Name: 评估对流感嗜血杆菌的呼吸道免疫应答 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解评估流感嗜血杆菌呼吸道免疫应答的实验方法，利用流式细胞术和共聚焦显微镜检测吞噬作用、细胞因子产生及蛋白酶活性，为慢性肺部疾病研究提供技术支持。

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作者谨此感谢莫纳什医疗中心临床免疫科工作人员在本研究工作中提供的协助。

本研究已获得莫纳什医疗人类研究伦理委员会的批准。本方案遵循人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 抗原制备
注意：可使用三种不同的抗原制剂来评估针对流感嗜血杆菌（Hi）的免疫反应。这些制剂分别为：1）亚细胞组分（通常来自细菌细胞壁）；2）灭活的死菌；3）活菌。在开始任何实验之前，需确定每种抗原制剂的用途。
<ol>
	<li>亚细胞组分
	<ol>
		<li>从各种来源获取亚细胞组分，包括商业制备物、自行研发的组分和/或来自其他研究人员的材料。 
		&#8203;注意：通常可使用来源于细菌细胞壁的亚细胞组分，包括外膜蛋白（如P6）和脂寡糖（LOS）11,12。这些亚细胞组分通常由专业中心制备，其具体制备方法不在本文讨论范围内。建议直接联系该领域的专家以获取这些组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灭活/杀死的细菌
	<ol>
		<li>从适当的样本（例如痰液或支气管镜样本）中获取细菌。通过适当的微生物学实验室确认菌株为H. influenzae。对H. influenzae样本进行分型，确认其为无荚膜型（由专业的微生物学实验室完成）。</li>
		<li>为获得具有代表性的抗原，使用多种NTHi菌株（至少5种，每种数量大致相等）制备混合抗原。将菌株保存在含有甘油肉汤的微量离心管中，并置于-70 °C保存。 
		NOTE: 在本实验中使用了十个不同的菌株。</li>
		<li>将菌株（每次一个微量离心管）在巧克力琼脂平板上解冻，并在37 °C、含5% CO2的培养箱中过夜培养。将细菌加入500 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中，洗涤两次（300 x g离心5分钟）。使用麦氏比浊标准10或分光光度计13将NTHi分装至浓度为108 mL（使用5 mL容器或等效容器）。</li>
		<li>将细菌置于56 °C水浴中加热10分钟以进行热灭活。</li>
		<li>使用连续超声模式，在低至中等速度下对细菌进行30秒超声处理。</li>
		<li>将适量样本分装至微量离心管中。对于108 mL的样本，使用50 μL的分装量（即每毫升可分装20份），并在需要时冷冻保存于-70 °C14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细菌
	<ol>
		<li>首先，按照步骤1.2.1所述对活细菌进行表征。使用一个特征明确的菌株，并确保该菌株也以甘油肉汤形式保存于-70 °C作为储备。</li>
		<li>在富集培养基（如巧克力琼脂平板或液体培养基）中培养细菌。
		<ol>
			<li>若使用巧克力琼脂平板，需使用无菌涂布器每隔至少3-4天传代一次。</li>
			<li>或者，使用添加X因子（血红素）和V因子（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的脑心浸液（BHI）肉汤培养细菌。从过夜培养的平板中接种NTHi至5-10 mL BHI肉汤中，同时补充血红素和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（均为10 µg/mL），并在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。 
			NOTE: 此方法具有可重复性好、菌落形成单位（CFU）数量高以及所有细菌处于相似对数生长期的优点（而在平板上，细菌活力可能因培养位置不同而有所差异）13,15。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用感染复数（MOI）为100:1（即每细胞100个细菌）以诱导强烈的免疫反应，同时维持细胞活力。使用麦氏比浊标准10或分光光度计13评估细菌数量。</li>
		<li>确保用于活NTHi检测的培养基中不含任何人血清，因为人血清会杀死细菌16。动物血清样本（例如胎牛血清）通常不会引起问题。 
		&#8203;NOTE: 使用以下所述方法分析标准组织样本，如外周血、支气管镜样本（特别是支气管肺泡灌洗液（BAL））以及切除的肺组织。将样本与Hi抗原孵育10分钟至24小时或更长时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过流式细胞术评估吞噬功能
注意：该检测需要溶液中的细胞，通常使用全血或支气管肺泡灌洗液进行。本实验方法改编自先前发表的方案，原方案基于灭活的Staphylococcus aureus制剂和Pansorbin17的使用。本方法中以灭活的全血和固定的H. influenzae替代Pansorbin17。
<ol>
