糖凝胶上检测 DNA 片段大小。该图显示，与免疫球蛋白基因阴性对照相比，组蛋白 H3 赖氨酸 4 三甲基化样品中的大部分 DNA 片段长度应在 280 至 500 个碱基对之间。DNA片段可经过纯化后通过高通量测序进行分析。该图展示了抗组蛋白H3赖氨酸4三甲基化抗体组与免疫球蛋白G阴性对照组的测序结果。该技术利用少量细胞，通过相较于ChIP-seq更为简化的流程，即可实现高分辨率、极低背景信号的DNA文库构建。CUT&Tag 是一种新方法，目前仍在不断完善中。

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科研

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Biology

生物学

在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰

本文介绍了一种用于检测特定植物基因组蛋白修饰的可靠且实用的方法。该方法结合了染色质免疫沉淀（ChIP）与实时定量PCR技术，能够检测在多种生理过程中发挥功能的特定基因上的组蛋白修饰。...

植物叶片中组蛋白修饰的检测

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

我们在此提供一种高效且可靠的免疫染色和荧光检测方案 在 原位 杂交，DNA染色后对整体样本进行定量高分辨率成像 拟南芥...

一种用于整体封片胚珠中染色质修饰与细胞核结构的高效定量单细胞分析方法 拟南芥

染色质免疫沉淀是一种用于鉴定拟南芥蛋白质DNA结合位点的强大技术...

染色质免疫沉淀实验用于鉴定拟南芥体内蛋白质-DNA 相互作用 In Vivo

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

本方案旨在从高粱叶片材料中有效提取完整组蛋白，用于分析组蛋白翻译后修饰，这些修饰可作为潜在的表观遗传标记，有助于培育抗旱作物。...

从高粱叶片组织中分离组蛋白用于潜在表观遗传标记的自上而下质谱分析

本文介绍了一种用于分析组蛋白修饰全基因组分布的实验方案，该方法可鉴定稻瘟病菌及其他丝状真菌致病过程中的新靶基因。...

使用染色质免疫沉淀测序方法对中国稻瘟菌Magnaporthe oryzae进行全基因组组蛋白修饰分布分析

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

对于表观遗传学领域的新手研究人员而言，CUT&amp;Tag 是比 ChIP 检测显著更简便的替代方法。CUT&amp;Tag 极大地推动了对稀有细胞和原代细胞群体的表观遗传学研究，仅需极少量细胞即可生成高质量数据。本方案描述了对从小鼠后肢肌肉中分离的小鼠成肌细胞进行 H3K4me1 CUT&amp;Tag...

利用靶点切割与标签化（CUT&Tag）技术在小鼠成肌细胞研究中的应用

本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。...

从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

学习使用CUT&Tag技术对植物进行表观基因组分析，通过分离完整细胞核和Tn5转座酶原位切割，实现H3K4me3组蛋白修饰的高通量测序。该方法为基因表达调控研究提供了高效工具。

利用靶向切割与标签化技术对植物中H3K4me3修饰进行分析

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