Name: 器官型切片培养作为原发性胰腺癌和转移瘤肿瘤微环境的临床前模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解器官型切片培养技术用于胰腺癌及转移瘤的体外药物反应测试。该方法保留肿瘤多细胞结构，为研究肿瘤微环境提供经济高效的临床前模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R. Braun 受吕贝克临床科学家学院（DFG #413535489）和吕贝克大学青年资助计划的支持。

在获得吕贝克大学当地伦理委员会批准后（批准编号：16-281），收集并处理了组织样本。
1. 新鲜组织的采集与处理
注意：所有未固定的 人体组织标本均应谨慎处理，以防止血液传播病原体感染的风险。所有患者在组织处理前均应检测为 HIV、HBV 和 HCV 阴性。操作时应穿戴防护服，并佩戴手套处理人体组织标本。
<ol>
	<li>手术后立即收集新鲜、未固定且未冷冻的胰腺导管腺癌（PDAC）组织样本，最小尺寸为 0.4 × 0.4 cm，并将样本置于组织保存液中运送至实验室。</li>
	<li>尽可能立即处理新鲜组织。</li>
	<li>或者，可将组织置于湿冰上的组织保存液中，在 4 °C 下过夜保存。然而，组织保存可能导致细胞活力下降，应尽量避免。</li>
</ol>
2. 准备
<ol>
	<li>低熔点琼脂糖制备
	<ol>
		<li>通过将 8 g 琼脂糖溶解于 100 mL 预热的林格氏液中，配制 100 mL 的 8% 低熔点琼脂糖溶液，并在 4 °C 保存至使用前。</li>
		<li>在宣布进行肿瘤切除后，使用微波炉熔化琼脂糖。</li>
		<li>将琼脂糖置于预热的水浴（37 °C）中，使其冷却至生理温度后再进行后续制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>振动切片机设置
	<ol>
		<li>将刀片装入振动切片机的刀架中，并根据制造商说明（如适用）进行自动角度调节。</li>
		<li>使用冷却装置或湿冰对切削室夹套进行降温。</li>
		<li>向切削室中加入约 100 mL 生理切割溶液（例如林格氏液）。</li>
		<li>将安装好的刀片放入预冷的切割溶液中，使刀片充分冷却。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织在低熔点琼脂糖中的包埋
<ol>
	<li>用预冷（4 °C）的 PBS 冲洗组织样本，并将组织置于 PBS 中，放入一个较大的培养皿（约 14 cm）中，置于冰上。</li>
	<li>在冰上使用解剖刀去除肉眼可见的多余结缔组织，因其可能影响切片效率。</li>
	<li>将组织放入一个小培养皿（约 3 cm）中。</li>
	<li>调整组织的方向，使残留的肉眼可见结缔组织与培养皿底部平面方向一致。培养皿底部的方向与切片平面方向相同。</li>
	<li>将预先准备好的低熔点琼脂糖倒入小培养皿中。</li>
	<li>如有需要，使用镊子重新调整组织的方向。</li>
	<li>将培养皿置于湿冰上，以加快琼脂糖的凝固。</li>
	<li>使用解剖刀小心地切割组织，确保组织每侧均保留至少 5 mm 的周围琼脂糖。</li>
	<li>小心转移包埋的组织，并使用瞬干胶将其粘附在样品托上。</li>
	<li>数秒后，将样品托放入切片室中。</li>
	<li>如有需要，调整组织相对于刀片的方向。</li>
</ol>
4. 使用振动切片机对琼脂糖包埋的组织进行切片
<ol>
	<li>根据组织样本的大小确定切片范围的外侧边界（y轴）。</li>
	<li>将刀片调整至组织块的顶部。</li>
	<li>设置切片速度为0.04 mm/s，切削振幅为1 mm，切片厚度为300 µm。</li>
	<li>小心地切下最初的切片，并将切片转移至装有预冷（4 °C）切片液的独立容器中，容器置于湿冰上。</li>
</ol>
5. 器官型脑片培养物的培养
<ol>
	<li>在6孔板中每孔加入1 mL适当的培养基。
	<ol>
		<li>培养基A：Advanced DMEM/F12，10% FBS，1%青霉素/链霉素。</li>
		<li>培养基B：RPMI 1640，10% FBS，1%青霉素/链霉素，4 µg/mL胰岛素，8 ng/mL EGF，0.3 µg/mL氢化可的松。 