	<li>将灭活的NTHi（1.2）与碘化丙啶（PI）按1:1比例在磷酸盐缓冲液（PBS）中混合，PI终浓度为100 μg/mL，室温孵育30分钟。在450 × g 离心5分钟，然后用500 μL PBS洗涤。再次在450 × g 离心5分钟，将沉淀重悬于500 μL PBS中。</li>
	<li>在5 mL离心管中，将450 μL外周血（来自人体静脉穿刺）与50 μL经PI标记的灭活H. influenzae混合，于37 °C水浴中孵育20分钟。</li>
	<li>从水浴中取出样本，加入5 μL二氢罗丹明-1,2,3（DHR），涡旋振荡10秒，然后放回水浴中继续孵育10分钟。</li>
	<li>从水浴中取出样本，用10:1（即5 mL）的0.8%氯化铵溶液（含150 mM NH4Cl、1 mM NaHCO3和0.1 mM EDTA）裂解红细胞（体积为步骤2.2中所述的500 μL）。 
	注：也可使用Q-prep等自动化系统。</li>
	<li>在一小时内使用流式细胞仪分析样本。每个样本至少分析3,000–5,000个细胞（来自每个感兴趣的亚群），以获得具有代表性的结果（图1）。
	<ol>
		<li>为分析吞噬作用，测定摄入标记细菌的细胞比例（测量具有荧光染料的细胞比例）。</li>
		<li>通过DHR的氧化反应定量活性氧（ROS），该反应产生荧光信号（比较基础状态与刺激后样本的中位荧光强度变化）。 
		注：中性粒细胞颗粒性更强，侧向散射更高；而巨噬细胞体积更大，前向散射更强。</li>
		<li>根据细胞大小（巨噬细胞较大）和颗粒性（中性粒细胞颗粒性更强）在形态学上区分中性粒细胞与巨噬细胞。 
		&#8203;注：通常不使用中性粒细胞和巨噬细胞的特异性标记物，尽管可使用CD14标记外周血单核细胞。流式细胞术可能用于区分不同功能表型的单核细胞和巨噬细胞（如M1和M2亚群）18。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要调整实验方案（例如，使用未标记的活NTHi刺激吞噬细胞，并通过DHR裂解检测ROS表达）。
	<ol>
		<li>通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。将血液小心铺在用于密度梯度离心的指定聚合物上，在2300 × g 离心30分钟。用移液器吸取单个核细胞层，用PBS洗涤两次，重悬于PBS中，调整细胞浓度至106 个/mL。</li>
		<li>也可选用支气管肺泡灌洗液（BAL）来源的巨噬细胞作为替代。</li>
		<li>将单核细胞/巨噬细胞以106 个/mL的浓度悬浮于培养基（RPMI）中，按感染复数（MOI）100:1加入活NTHi，感染1小时（操作同步骤1.3）。</li>
		<li>按照步骤2.3所述方法，在悬液中加入DHR，孵育10分钟，随后使用流式细胞术分析ROS水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 外周血淋巴细胞功能的评估
<ol>
	<li>使用全血或单个核细胞制备物进行流式细胞术检测14。</li>
	<li>通过静脉穿刺采集每位受试者的样本。从外周静脉采集4 mL血液至含锂肝素的采血管中，并将样本分装为对照组和抗原刺激组。</li>
	<li>向两组样本中均加入共刺激抗体（抗CD28和CD49d，1 µL/mL）。向抗原组样本中加入NTHi，并在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。对于灭活NTHi制备物，将200 μL抗原加入2 mL血液中。对于活NTHi，按MOI为100:1的比例将活NTHi细胞加入白细胞中（通过血细胞计数板测定）。</li>
	<li>向样本中加入高尔基体阻断剂布雷菲德菌素A（Brefeldin A，10 µL/mL），并继续孵育5小时。 
	注：阻断高尔基体可防止细胞因子被转运至细胞外。</li>
	<li>若使用全血，用0.8%氯化铵裂解红细胞（步骤2.4），仅保留白细胞于溶液中。使用500 μL浓度为1%-2%的多聚甲醛固定白细胞，孵育1小时。</li>
	<li>通过血细胞计数板计数细胞，取106个细胞用100 μL浓度为0.1%的皂苷处理15分钟以通透细胞膜，随后与荧光标记抗体孵育。洗涤细胞后，使用流式细胞仪进行分析。 
	注：荧光标记抗体的用量因不同细胞因子而异，请参照生产商说明书。通常情况下，将106个细胞悬浮于100 μL溶液中，染色1小时。大多数 commercially 获得的抗体足以进行25-100次检测。</li>
	<li>通过设门选择相关淋巴细胞群体（依次根据CD45、CD3，再根据CD4或CD8的表达进行设门）来确定抗原应答细胞的比例，如图2所示。对所有待分析的细胞因子，均需对未刺激细胞进行背景染色。每种细胞因子的刺激组和对照组均需检测100,000个细胞。</li>
</ol>
4. 肺组织中淋巴细胞功能/炎症介质的评估
<ol>
	<li>通常无法通过支气管镜检查获得足够的淋巴细胞；因此，请使用肺叶切除样本中的肺组织。优化肺组织样本需要与解剖病理学服务部门密切协作。确保所取组织距离肿瘤边缘至少3 cm，并且为细胞丰富的组织，无明显肺气肿（由病理学家判定）。</li>
	<li>在用于流式细胞术检测之前，需将肺组织分散成单细胞悬液。可通过化学方法（例如使用胶原酶）消化组织，或通过机械法进行解离。 
	注意：可能更倾向于采用机械解离法，因其有助于细胞表面标记（如CD3/4标记）获得更好的染色效果19。
	<ol>
