Name: 通过真空辅助吸附剂提取从人类相关样品中捕获活性产生的微生物挥发性有机化合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学习使用真空辅助吸附剂提取结合稳定同位素示踪和GC-MS分析技术，从人类粪便、唾液、痰液等样品中捕获微生物产生的挥发性有机化合物，实现代谢生物标志物发现。

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感谢Heather Maughan和Linda M. Kalikin对本文手稿的细致编辑。本研究由美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NIH NHLBI）资助（项目编号：5R01HL136647-04）。

1. 顶空固相萃取笔（HSP）及样品分析注意事项
注意：选择含有Tenax TA吸附剂的HSP，以捕获广泛范围的挥发性物质。与其他吸附剂相比，Tenax对水的亲和力较低，因此能够从含水量较高的样品中捕获更多的挥发性有机化合物（VOCs）。Tenax的杂质含量也较低，并可进行活化处理以便重复使用。吸附剂的选择还考虑了气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）中所安装的色谱柱（参见材料表）。
<ol>
	<li>通过使用与样品提取相同的条件提取培养基和/或样品空白，生成阴性对照。</li>
	<li>在分析提取样品之前，先在气相色谱-质谱仪（GC-MS）上分析一个空白HSP（此前已确认洁净且无显著背景干扰）。在不同类型样品之间运行空白样品（例如，三份细菌单培养重复样品、空白、三份细菌共培养重复样品、空白等）。</li>
	<li>在样品提取和分析前，避免使用有香味的个人护理用品或食用气味强烈的食物。理想情况下，应在至少30分钟内未使用酒精或其他挥发性清洁剂清洗的生物安全柜中制备样品。在样品制备前，提前开启生物安全柜气流30至60分钟。</li>
	<li>在样品制备过程中将样品保持在冰上，以减少挥发性物质的释放。</li>
</ol>
2. 单一培养与共培养的制备
<ol>
	<li>在生物安全柜中，接种培养物 鲍曼不动杆菌，金黄色葡萄球菌 和 P. aeruginosa 在Todd Hewitt生长培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>过夜培养后，在生物安全柜中进行培养物操作。将每份培养物稀释至500 nm处的光密度为0.05。</li>
	<li>将共培养物等量混合，用移液器将200 µL对照培养基、单培养或共培养液加入96孔板的每个孔中，置于37 °C培养箱中培养24 h。另准备一块板用于48 h培养。</li>
	<li>孵育期结束后，按第4节中的步骤准备样品以进行提取。将液体培养物用移液器转移至微量离心管中，并于-80 °C保存。 
	注意：此时样品可根据需要在 -80 °C 保存，以备后续提取。</li>
</ol>
3. 生物样品制备中的稳定同位素示踪
注意：粪便和唾液样本来自匿名捐赠者，已获得加州大学欧文分校机构审查委员会（HS# 2017-3867）的批准。污水样本来自美国加州圣地亚哥。痰液样本来自囊性纤维化患者，采集工作是经密歇根大学医学院机构审查委员会批准的一项更大规模研究（HUM00037056）的一部分。
<ol>
	<li>所有生物样本的制备均应在生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>制备粪便样本时，在1.5 mL微量离心管中向100 mg粪便加入1 mL去离子水，涡旋振荡3分钟。不使用时置于冰上。
		<ol>
			<li>向15 µL粪便与水的混合物中加入485 µL含20 mM 13C葡萄糖的脑心浸出液（BHI）培养基，或含30%氘代水（D2O）的BHI培养基，确保样本终体积为500 µL。每个样本设置三个技术重复。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备污水样本时，将500 µL污水加入500 µL含20 mM 13C葡萄糖的BHI培养基，或含30% D2O的BHI培养基中，总体积为1 mL。每个样本设置三个重复。不使用时置于冰上。</li>