		注意：最佳培养条件所用的培养基可能因组织类型和患者个体而异。本研究比较了两种不同的组织培养基，一种基于DMEM/F12（培养基A），另一种基于RPMI（培养基B）。这两种培养基之间未观察到显著差异。本方案中所示的所有实验均使用培养基A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含培养基的6孔板放入培养箱中，使温度和pH值在开始培养前达到平衡。</li>
	<li>使用纱布滤膜将组织切片转移至细胞培养插入式小室（例如，孔径为0.4 µm的亲水性PTFE插入小室）上。</li>
	<li>将载有切片的滤膜置于无菌布上，以去除多余的切割液。</li>
	<li>将载有切片的滤膜放入已准备好的6孔板中。切勿向插入式小室内额外添加培养基。</li>
	<li>将6孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO2）。</li>
	<li>每隔2天更换一次培养基，方法是使用新的6孔板重复步骤5.1、5.2和5.5。 
	&#8203;注意：类器官切片培养的持续时间可根据具体研究问题而定。</li>
</ol>
6. 刃天青细胞活力检测
注意：刃天青活力检测法通过检测活细胞将无荧光的蓝色刃天青还原为红色荧光的试卤灵的程度，来评估类器官切片培养物的总体代谢活性15。该检测对细胞无毒性，可根据具体研究问题对同一批培养物进行多次重复检测。每2-3天使用刃天青检测法测定一次活力。
<ol>
	<li>刃天青储备液的制备
	<ol>
		<li>关闭超净工作台的照明灯，因为刃天青储备液对光敏感。</li>
		<li>用1×PBS配制浓度为10 mg/mL的刃天青钠盐储备液。</li>
		<li>将储备液分装后避光保存于4 °C冰箱中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片整体活力的评估
	<ol>
		<li>关闭超净工作台的照明灯，因为刃天青储备液对光敏感。</li>
		<li>用适当的培养基将刃天青储备液稀释1:250。 
		注：稀释所用的培养基应与培养过程中使用的培养基相同（培养基A或培养基B）。</li>
		<li>每片组织切片准备1 mL最终的刃天青溶液，并额外增加1 mL用于空白对照；例如，对于6片组织切片，将28 µL刃天青储备液加入7 mL培养基中进行稀释。</li>
		<li>在6孔板中每孔加入1 mL稀释后的刃天青溶液。</li>
		<li>将带有组织切片的培养滤膜转移至含有刃天青溶液的孔中。其中一个含有刃天青溶液的孔保持为空白对照。 
		注：为简化实验流程，此步骤可与更换培养基（步骤5.7）同时进行。然而，若需进行额外的活力检测，该检测可在组织切片培养过程中的任意时间点进行。</li>
		<li>将组织切片置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。</li>
		<li>若需继续培养组织切片，预先准备含培养基的新6孔板（见步骤5.1和5.2）。</li>
		<li>将带有组织切片的培养滤膜从刃天青溶液中取出，并将其放置于无菌纱布上以去除多余液体。</li>
		<li>将带有组织切片的培养滤膜转移至预先准备好的培养板中。</li>
		<li>从每个6孔中取出100 µL刃天青溶液，转移至96孔板中。从空白对照中取三份样品（3 × 100 µL），分别加入96孔板的不同孔中。</li>
		<li>根据仪器制造商的说明，使用酶标仪测定吸光度。激发波长设为545 nm，发射波长设为600 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. OTSCs 的福尔马林固定与石蜡包埋
<ol>
	<li>小心将培养的组织切片转移至塑料包埋盒中。操作步骤如下：
	<ol>
		<li>将带有固定切片的培养滤膜置于培养皿中。</li>
		<li>使用解剖刀仔细将带有固定组织切片的滤膜切割下来。</li>
		<li>小心地将带有固定切片的滤膜转移至尼龙活检袋中，并放入包埋盒内。</li>
		<li>随后将塑料包埋盒放入盛有预冷（4 °C）4.5% 甲醛溶液的容器中。切片可在 4 °C 的甲醛溶液中保存至后续使用，但应至少固定 24 小时。 
		注意：OTSCs 极易撕裂，转移时需格外小心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用流动的自来水小心冲洗经甲醛固定的切片培养物 1.5 小时。</li>