		<li>从病理学家处获取肺叶切除样本（通常来自接受肺癌治疗的患者）。取约20–40 g样本，切成3–5 mm3大小的组织块。将其置于无菌的50 µL腔室内，随后使用适当的组织解离仪进行机械破碎。</li>
		<li>组织解离后，按照步骤2.4所述方法，用0.8% NH4Cl裂解红细胞。</li>
		<li>将细胞重悬于无菌RPMI培养基中（体积取决于细胞数量，通常为10–20 mL），然后通过100 µm无菌尼龙筛网过滤。使用台盼蓝排斥法计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NTHi感染检测
	<ol>
		<li>将肺组织细胞重悬，使每管（对照组和刺激组样本）的终浓度为4 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>在1 mL RPMI中使用4 × 106–6 × 106个细胞的悬液作为（阴性）对照管；NTHi处理管使用相同数量的细胞（如有额外样本，可用作SEB阳性对照）。以每个细胞100个细菌的感染复数（MOI）感染NTHi管中的细胞。将管盖松开半圈，以允许气体交换。</li>
		<li>将细胞置于旋转混合仪中，在37 °C、12 rpm条件下旋转孵育。</li>
		<li>为防止细胞因子向胞外分泌，在刺激后1小时向细胞悬液中加入高尔基体阻断剂（布雷菲德林A），使其终浓度为10 µg/mL。继续将细胞悬液在旋转条件下孵育16–22小时（见步骤4.3.3）。</li>
		<li>用含1%牛血清白蛋白（BSA）和0.01% NaN3的500 μL PBS洗涤细胞悬液。分别按照步骤3.5和步骤3.6所述方法进行细胞固定和通透处理。</li>
		<li>加入用于胞内细胞因子染色的抗体（抗体选择由研究者自行决定，参见步骤3.6中的注释）。对细胞悬液进行特异性人淋巴细胞表面标记物（如CD45、CD3等）染色，孵育1小时。用PBS洗涤细胞，然后按照步骤3.5–3.6所述方法进行固定和通透处理。</li>
		<li>加入胞内细胞因子染色抗体（如IFN-γ和TNF-α，或IL-13和IL-17A），孵育1小时。 
		注意：建议先进行表面标记染色，再进行胞内染色，因为固定处理可能导致抗体结合的表面蛋白发生构象改变。</li>
		<li>用500 μL PBS洗涤细胞，重悬于100 μL PBS中，随后在流式细胞仪上进行数据采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可联合使用微球阵列法分析步骤3.2中所述的上清液（此步骤不加布雷菲德林A），从而检测多种不同的炎症介质（最多可达40–50种）。将上清液以100 μL分装，保存于-70 °C，待分析时取出。或者，也可使用多重化学发光检测法20。
	<ol>
		<li>使用多重微球阵列分析解冻后的样本。利用储存的上清液，按照试剂盒说明书分析细胞因子的产生情况。</li>
		<li>在流式细胞仪上进行多重微球阵列的数据采集，并使用相应软件进行下游数据分析。 
		&#8203;注意：该微球阵列检测也可用于外周血和/或支气管肺泡灌洗（BAL）样本的上清液分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过共聚焦显微镜评估肺组织蛋白水解
注意：荧光共聚焦显微镜是流式细胞术的补充技术，可用于评估蛋白酶和活性氧（ROS）介导的炎症反应。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和单核细胞胞外诱捕网（METs）等胞外陷阱由细胞外染色质（DNA）及其他炎症介质组成，特别是中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和基质金属蛋白酶（MMP）。可通过共聚焦显微镜检测支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中的这些结构，Sharma, R. 等人此前已有相关描述21。
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜评估肺组织中蛋白酶的直接表达（如步骤 4.2.1 所述），并 原位 明胶酶谱法15,17.
	<ol>
		<li>使用新鲜或冷冻的未固定肺组织。将厚度为4 µm的切片贴附于防脱/黏附载玻片上。在1×反应缓冲液中预热切片5分钟。</li>
		<li>在每张切片上直接加入荧光素标记的明胶底物（30 µg/mL），以检测金属蛋白酶介导的蛋白水解活性。</li>
		<li>将载玻片水平放置，在37 °C、避光且湿润的孵育 chamber 中孵育1小时。</li>
		<li>用1×反应缓冲液冲洗切片，然后封片。</li>
		<li>作为阴性对照，在切片中仅加入反应缓冲液，不加荧光明胶。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜通过观察来检测底物的裂解情况。使用ImageJ确定显示蛋白水解迹象的肺组织面积。具体方法为：测量荧光明胶淬灭样本背景信号以上的染色区域面积。作为另一对照，使用未添加荧光明胶的肺组织15. 
		注意：每份样本至少应在10个高倍视野（FOV）下进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过检测肺组织中3-硝基酪氨酸（一种毒性氧化应激产物）的免疫反应性，测定细胞外活性氧（ROS）的表达水平13.</li>
</ol>