		<li>制备唾液样本时，将50 µL唾液加入500 µL含20 mM 13C葡萄糖的BHI培养基，或含30% D2O的BHI培养基中，总体积为550 µL。每个样本设置三个重复。不使用时置于冰上。</li>
		<li>为比较培养前后样本中挥发性物质的变化，制备痰液样本时先进行首次提取：取15 µL痰液进行提取。每个样本设置三个重复。不使用时置于冰上。随后进入第4节进行样本提取，并在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育18小时。</li>
		<li>未培养痰液样本完成首次提取后，保留含有痰液的样品瓶。向3.5.1步骤中留下的含痰液样品瓶中加入500 µL含20 mM 13C葡萄糖的BHI培养基。不使用时置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进入第4节进行样本提取。</li>
</ol>
4. 样品提取
<ol>
	<li>将空的挥发性有机物分析（VOA）小瓶（20 mL）放置在冷板上，并将冷板置于生物安全柜内的冰上。</li>
	<li>打开5600型吸附剂笔提取单元（SPEU），并根据各方法要求调节至所需温度。 
	注意：在37 °C下进行稳定同位素探针实验时，达到设定温度可能需要长达15分钟；在70 °C下进行单培养和共培养实验时，达到设定温度可能需要长达60分钟。</li>
	<li>准备与样品数量相等的洁净HSP，包括用于培养基或样品对照的HSP。</li>
	<li>根据样品、重复组及HSP编号标记20 mL VOA小瓶。使用防水记号笔，以防小瓶置于冰上时外壁凝结水汽导致标签模糊。</li>
	<li>在生物安全柜内，拧开小瓶的白色瓶盖，迅速用移液器将样品加入小瓶，然后安装黑色瓶盖、瓶垫和HSP。 
	注意：样品不应与HSP接触，样品体积取决于样品类型。</li>
	<li>将含有样品和HSP的小瓶放回冷板上。</li>
	<li>对每个样品重复步骤4.5和4.6。应逐个完成这些步骤，而非一次性处理所有样品，以防止样品升温导致挥发性物质提前释放。</li>
	<li>所有样品装入玻璃小瓶后，在生物安全柜外的实验台上进行以下操作：启动真空泵，将小瓶抽真空至30 mmHg，然后移除真空源。 
	注意：完成抽真空后，小瓶无需继续放置在冷板上。</li>
	<li>使用压力表检查所有样品抽真空后的压力。若发现小瓶漏气，请确保瓶盖已拧紧，并确认HSP和瓶垫的白色O型圈已正确就位。 
	注意：密封不严可能导致与真空小瓶相比，挥发性物质检出量降低。</li>
	<li>将小瓶放入SPEU中，在优化的温度和时间条件下以200 rpm振荡进行提取。培养样品在70 °C下提取1小时；粪便、污水、唾液和痰液样品的稳定同位素探针实验在37 °C下提取18小时。</li>
	<li>将冷板预冷至-80 °C，待提取完成后使用。</li>
	<li>提取完成后，将样品置于冷板上15分钟，以从HSP和小瓶顶空中抽出水蒸气。</li>
	<li>将HSP转移至其保护套管中。 
	&#8203;注意：实验可在此处暂停，HSP在室温下最多可存放约1周，之后高挥发性化合物可能开始损失。</li>
</ol>
5. 在气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）上分析样品
<ol>
	<li>使用以下气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）（参见材料表）设置：35 °C 保持 5 分钟，以 10 °C/min 升温至 170 °C，再以 15 °C/min 升温至 230 °C，分流比为 20:1，总运行时间为 38 分钟。</li>
	<li>设定热脱附方法如下：2 分钟，70 °C 预加热；2 分钟，260 °C 脱附；34 分钟，260 °C 烘焙；以及 2 分钟，70 °C 后烘焙。</li>
	<li>根据仪器设置样品序列并开始运行。
	<ol>
		<li>在 Entech 软件中设置序列时，打开程序。在仪器下拉菜单右侧的选项中，选择 5800 | 序列。</li>