	<li>通过以下步骤对甲醛固定的组织切片进行脱水：70% 乙醇中孵育（2 次，每次 3 小时），95% 乙醇中孵育（1 次过夜，1 次 3 小时），最后在无水乙醇中孵育（1 次 3 小时，1 次过夜）。</li>
	<li>用二甲苯在 3 小时内分两次孵育，以透明化甲醛固定的组织切片。</li>
	<li>将组织在 60 °C 的石蜡中浸渍（1 次过夜，1 次 2 小时）。将组织置于组织包埋模具中，包埋于石蜡块内。</li>
	<li>使用切片机将石蜡包埋的组织块切成 4 µm 厚的切片，并漂浮于含蒸馏水的 40 °C 水浴中。随后将切片转移至载玻片上。</li>
	<li>将石蜡切片在 60 °C 孵育 1 小时，以使组织牢固附着于载玻片。再将载玻片在 37 °C 孵育过夜。</li>
</ol>
8. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将步骤7.7的切片放入二甲苯中孵育（3次，每次5分钟）以脱蜡。</li>
	<li>依次放入无水乙醇（2次，每次5分钟）、95%乙醇（2次，每次5分钟）和70%乙醇（1次，5分钟）中孵育以再水化。用蒸馏水短暂冲洗。</li>
	<li>用Mayer苏木精溶液染色5分钟。用流动的自来水冲洗10分钟。</li>
	<li>用0.5%伊红溶液复染40秒。用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>依次放入70%乙醇（最多1分钟）、95%乙醇（2次，每次3分钟）和无水乙醇（2次，每次3分钟）中孵育以脱水。</li>
	<li>在三份二甲苯中各透明数秒。滴加一滴封片剂，盖上盖玻片封片。</li>
</ol>
9. OTSCs的免疫组织化学
<ol>
	<li>将切片在二甲苯中孵育 2 次，每次 10 分钟进行脱蜡，随后在 1:1 乙醇/二甲苯溶液中孵育 10 分钟。</li>
	<li>将载玻片转移至 100% 乙醇（2 次，每次 3 分钟）、96% 乙醇（2 次，每次 3 分钟）、70% 乙醇（1 次，3 分钟），然后转移至 50% 乙醇（1 次，3 分钟）。</li>
	<li>进行抗原修复以暴露抗原表位。将载玻片置于柠檬酸盐缓冲液中，在微波炉中以 900 W 加热 5 分钟，随后以 600 W 加热 2 次，每次 8 分钟。让载玻片在室温下冷却 20 分钟。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>在湿盒中，用含 0.1% Triton X-100 的 PBS（每张载玻片 200 µL）于室温孵育 10 分钟，以通透细胞膜。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>在湿盒中，用甲醇配制的 3% H2O2 溶液（每张载玻片 200 µL）于室温孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>加入 200 µL 封闭缓冲液（PBS 中含 1:50 马血清），在湿盒中于室温孵育 25 分钟。</li>
	<li>将载玻片倾斜置于吸水纸上，去除封闭缓冲液。</li>
	<li>在载玻片上加入 200 µL 用抗体稀释液适当稀释的一抗（每张载玻片 200 µL），在湿盒中于 4 °C 孵育过夜。作为阴性对照，使用与一抗相同稀释度的适当同型小鼠免疫球蛋白。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>在载玻片上加入 200 µL 生物素标记的二抗（PBS 中 1:50 溶液），在湿盒中于室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，在使用前配制亲和素/生物素-过氧化物酶复合物。在载玻片上加入 200 µL 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，在湿盒中于室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>在每张载玻片上加入 200 µL DAB 底物溶液（使用前新鲜配制：1 mL 底物中加入 1 滴 DAB），显色 1–3 分钟，直至达到所需颜色强度。</li>
	<li>用流动自来水冲洗 10 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入苏木精中 5 分钟进行复染。</li>
	<li>用流动自来水冲洗 10 分钟。</li>
	<li>使用水性封片剂和盖玻片封片。封片后的载玻片可长期在室温下保存。</li>
</ol>

