利用真空辅助吸附萃取法捕获人源样本中主动产生的微生物挥发性有机化合物

本方案使我们能够轻松地浓缩并鉴定多种生物样本中微生物产生的挥发性代谢物及主动释放的挥发性物质。VASE 是一种更便于操作的低丰度挥发性物质浓缩方法。您仅需将样本置于近真空环境中，其余过程由物理作用自动完成。

对临床样本进行挥发性物质分析在多种不同疾病状态下的代谢生物标志物发现中具有重要意义。例如，通过唾液、痰液或呼出气体样本的挥发性物质分析，可以检测引发感染的病原体或评估抗菌治疗的效果。制备粪便样本时，向1.5毫升微量离心管中的100毫克粪便加入1毫升去离子水，并涡旋振荡3分钟。

不使用时将样品置于冰上。向15微升粪便与水的混合物中加入485毫升含20毫摩尔13C葡萄糖的BHI培养基或含30%氘代的BHI培养基，确保样品终体积为500微升。每个样本设置三个技术重复。

为制备污水样品，将500微升污水加入含13C葡萄糖或30%氘代水的500微升BHI培养基中，总体积为1毫升。每个样品设置三个重复，并置于冰上保存。为制备唾液样品，将50微升唾液加入含13C葡萄糖或30%氘代水的500微升BHI培养基中，总体积为550微升。

将样品制备成三份重复样，并置于冰上。制备痰液样品时，取15 µL痰液加入离心管中。将样品制备成三份重复样，并置于冰上。

将空的 VOA 小瓶放置在冷板上，并将冷板置于生物安全柜中的冰上。打开 5600 SPEU 并调节至所需温度。使用防水标记笔根据样品、重复组和 HSP 编号对 20 毫升 VOA 小瓶进行标记，该标记笔应具备防水性能，以防小瓶置于冰上时外壁产生冷凝水而影响标识。

在生物安全柜内，拧开小瓶的白色瓶盖，迅速用移液器将样品加入小瓶中，然后安装衬垫、黑色瓶盖和HSP。将含有样品和HSP的小瓶放回冷板上。待所有样品均在玻璃小瓶中制备完毕后，打开真空泵，将小瓶置于真空环境中，随后移除真空源。

使用压力表在将所有样品置于真空环境后再次检查压力。若发现小瓶泄漏，请确保瓶盖已拧紧，并确认HSP和瓶盖衬垫中的白色O形圈已正确安装。将小瓶放入SPEU中，在优化的时间和温度条件下，以200 RPM的振荡速度进行处理。

将培养物在70摄氏度下提取一小时，并对粪便、污水、唾液和痰液样本进行稳定同位素探针实验，在37摄氏度下提取18小时。提取完成后，将冷板置于零下80摄氏度环境中备用。提取结束后，将样本置于冷板上15分钟，以从HSP及瓶顶空区中去除水蒸气，随后将HSP转移至其套管中。

在 Entech 软件中设置样品序列。打开程序，在仪器下拉菜单右侧的选项中选择 5800 和序列。保存序列表格，然后在左侧选择运行，如果空白 HSP 不在脱附管中，则选择从脱附管中的空白开始。

请注意，每个样本序列中的 HSP 将由 SPR 进行处理。让 SPR 预热，并使其自动运行所有样本。

气相色谱-质谱联用仪一侧的序列将自动把数据记录在独立的文件中。通过选择“校准”，然后在外部标准品化合物下选择“编辑化合物”、“名称”和“插入化合物”，将峰添加到处理方法中。添加化合物的名称、保留时间以及定量信号目标离子。

添加三个最大的峰，这些峰包含概率大于75%的化合物，并确保每种化合物的各鉴定离子均位于峰的中心位置。单击“确定”，然后选择“方法”并保存。方法设置完成后，进入“定量”并点击“计算”，随后选择“查看”和“QEDIT定量结果”以对数据进行定量分析。

本研究采用真空辅助吸附萃取结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）的热脱附技术，对细菌单培养和共培养物的挥发性成分进行分析，并利用稳定同位素示踪技术鉴定来自人粪便、唾液、污水和痰液样本中主动产生的挥发性物质。单培养和共培养所涉及的细菌种类包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。在培养24小时和48小时的时间点，共检测到43种已注释的挥发性分子。

与氘相比，13C更多地掺入到完全标记的挥发性分子中。在所有粪便、污水和唾液样本中，13C均掺入到2-丁酮、3-羟基-2,3-丁二酮（双乙酰）、乙酸和苯酚中。丙酮、丁酸和丙酸在唾液和污水样本中被检测到带有标记。

而二甲基三硫醚和二硫化二甲基在粪便和唾液样本中均富集。1-丙醇、2-丁酮、二苯甲酮、乙醇和乙酸甲硫醇酯仅在污水中富集，2,3-戊二酮仅在唾液中富集。氘标记物被掺入来自唾液或污水样本的挥发性物质乙酸、苯甲醛、4-甲基-二甲基三硫醚和苯酚中。

与未培养的痰液样本相比，培养的痰液样本中乙酸、二甲基三硫化物、丙酮和2-甲基丙醇的含量更为丰富。我们对囊性纤维化痰液样本中挥发性物质丰度的Bray-Curtis距离矩阵进行了置换多变量方差分析（PERMANOVA）。结果显示，提供样本的受试者解释了13C标记培养痰液中51%的变异，以及未培养痰液中33%的变异。

在此展示了利用¹³C标记的葡萄糖对来自7名囊性纤维化患者痰液培养样本中挥发性物质进行稳定同位素标记的结果。图5A显示在大多数样本中¹³C掺入率较高的挥发性化合物，图5B显示在大多数痰液样本中¹³C掺入率较低的化合物，图5C显示在少数痰液样本中¹³C转化率较低的分子。每次操作后约一分钟务必再次检查小瓶内的压力。

真空系统泄漏会破坏VASE方法的灵敏度和速度。按照本步骤操作后，如果进行了稳定同位素示踪，可从剩余材料中提取DNA，以鉴定可能参与挥发性分子生成的微生物或物种。该方法也可用于检测任何类型样品中挥发性物质的存在，无需进行同位素示踪。

由于具有灵敏度高和样品用量少的优势，许多应用均可受益于该技术。