		<li>观察 Entech 软件中的序列表格，其结构应与 GC-MS 软件中的类似。将样品 ID列命名为当前日期_小瓶编号。请注意，名称对应于 GC-MS 序列表中的名称，而5800 方法决定升温速率、保持时间等参数（点击后将弹出菜单，用于选择步骤 5.2 中创建的方法）。</li>
		<li>请注意，托盘和位置列决定了样品制备轨道（SPR）前往拾取 HSP 的位置。
		<ol>
			<li>观察紧靠左侧的两个托盘，每个托盘有 30 个位置，排列为六列，每列五个位置。&#160;最左侧且离操作者最近（前面）的位置为 1 号，最右侧且最远的位置为 30 号。</li>
			<li>这两个托盘分别为HSP A 或 B，其中 HSP B 是靠近 SPR 的托盘（内侧托盘），HSP B 正后方为 HSP 空白样。将提取后的样品放入相应托盘，并在序列中正确选择对应位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>保存序列表格，点击左侧的运行，如果空白 HSP 已置于脱附管中（以黄色标签标记的 HSP 表示），则选择从脱附管中的空白样开始运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>请注意，在序列中的每个样品将由 SPR 自动处理。等待 SPR 预热完成后，屏幕顶部将出现提示，确认空白样是否已放入脱附管中。点击跳过以确认探针已就位。允许 SPR 自动运行所有样品，GC-MS 端的序列将自动将数据记录为独立的文件。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>使用GC-MS软件对数据进行质量过滤（材料表).
	<ol>
		<li>检查色谱图上的每个峰，并标注与美国国家标准与技术研究院匹配的峰 &amp;#38; 技术（NIST）库（或其他可用库）。</li>
		<li>在处理方法中添加带有注释的色谱峰。设置峰选择标准，仅包含概率大于75%的化合物，并确保化合物各鉴定离子的对齐位置位于峰中心。
		<ol>
			<li>要向处理方法中添加峰，请选择 校准 | 编辑化合物 | 名称 | 插入化合物 在……下方 外标化合物添加化合物名称、保留时间、定量信号 目标离子. 添加三个最大的峰。保存时，请选择 确定 | 方法 | 保存.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置好处理方法后，继续进行 定量 | 计算，以及 查看 | QEdit 定量结果.</li>
		<li>检查每种化合物，确保其峰与预期的保留时间一致，且高于背景噪声。</li>
		<li>完成 QEdit 后，选择 退出 | 是 保存 QEdits 并返回主色谱图。通过打开左侧的文件导出峰面积积分结果。选择 定量 | 生成报告.</li>
		<li>要导出用于 DExSI 的文件，请选择 文件 | 导出数据 到 AIA 格式 | 创建新目录，并为文件选择一个保存位置 使用现有目录.</li>
		<li>观察新打开的窗口以选择要导出的文件。将文件移至窗口右侧，然后单击 过程等待数秒至数分钟，具体时间取决于正在转换的文件数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据 DExSI 软件的说明校正 DExSI 中的同位素丰度（https://github.com/DExSI/DExSI），并使用您偏好的软件或程序进行分析例如，R）&#160;用于生成图像的脚本位于&#160;<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/joannlp/VOC_SIP&amp;source=gmail&amp;ust=1646398895210000&amp;usg=AOvVaw18Jx-lKhdf3eNanCnF4OhQ" href="https://github.com/joannlp/VOC_SIP" target="_blank">https://github.com/joannlp/VOC_SIP</a>.</li>
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</ol>