<ol><li>Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+state-of-the-art+treatments+to+novel+therapies+for+advanced-stage+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Waghray, M., Yalamanchili, M., di Magliano, M. P., Simeone, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+stroma+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of stroma in pancreatic cancer.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 29 (5), 537-543 (2013).</li>
<li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Hessmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+drug+scavenging+increases+intratumoural+gemcitabine+accumulation+in+murine+pancreas+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fibroblast drug scavenging increases intratumoural gemcitabine accumulation in murine pancreas cancer.</a> Gut. 67 (3), 497-507 (2018).</li>
<li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+cancer+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li>
<li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li>
<li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Science Reports. 9 (1), 2133(2019).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).</li>
<li>Beutler, B., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis%2C+cachexia%2C+shock%2C+and+inflammation%3A+a+common+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemisty%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator.</a> Annual Review of Biochemisty. 57, 505-518 (1988).</li>
</ol>

作者声明不存在潜在的利益冲突。

新鲜肿瘤样本的离体肿瘤组织切片（OTSCs）是肿瘤的近似模型 原位它们在培养期间于特定的、依赖组织的时间段内保持其基础形态、增殖活性及微环境11,12,13该技术能够将治疗手段直接应用于具有活性的人类肿瘤组织 离体 以及后续的下游分析，例如转录组和蛋白质组分析。OTSCs 的一个特定优势在于，可对完整的多细胞肿瘤组织进行具有空间分辨能力的下游分析，例如 MALDI 成像。
本文介绍了一种用于生成、培养及进行组织病理学评估胰腺导管腺癌（PDAC）及其转移灶的离体组织切片培养物（OTSC）的方法。该技术的关键在于对新鲜组织进行切割，避免任何冷冻处理，并在气液界面条件下进行培养。本方法的一个局限性在于，无法在培养前对新鲜、未固定且未冷冻的组织进行肿瘤细胞含量的评估。正如我们在结果中所示，OTSC可能包含与同一肿瘤其他标本快速切片所预期不同的组织成分。因此，培养后对OT...