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<li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li>
<li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69(2011).</li>
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<li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606(2016).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处列出的方法采用基于荧光的流式细胞术和共聚焦显微镜技术，可结合使用以获得关于流感嗜血杆菌（Hi）引起的肺部炎症反应的详细信息。
确定用于实验的流感嗜血杆菌（Hi）抗原制剂的适当配方至关重要，建议在此过程中咨询微生物学家的专业意见。活体Hi可诱导更强的免疫反应，而灭活的Hi制剂及其组分则更具标准化，且更易于储存。PI仅能标记死亡细菌。22；其他染料如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）也可用于标记活细菌，以进行吞噬作用检测23应进行一系列预实验以优化合适的抗原。使用活的非典型流感嗜血杆菌（NTHi）时，最佳感染复数（MOI）为100:1；MOI过低可能无法诱导明显的免疫反应，而MOI过高则可能对细胞产生毒性。然而，绘制剂量-反应曲线可提供有用信息，尤其在技术初始优化阶段具有重要价值。24作为阳性对照，采用 commercially 获得的灭活形式 金黄色葡萄球菌 抗原也可用于实验，并如上所述用PI标记，以进行ROS/吞噬作用...

Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌，Hi）是一种常见的共生细菌，存在于大多数健康成年人的咽部。Hi 可能具有多糖荚膜（分为 A-F 型，例如 B 型或 HiB），也可能无荚膜，称为非分型流感嗜血杆菌（NTHi）1。该细菌在黏膜上的定植始于儿童早期，并且定植的菌株会不断更替2。此细菌还能够侵入上、下呼吸道；在此过程中，可能引发免疫反应的激活和炎症反应3,4。这种炎症反应可导致临床疾病，并参与多种重要呼吸道疾病的发生，包括鼻窦炎、中耳炎、支气管炎、囊性纤维化、肺炎和慢性阻塞性肺疾病（COPD）。其中大多数疾病由 NTHi 菌株引起2。本文将介绍利用流式细胞术和共聚焦显微镜评估呼吸道对 Hi 免疫反应的方法。
以下所述方法改编自已建立的成熟技术，并经过修改以评估对Hi的炎症反应。选择适当的Hi抗原形式是该评估的关键部分。抗原制备物的范围可从细胞壁组分到活细菌。为了建立并标准化检测方法，最初使用外周血样本可能非常有帮助。
流式细胞术能够从单个样本中在细胞水平上测量多种参数和进行功能检测。与酶联免疫吸附试验（ELISA）或ELISpot等其他较为通用的方法相比，该技术的优势在于可以评估特定的细胞反应（例如活性氧（ROS）的产生或细胞内细胞因子的生成）。
中性粒细胞（NETs）5,6,7以及其他细胞（如巨噬细胞，METs）8均可表达细胞外陷阱。这类结构 increasingly 被认为是炎症反应的关键组成部分，尤其是在肺部感染中9。可通过共聚焦荧光显微镜对其进行检测。该技术可明确鉴定NETs/METs，并将其表达与其他形式的细胞死亡区分开来6。
流式细胞术和共聚焦显微镜均为基于荧光的检测方法。其成功应用依赖于生物样本的最佳染色方案。这些技术需要一定时间学习，并要求具备适当的指导专业知识。所涉及的仪器在购置和运行上均较为昂贵。其最佳应用环境包括主要的综合性大学和三级转诊医院。
本方案中所使用的方法可适用于研究其他参与呼吸道疾病的类似生物体（例如，Moxarella catarrhalis 和 Streptococcus pneumoniae）。NTHi 还会与其他常见的呼吸道细菌发生相互作用10。