V. L. V 和 S. J. B. D. 曾是 Entech Instruments Inc. 的前员工，K. W. 是 Entech 大学项目的成员。J. P.、J. K. 和 C. I. R. 无任何利益冲突需要声明。

为了鉴定体外培养物和人体相关样本中的挥发性物质产生情况，对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的单培养与共培养体系进行了挥发性物质分析，并对不同生物样本开展了稳定同位素示踪研究。在单培养与共培养的分析中，通过在70 °C下进行1小时的短时间提取来检测挥发性物质。该挥发性物质分析使得能够系统调查各单一菌种及其相互作用过程中产生的化合物。不同培养类型和时间点之间的相对丰度存在差异。在稳定同位素示踪实验中，所用生物样本包括健康个体的粪便和唾液、污水以及囊性纤维化患者痰液。通过在37 °C下进行18小时的提取，稳定同位素分析可识别出微生物活跃生成的挥发性分子。较长的提取时间结合较低的温度有利于生物样本中微生物的生长和代谢。比较13C标记葡萄糖与D2O的同位素富集情况发现，使用13C标记物时同位素富集更为显著。
在提取不同类型样品时，正式开展完整实验前需进行初步优化。首先，应以不同样品体积...

挥发性有机化合物（VOCs）在细菌检测与鉴定方面具有巨大潜力，因为所有生物体均会释放挥发性有机物，而不同微生物具有独特的挥发性有机物特征。挥发性分子已被用作非侵入性检测手段，用于识别多种呼吸道感染，包括慢性阻塞性肺疾病1、结核病2（通过尿液检测3）以及呼吸机相关性肺炎4，此外还可用于区分囊性纤维化（CF）患者与健康对照者5,6。挥发性特征甚至已被用于区分囊性纤维化患者中特定病原体的感染（如Staphylococcus aureus7、Pseudomonas aeruginosa8,9，以及S. aureus与P. aeruginosa的鉴别10）。然而，由于此类生物样本成分复杂，通常难以精确定位特定挥发性有机物的来源。
分离多种感染性微生物挥发性特征的一种策略是对微生物在单培养和共培养条件下的顶空成分进行分析11顶空分析检测释放到顶空中的分析物 &#34;顶空&#34; 高于样本本身的挥发物，而非嵌入样本内部的挥发物。由于难以确定复杂临床样本中微生物代谢物的来源，微生物代谢物通常在单培养体系中进行表征。通过分析细菌单培养产生的挥发性物质，可明确某种微生物所能产生的挥发性物质种类 体外 可能代表其挥发性物质谱的基线。结合细菌培养， 例如，建立共培养体系并分析产生的挥发性分子，可能揭示细菌之间的相互作用或交叉喂养关系12.
确定挥发性分子微生物来源的另一种策略是提供一种用稳定同位素标记的营养源。稳定同位素是自然界中存在的、非放射性的原子形式，其中子数与普通原子不同。自20世纪30年代以来，该策略已被用于追踪动物体内的活跃代谢过程13，微生物利用被标记的营养源进行生长，并将稳定同位素整合到其代谢通路中。最近，研究人员使用重水（D2O）形式的稳定同位素，成功鉴定了临床囊性纤维化（CF）痰液样本中具有代谢活性的S. aureus14。在另一项研究中，使用13C标记的葡萄糖证明了囊性纤维化临床分离株P. aeruginosa与Rothia mucilaginosa之间代谢产物的交叉喂养现象12。
随着质谱技术的进步，对挥发性信号的检测方法已从定性观察发展为更精确的定量测量。通过使用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），大多数实验室或临床环境已能够处理生物样本。多种用于检测挥发性分子的方法已被应用于食品、细菌培养物及其他生物样本，以及空气和水样中污染物的分析。然而，一些常用的高通量挥发性物质采样方法需要使用溶剂，且未能利用真空萃取所带来的优势。此外，分析时常需较大体积或数量的采样材料（超过0.5 mL）15,16,17,18,19，尽管具体需求因底物而异，且需针对每种样本类型和方法进行优化。
本研究采用真空辅助吸附剂萃取（VASE）结合气相色谱-质谱法（GC-MS）上的热脱附技术，对细菌单培养和共培养的挥发性物质谱进行分析，并利用稳定同位素示踪技术鉴定来自人类粪便、唾液、污水和痰液样本中 actively produced 的挥发性有机物（图1）。在样本量有限的情况下，可从低至15 µL的痰液中萃取挥发性有机物（VOCs）。针对人体样本的同位素示踪实验需添加稳定同位素标记物（如13C葡萄糖）及培养基，以促进微生物群落的生长。通过GC-MS可将actively produced的挥发性物质识别为更重的分子形式。在静态真空条件下萃取挥发性分子，可提高检测的灵敏度20,21,22。