目前，胰腺导管腺癌（PDAC）及其相应转移灶的临床前模型在预测患者治疗反应方面效果不佳，这是药物开发和预测性生物标志物鉴定中的一个主要缺陷1。尽管患者来源类器官和患者来源异种移植模型具有一定的前景，但其应用仍受限2。这些体外（in vitro）模型的主要局限性在于缺乏肿瘤微环境，以及需在非人类免疫缺陷物种中进行异种移植。近年来，特别是在PDAC及其转移灶中，肿瘤微环境因其在肿瘤生物学中的关键作用而受到越来越多的关注。肿瘤微环境包含细胞成分和非细胞成分，例如（肌）成纤维细胞、胰腺星状细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质、细胞因子和生长因子3。该微环境并非无功能的肿瘤附属成分，而是可促进肿瘤进展和转移，并似乎在放疗和化疗耐药中发挥重要作用4。PDAC的微环境不仅在机械上阻碍药物递送，还具有免疫调节和药物清除活性5,6,7。因此，迫切需要能够反映肿瘤细胞与肿瘤微环境之间复杂相互作用的临床前模型，以在体外（ex vivo）准确评估患者的治疗反应，并指导个体化临床治疗。
ex vivo 培养的新鲜肿瘤样本能够高度接近肿瘤在体内的真实状态。原位组织切片培养（OTSCs）近年来已被开发并用于多种肿瘤的研究，包括头颈部、乳腺、前列腺、肺、结肠及胰腺肿瘤8,9,10,11,12。研究表明，OTSCs 在培养期间可在一定时间内（依组织类型而定）维持其基础形态、增殖活性以及肿瘤微环境11,12,13。多项体外研究显示，胰腺导管腺癌（PDAC）的 OTSCs 在培养 4 至 9 天内仍可保持细胞活力、组织形态以及肿瘤微环境的大部分组分5,12,14。从应用前景来看，该技术可实现将治疗手段直接应用于具有活性的人体肿瘤组织ex vivo，并进行后续的下游分析，例如转录组和蛋白质组学分析。
OTSCs 的建立为术后立即进行 ex vivo 治疗反应测试提供了独特的机会。因此，OTSCs 将有望用于识别治疗策略，以实现转移性疾病治疗的个体化。本方案描述了胰腺癌有活性的 OTSCs 的生成与培养过程。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F-12培养基</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Roth</td><td>6351.2</td><td>8% 的林格氏液</td></tr><tr><td>抗体稀释液，降低背景</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>AquaTex</td><td>默克</td><td>108562</td><td></td></tr><tr><td>生物乙醇（99%，变性）</td><td>CHEMSolute</td><td>2,21,19,010</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>裂解型 Caspase-3（Asp175）(5A1E) 兔单克隆抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9664</td><td>1:400 稀释度</td></tr><tr><td>Derby 加强型双刃安全剃须刀片</td><td>德比·托凯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>Roth</td><td>H579.1</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 伊红Y水溶液</td><td>默克</td><td>10,98,44,100</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt快速硬化封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>4.5% 甲醛溶液，缓冲液</td><td>B&amp;uuml;化学品</td><td>B211101000</td><td></td></tr><tr><td>迈耶氏明矾硫酸铝溶液</td><td>Roth</td><td>T865</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-794</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma Aldrich（默克）</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢 30%</td><td>默克</td><td>1,08,59,71,000</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素人</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>液态DAB+底物显色系统</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr><tr><td>MACS 组织储存液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>默克</td><td>10.600.092.500</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 细胞培养小室，30 mm，亲水性聚四氟乙烯，0.4 µm &amp;micro;m</td><td>默克密理博（Millipore, Merck）</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗人&amp;nbsp; 细胞角蛋白 7（克隆株 OV-TL 12/30）</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗人Ki67克隆MIB-1</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗波形蛋白抗体（克隆 V9）</td><td>Dako</td><td>M0725</td><td>1:200 稀释度</td></tr><tr><td>阴性对照小鼠IgG2a</td><td>Dako</td><td>X0943</td><td>1:200 稀释度</td></tr><tr><td>阴性对照小鼠IgG1</td><td>Dako</td><td>X093101-2</td><td>1:200 稀释度</td></tr><tr><td>石蜡（熔点 56&amp;deg;- 58&amp;deg;)</td><td>默克</td><td>10,73,37,100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1×)，流式细胞术级别</td><td>Gibco</td><td>A12860301</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐；PBS 中 10 mg/ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7017</td><td>1:250 稀释度</td></tr><tr><td>林格氏液</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2610813</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640培养基</td><td>Sigma Aldrich（默克）</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>组织培养测试板 6</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC-过氧化物酶试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯（特纯）</td><td>J.T.Baker</td><td>8,11,85,000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ClarioStar 微孔板读板机</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋中心 E61110</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转式切片机 Microm HM355S</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微米级切片转移系统 Microm STS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT 1200S 振动切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