<table><tbody><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213330</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD28</td><td>Thermofisher</td><td>16-0289-81</td><td></td></tr><tr><td>CD49d</td><td>Thermofisher</td><td>534048</td><td></td></tr><tr><td>DAPI prolong gold</td><td>Thermofisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DHR123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109244-58-8</td><td></td></tr><tr><td>无菌尼龙滤膜（Filcon）</td><td>Becton Dickinson</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>明胶底物（Enzchek）</td><td>Molecular probes</td><td>E12055</td><td></td></tr><tr><td>MACS 混合管旋转仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>目录编号不可用</td></tr><tr><td>Medicons 50 &amp;micro;m</td><td>Becton Dickinson</td><td>340592</td><td></td></tr><tr><td>Pansorbin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>507858</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8047152</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片</td><td>Thermofisher</td><td>11562203</td><td></td></tr></tbody></table>

评估呼吸道免疫应答 流感嗜血杆菌

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae（Hi）是一种常见于多种呼吸系统疾病中的细菌。可采用多种不同的检测方法或技术来评估呼吸道对该细菌的免疫和炎症反应。流式细胞术和共聚焦显微镜是基于荧光的技术，能够对生物学反应进行详细表征。&#160;可用于实验的Hi抗原形式多样，包括细胞壁组分、灭活或失活的菌体制剂以及活菌。Hi是一种营养要求较高的细菌，需要富集培养基，但在标准实验室条件下通常易于培养。用于Hi刺激的组织样本可来源于外周血、支气管镜检查或切除的肺组织（例如接受肺癌手术治疗的患者）。利用流式细胞术可全面评估巨噬细胞和中性粒细胞的功能，检测参数包括吞噬作用、活性氧物质生成以及细胞内细胞因子的产生。淋巴细胞功能（如T细胞和NK细胞功能）也可通过流式细胞术进行特异性评估，主要检测其细胞内细胞因子的产生情况。Hi感染可强烈诱导中性粒细胞（NETs）和巨噬细胞（METs）产生胞外诱捕网。共聚焦显微镜被认为是评估NET和MET表达的最理想方法，也可用于检测蛋白酶活性。针对Haemophilus influenzae的肺部免疫反应可通过流式细胞术和共聚焦显微镜进行评估。