<table><tbody><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C 葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374-1G</td><td></td></tr><tr><td>2-Stg Diaph 泵</td><td>Entech Instruments</td><td>01-10-20030</td><td></td></tr><tr><td>20 mL VOA 小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>5719110</td><td></td></tr><tr><td>带孔 24 mm 黑色瓶盖（无隔垫）</td><td>Entech Instruments</td><td>01-39-76044B</td><td>用于固定小瓶上的衬垫</td></tr><tr><td>用于吸附笔的 24 mm 小瓶衬垫</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-L024S</td><td>使吸附笔可在小瓶顶部形成真空密封</td></tr><tr><td>5600 吸附笔萃取单元（SPEU）</td><td>Entech Instruments</td><td>5600-SPES</td><td>5600 吸附笔萃取单元 -120 VAC</td></tr><tr><td>96 孔检测板</td><td>Genesee</td><td>25-224</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液（BHI）培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation Stofware</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-624 色谱柱</td><td>Agilent</td><td>122-1364E</td><td>60 m，0.25 mm 内径，1.40 微米膜厚，用于气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）</td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dexsi 软件</td><td>Dexsi（开源）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）（7890A 气相色谱仪和带三轴检测器的 5975C 惰性 XL 质谱检测器）</td><td>Agilent</td><td></td><td>7890A 气相色谱仪和带三轴检测器的 5975C 惰性 XL 质谱检测器</td></tr><tr><td>顶空采样套装 HS-B01，120VA</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-B01</td><td>套装中包含用于顶空萃取的组件</td></tr><tr><td>顶空吸附笔（HSP）- 空白</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-0</td><td></td></tr><tr><td>顶空吸附笔（HSP）Tenax TA（35/60 目）</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-T3560</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（2 mL）</td><td>VWR</td><td>53550-792</td><td></td></tr><tr><td>O 型圈</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-OR-L024</td><td></td></tr><tr><td>样品制备轨道</td><td>Entech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸附笔热调节器</td><td>Entech Instruments</td><td>3801-SPTC</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt（TH）培养基</td><td>Sigma</td><td>T1438-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

利用真空辅助吸附萃取法捕获人源样本中主动产生的微生物挥发性有机化合物

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

生物样本中的挥发性有机化合物（VOCs）来源尚不明确。这些VOCs可能来源于宿主本身，也可能来源于宿主微生物群落中的不同生物体。为了厘清微生物来源的挥发性有机化合物的起源，需对细菌的单一培养及共培养体系进行顶空气相分析 金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 和 鲍曼不动杆菌对粪便、唾液、污水和痰液等生物样本进行了单培养和共培养，并结合稳定同位素探针技术，以鉴定单个细菌物种产生的挥发性物质，或通过稳定同位素探针技术识别生物样本中微生物的活跃代谢活动。
采用真空辅助吸附剂萃取法（Vacuum-assisted sorbent extraction, VASE）对挥发性有机化合物（VOCs）进行萃取。VASE 是一种易于使用、已实现商业化、无需溶剂的顶空萃取方法，适用于半挥发性和挥发性化合物。由于萃取过程中无需溶剂且采用近真空条件，与其它萃取方法相比，方法开发相对简便且快速，例如 叔丁基丁基化与固相微萃取。本文所述工作流程用于鉴定单一种类培养与共培养体系中的特异性挥发性特征物质。此外，通过对人体相关生物样本进行稳定同位素探针分析，鉴定出共有的或特异产生的挥发性有机化合物（VOCs）。本文介绍了挥发性代谢物分析（VASE）与活体微生物培养物稳定同位素探针技术联用的通用工作流程及实验注意事项。