作为原发性胰腺癌及转移癌肿瘤微环境临床前模型的器官型脑片培养

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

迫切需要建立能够真实模拟原发性胰腺癌及其转移的临床前模型，以评估治疗反应 离体 并促进个体化患者治疗。然而，目前常用模型（如患者来源的细胞系和异种移植模型）缺乏肿瘤特异性的微环境，因此仅能提供有限的预测性信息。器官型组织切片培养（OTSCs）包含完整的多细胞组织，可快速用于空间分辨的药物反应检测。
本方案描述了胰腺癌及其转移灶的活性肿瘤组织切片的制备与培养方法。简言之，将组织包埋于低熔点琼脂糖中，并在低温等渗缓冲液中保存。随后，使用振动切片机切割出厚度为300 µm的组织切片。制备完成后，将切片置于气液界面，利用细胞培养小室及适当的培养基进行培养。在培养过程中，可监测细胞分化状态和活性的变化。此外，该技术可在体外（ex vivo）对活性的人类肿瘤组织施加处理，并进行后续下游分析，如转录组和蛋白质组谱型分析。
OTSCs 为测试个体治疗反应提供了独特的机会 离体 并鉴定与肿瘤不同区域特异性反应相关的独立转录组学和蛋白质组学特征。OTSCs 可进一步用于探索治疗策略，以实现胰腺癌原发灶及转移灶的个体化治疗。

图1 展示了从新鲜未冻存的肿瘤组织中培养OTSC的工作流程概览。原发性PDAC及转移灶标本在手术切除后立即采集，并在4 °C条件下用湿冰保存过夜，置于组织保存液中。随后对标本进行处理，并按照本方案所述方法将组织切片进行培养。在培养过程中，每个OTSC的宏观形态未发生明显变化。然而，OTSC表面积的大小随时间推移逐渐减小，如图2A所示，在为期6天的培养过程中具有代表性地呈现此趋势。OTSC的整体活力通过刃天青（resazurin）活力检测在第0、2/3和第6天进行评估（图2B）。刃天青活力检测基于活细胞将无荧光蓝色的刃天青还原为红色荧光产物刃天青素（resorufin）的能力，从而反映OTSC的整体代谢活性15。图2B展示了两种不同培养基中培养的两个代表性原发肿瘤来源OTSC的活力检测结果比较。OTSC分别在培养基A（高级DMEM/F12，10% FBS，...

本方案描述了器官型脑片培养物（OTSCs）的制备方法。该技术有助于 离体 完整多细胞组织的培养。OTSCs 可立即用于在多细胞环境中检测其对药物的相应反应。

迫切需要建立更贴近实际的原发性胰腺癌及转移癌的临床前模型，以体外检测治疗反应并促进……

已从多种组织制备出器官型组织切片。由于组织完整性得以保留以及培养技术的发展，这些切片已适用于模拟复杂的生理机制。胰腺癌的器官型切片培养物能够在体外准确再现肿瘤的多细胞结构及其微环境。它们可用于多种下游应用，例如药物反应测试。在肿瘤手术切除后可立即进行培养，与其他大多数原代培养技术相比，成本较低且耗时更少。本次实验操作将由德国吕贝克大学的技术助理 Olha Lapshyna 演示。首先，通过将八克低熔点琼脂糖溶解于100毫升预热的林格氏液中，制备100毫升8%的低熔点琼脂糖溶液，并在4°C下保存备用。在宣布进行肿瘤切除后，将琼脂糖在微波炉中融化，随后置于预热的水浴中，使其冷却至生理温度后再进行后续制备。将刀片放入振动切片机的刀架中，并根据制造商的说明进行自动角度调节。使用冷却装置或湿冰对切片室的夹套进行降温。向切片室中加入约100毫升任氏液，然后将安装好的刀片放入预冷的切片液中，使刀片冷却。用预冷的PBS冲洗组织样本，并将其置于冰上的大型14厘米培养皿中。在冰上使用解剖刀去除肉眼可见的多余结缔组织。将组织放入小型培养皿中。调整组织的方向，使残留的肉眼可见的结缔组织与培养皿底部平面的方向一致。将制备好的低熔点琼脂糖倒入小培养皿中，并重新调整组织的方向。如有需要，可使用镊子操作，然后将培养皿置于湿冰上，以加快琼脂糖的凝固。使用手术刀小心地切割组织，确保组织每侧至少保留五毫米的周围琼脂糖。将胶水涂抹在样品托上并摊开，然后将包埋的组织转移至样品托，并用超级胶水将其固定。数秒钟后，将样品托放入切片室，必要时调整组织相对于剃刀刀片的方向。根据组织样本的大小确定切割范围的外缘界限。将刀片调整至组织块的顶部。设置切割速度为 0.04 毫米每秒，切割振幅为 1 毫米，切片厚度为 300 微米。小心地切下最初的切片，并将切片转移至另一个装有预冷林格液并置于湿冰上的容器中。准备六孔板，每孔加入一毫升适当的培养基。将含有培养基的六孔板放入培养箱中，使温度和pH在培养前达到平衡。使用尼龙网滤器将组织切片放置于细胞培养插件上，然后将载有切片的滤器置于无菌纱布上，以去除多余的林格溶液。将载有切片的滤器放入已准备好的六孔板中，插件内不添加任何额外培养基，随后将六孔板置于培养箱中，每两天更换一次培养基。将带有固定切片的培养滤器放置于培养皿中。使用手术刀小心地将带有组织切片的滤膜切割下来。将带有切片的滤膜转移至尼龙活检袋中，并放入包埋盒内。随后，将塑料包埋盒置于含有预冷的4.5%甲醛的容器中，固定至少24小时，或暂存于该条件下以备后续使用。将福尔马林固定的切片培养物用流动的自来水小心冲洗 1.5 小时。将福尔马林固定的组织切片依次在 70%、95% 和无水乙醇中孵育进行脱水。然后，将福尔马林固定的组织切片在二甲苯中分两次孵育，每次三小时，进行透明处理。将组织在60摄氏度下浸入石蜡中过夜，随后再浸入两小时。将组织置于组织包埋模具中的石蜡块内，并放置于冰上以加快样品冷却。使用切片机对石蜡包埋的组织块进行切片，厚度为四微米，并置于40摄氏度、含有蒸馏水的水浴中。将切片转移至载玻片上。将石蜡切片在60摄氏度下孵育1小时，以使组织牢固附着于载玻片。随后，将载玻片在37摄氏度下孵育过夜。将切片置于二甲苯中孵育，每次5分钟，重复三次以脱蜡。随后依次在无水乙醇、95%乙醇和70%乙醇中孵育，进行逐级水化。将切片置于 Mayer 苏木精溶液中染色5分钟，然后用流水冲洗10分钟。用0.5% ESN溶液复染40秒，蒸馏水冲洗，然后重复乙醇脱水步骤。用三次更换的二甲苯对组织进行透明处理，每次数秒，然后滴加一滴封片剂，并用盖玻片覆盖载玻片。每个OTSC在培养六天期间宏观形态逐渐减小。两种不同培养基中来自两个代表性原发性肿瘤的组织碎片（OTSCs）的存活率显示，在培养第零天后，由于切片操作及对培养条件的适应，存活率有所下降，而在右侧面板中的肿瘤样本存活率则有所上升。H&E染色切片显示，整个离体培养期间组织的整体结构得以保持，在为期六天的培养过程中未发现增殖和凋亡的明显变化。对H&E切片进行显微镜下组织病理学评估，未发现所有培养组织在培养期间出现明显的坏死增加。在将原发性胰管腺癌（PDAC）培养15天后，cleaved Caspase-3阳性细胞数量增加。PDAC腹膜转移灶的组织病理学显示，不同切片间存在高度的瘤内异质性，同时通过cleaved Caspase-3染色检测到自然发生的细胞凋亡。对腹壁PDAC转移灶进行H&E染色及细胞角蛋白7（Cytokeratin 7）的免疫组织化学表征表明，所获得的OTSCs不含任何肿瘤细胞，仅由结缔组织构成，且部分组织呈坏死状态。每个培养的组织切片均可根据具体的研究问题进行单独分析，例如通过RNA测序进行转录组学分析，或通过温和成像技术进行空间分辨的蛋白质组学分析。未来，结合非破坏性分析方法在预测患者对不同治疗方案的个体化反应方面具有巨大潜力。

organotypic-slice-cultures-as-preclinical-models-tumor

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

器官型切片培养作为原发性胰腺癌和转移瘤肿瘤微环境的临床前模型

本视频展示了三维共培养系统的建立过程。将小鼠脑切片置于膜上，接种荧光标记的人脑肿瘤细胞并使其在其上生长。待系统准备就绪后，对其进行染色以进行成像。...