单培养与共培养 S. aureus, P. aeruginosa，以及 A. baumannii 
单培养与共培养包含以下细菌物种 金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 和 A. baumannii。这些是常见的人类伤口和慢性感染中的机会性病原体。为鉴定单培养和共培养中存在的挥发性分子，进行了短暂的1小时提取。 70 °C 以 200 rpm 振荡。在 24 小时和 48 小时时间点的单培养和共培养体系中，共检测到 43 种带有注释的挥发性分子（图2包括醛类、酮类、醇类、含硫化合物、烃类、羧酸或酯类以及芳香族化合物。有少量挥发性分子仅在特定时间点的某些单培养或共培养条件下被检测到。例如，乙偶姻和3-羟基-2-丁酮乙酸酯仅在 S. aureus 48小时时间点的培养物（<st...

本方案描述了使用Entech样品前处理平台，通过真空辅助吸附萃取法从生物样品中提取挥发性有机化合物，并结合气相色谱-质谱联用技术进行检测及数据分析的方法。同时，本方案还介绍了生物样品的培养以及稳定同位素探针技术的应用。

生物样本中的挥发性有机化合物（VOCs）来源尚不明确。VOCs可能来源于宿主，或来自样本内存在的不同生物体……

本方案使我们能够轻松地浓缩并鉴定多种生物样本中微生物产生的挥发性代谢物及主动释放的挥发性物质。VASE 是一种更便于操作的低丰度挥发性物质浓缩方法。您仅需将样本置于近真空环境中，其余过程由物理作用自动完成。对临床样本进行挥发性物质分析在多种不同疾病状态下的代谢生物标志物发现中具有重要意义。例如，通过唾液、痰液或呼出气体样本的挥发性物质分析，可以检测引发感染的病原体或评估抗菌治疗的效果。制备粪便样本时，向1.5毫升微量离心管中的100毫克粪便加入1毫升去离子水，并涡旋振荡3分钟。不使用时将样品置于冰上。向15微升粪便与水的混合物中加入485毫升含20毫摩尔13C葡萄糖的BHI培养基或含30%氘代的BHI培养基，确保样品终体积为500微升。每个样本设置三个技术重复。为制备污水样品，将500微升污水加入含13C葡萄糖或30%氘代水的500微升BHI培养基中，总体积为1毫升。每个样品设置三个重复，并置于冰上保存。为制备唾液样品，将50微升唾液加入含13C葡萄糖或30%氘代水的500微升BHI培养基中，总体积为550微升。将样品制备成三份重复样，并置于冰上。制备痰液样品时，取15 µL痰液加入离心管中。将样品制备成三份重复样，并置于冰上。将空的 VOA 小瓶放置在冷板上，并将冷板置于生物安全柜中的冰上。打开 5600 SPEU 并调节至所需温度。使用防水标记笔根据样品、重复组和 HSP 编号对 20 毫升 VOA 小瓶进行标记，该标记笔应具备防水性能，以防小瓶置于冰上时外壁产生冷凝水而影响标识。在生物安全柜内，拧开小瓶的白色瓶盖，迅速用移液器将样品加入小瓶中，然后安装衬垫、黑色瓶盖和HSP。将含有样品和HSP的小瓶放回冷板上。待所有样品均在玻璃小瓶中制备完毕后，打开真空泵，将小瓶置于真空环境中，随后移除真空源。使用压力表在将所有样品置于真空环境后再次检查压力。若发现小瓶泄漏，请确保瓶盖已拧紧，并确认HSP和瓶盖衬垫中的白色O形圈已正确安装。将小瓶放入SPEU中，在优化的时间和温度条件下，以200 RPM的振荡速度进行处理。将培养物在70摄氏度下提取一小时，并对粪便、污水、唾液和痰液样本进行稳定同位素探针实验，在37摄氏度下提取18小时。提取完成后，将冷板置于零下80摄氏度环境中备用。提取结束后，将样本置于冷板上15分钟，以从HSP及瓶顶空区中去除水蒸气，随后将HSP转移至其套管中。在 Entech 软件中设置样品序列。