在器官型脑片共培养模型中建立脑肿瘤

通过将脑组织切片与癌细胞进行器官型共培养，可以在癌细胞侵袭脑组织的过程中，利用荧光显微镜以及明场（视频）显微镜观察其形态学变化。该模型系统还支持细胞交换与补充操作，并可进行多种实验干预和分析。...

具有类器官脑切片与癌细胞三维球体的共培养系统

关键词：共培养系统，类器官脑切片，癌细胞，三维球体，肿瘤微环境，脑转移，体外模型

多种人类脑肿瘤局限于脑内的特定区域，且难以在培养条件下生长。本方案旨在研究肿瘤微环境的作用，并通过分析在小鼠脑组织切片中生长的荧光标记原代脑肿瘤细胞，探索新的药物治疗方法。...

一种用于研究肿瘤微环境及靶向药物治疗的脑肿瘤/器官型脑片共培养体系

人胶质母细胞瘤类器官切片培养模型用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物的个体化效应

器官型海马切片培养（OHSC）是一种 体外 模拟的模型 体内...

用于研究肿瘤细胞神经保护作用及侵袭性的海马组织切片器官型培养模型

我们提供了一种用于生成、培养及系统分析源自小鼠肺癌肿瘤的器官型组织切片的方法。同时介绍了如何优化切片厚度，以及如何选择药物浓度以处理肿瘤切片。...

建立和分析肿瘤组织切片外植体作为诊断检测的先决条件

我们介绍一种用于测量类器官肿瘤组织切片中实时药物反应的方案。此处概述的实验策略提供了一个平台，可在体外条件下对来自临床或小鼠肿瘤的组织切片进行中高通量药物筛选。...

在原代肿瘤组织切片中实时测量药物反应

我们介绍了一种在器官型脑切片模型中实时测量乳腺癌脑转移细胞对药物和辐射反应的实验方案。该方法提供了一种定量分析手段，可在脑微环境界面中以离体（ex...

一个 离体 脑切片模型用于研究和靶向乳腺癌脑转移肿瘤生长

我们描述了一种用于培养、维持及可视化已转移至腹膜表面的人类癌症组织的实验方案。切除的肿瘤标本使用振动切片机进行切割，并在可渗透性插入式培养装置中进行培养，以增强氧气供应并提高细胞存活率，随后通过共聚焦显微镜和流式细胞术进行成像及后续分析。...

培养与成像 离体 从切除的人类肿瘤标本制备类器官型腹膜假黏液瘤组织切片

肿瘤类器官已彻底改变了癌症研究及个体化医疗的方法。它们代表了一种具有临床相关性的肿瘤模型，使研究人员能够在临床治疗中领先于肿瘤的发展。本方案建立了源自新鲜胰腺肿瘤组织样本及胰腺腺癌患者来源异种移植瘤的肿瘤类器官。...

从新鲜组织建立胰腺癌来源的肿瘤类器官和成纤维细胞

胰腺癌仍然是最难治疗的癌症之一。因此，用于评估治疗效果的临床前模型必须具有可重复性和临床相关性，这一点至关重要。本方案描述了一种简单的共培养方法，用于生成可重复且具有临床相关性的纤维化球状体。...

从共培养中生长三维促结缔组织增生性胰腺癌球体

了解器官型切片培养技术用于胰腺癌及转移瘤的体外药物反应测试。该方法保留肿瘤多细胞结构，为研究肿瘤微环境提供经济高效的临床前模型。

作为原发性胰腺癌及转移癌肿瘤微环境临床前模型的器官型脑片培养

探索更多视频