打开程序，在仪器下拉菜单右侧的选项中选择 5800 和序列。保存序列表格，然后在左侧选择运行，如果空白 HSP 不在脱附管中，则选择从脱附管中的空白开始。请注意，每个样本序列中的 HSP 将由 SPR 进行处理。让 SPR 预热，并使其自动运行所有样本。气相色谱-质谱联用仪一侧的序列将自动把数据记录在独立的文件中。通过选择“校准”，然后在外部标准品化合物下选择“编辑化合物”、“名称”和“插入化合物”，将峰添加到处理方法中。添加化合物的名称、保留时间以及定量信号目标离子。添加三个最大的峰，这些峰包含概率大于75%的化合物，并确保每种化合物的各鉴定离子均位于峰的中心位置。单击“确定”，然后选择“方法”并保存。方法设置完成后，进入“定量”并点击“计算”，随后选择“查看”和“QEDIT定量结果”以对数据进行定量分析。本研究采用真空辅助吸附萃取结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）的热脱附技术，对细菌单培养和共培养物的挥发性成分进行分析，并利用稳定同位素示踪技术鉴定来自人粪便、唾液、污水和痰液样本中主动产生的挥发性物质。单培养和共培养所涉及的细菌种类包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。在培养24小时和48小时的时间点，共检测到43种已注释的挥发性分子。与氘相比，13C更多地掺入到完全标记的挥发性分子中。在所有粪便、污水和唾液样本中，13C均掺入到2-丁酮、3-羟基-2,3-丁二酮（双乙酰）、乙酸和苯酚中。丙酮、丁酸和丙酸在唾液和污水样本中被检测到带有标记。而二甲基三硫醚和二硫化二甲基在粪便和唾液样本中均富集。1-丙醇、2-丁酮、二苯甲酮、乙醇和乙酸甲硫醇酯仅在污水中富集，2,3-戊二酮仅在唾液中富集。氘标记物被掺入来自唾液或污水样本的挥发性物质乙酸、苯甲醛、4-甲基-二甲基三硫醚和苯酚中。与未培养的痰液样本相比，培养的痰液样本中乙酸、二甲基三硫化物、丙酮和2-甲基丙醇的含量更为丰富。我们对囊性纤维化痰液样本中挥发性物质丰度的Bray-Curtis距离矩阵进行了置换多变量方差分析（PERMANOVA）。结果显示，提供样本的受试者解释了13C标记培养痰液中51%的变异，以及未培养痰液中33%的变异。在此展示了利用¹³C标记的葡萄糖对来自7名囊性纤维化患者痰液培养样本中挥发性物质进行稳定同位素标记的结果。图5A显示在大多数样本中¹³C掺入率较高的挥发性化合物，图5B显示在大多数痰液样本中¹³C掺入率较低的化合物，图5C显示在少数痰液样本中¹³C转化率较低的分子。每次操作后约一分钟务必再次检查小瓶内的压力。真空系统泄漏会破坏VASE方法的灵敏度和速度。按照本步骤操作后，如果进行了稳定同位素示踪，可从剩余材料中提取DNA，以鉴定可能参与挥发性分子生成的微生物或物种。该方法也可用于检测任何类型样品中挥发性物质的存在，无需进行同位素示踪。由于具有灵敏度高和样品用量少的优势，许多应用均可受益于该技术。

capturing-actively-produced-microbial-volatile-organic-compounds-from

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过真空辅助吸附剂提取从人类相关样品中捕获活性产生的微生物挥发性有机化合物

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利用二次电喷雾电离质谱法（SESI-MS）表征细菌挥发性物质

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