代表性结果展示了如何通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估/定量NTHi诱导的炎症免疫反应。结果解读的关键在于比较对照样本与刺激样本之间的荧光强度差异。通常需要进行多次预实验以优化样本染色条件。可同时检测的不同荧光颜色数量取决于流式细胞仪/共聚焦显微镜所配备的通道数目。本文展示了以下三项检测的结果：1）活性氧（ROS）的产生；2）人肺组织中细胞内细胞因子的染色；3）原位酶谱法（in situ zymography）检测肺组织蛋白水解活性。
图1展示了单核细胞产生活性氧（ROS）的示意图。ROS的检测基于DHR123被氧化后产生荧光的原理。通过流式细胞术对细胞进行设门，并测定其中位荧光强度。将刺激样本的中位荧光强度与对照样本进行比较。
图2展示了来源于人肺组织的淋巴细胞胞内细胞因子的产生情况。在进行流式细胞术检测以评估炎症介质（例如淋巴细胞产生的细胞因子）的产生之前，需要将肺组织分解为单细胞悬液。肺...

Haemophilus influenzae 可诱导呼吸道炎症。本文将重点介绍如何利用流式细胞术和共聚焦显微镜来界定吞噬细胞和淋巴细胞对该细菌的免疫应答。

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae, Hi）是一种在多种呼吸系统疾病中常见的细菌。可采用多种不同的检测方法/技术来……

流感嗜血杆菌是慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺炎等多种慢性肺部疾病炎症的重要病因。本方案描述了评估流感嗜血杆菌对肺部炎症影响的方法。该技术的优势在于能够全面评估固有免疫和适应性免疫应答。在5毫升离心管中，将450微升外周血与50微升活化的碘化丙啶标记的流感嗜血杆菌（H influenzae）混合，于37摄氏度水浴中孵育20分钟。将样本从水浴中取出，加入5微升二氢罗丹明（DHR），涡旋振荡10秒，然后再次放回水浴中继续孵育10分钟。从水浴中取出样本后，加入5毫升0.8%氯化铵溶液裂解红细胞，并按照文中所述方法在流式细胞仪上分析样本。将外周血样本分装为对照组和抗原刺激组。向两份样本中均加入共刺激抗体。然后将不可分型的流感嗜血杆菌加入抗原样品中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育1小时。接着向样品中加入高尔基体阻断剂布雷菲德菌素A，并继续孵育5小时。按照之前所示方法裂解红细胞后，使用500微升1%至2%的多聚甲醛固定白细胞，孵育1小时。使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后用 100 微升 0.1% 皂苷处理 100 万个细胞，透化 15 分钟。接着，将细胞与适当的荧光标记抗体孵育。洗涤细胞后，使用流式细胞仪进行分析。通过获取相关的淋巴细胞群来确定抗原反应细胞的比例。对所有待分析的细胞因子，均需对未刺激细胞进行背景染色。将约20至40克的肺叶切除样本切成3至5立方毫米的组织块。将组织放入无菌的50微升腔室中，使用适当的组织解离器对组织进行机械解离。组织解离后，按所示方法裂解红细胞，并将细胞重悬于无菌RPMI培养基中。随后将细胞通过100微米的无菌尼龙滤网过滤，并使用台盼蓝排斥法计数活细胞数量。进行感染实验时，将肺细胞重悬于RPMI培养基中，每管终浓度为每毫升400万个细胞。然后以每个细胞100个细菌的感染复数（MOI）感染细胞。将管盖松开半圈，以允许管内气体交换。将细胞放入试管旋转仪中，在37摄氏度、12 RPM转速下孵育。刺激后1小时，加入格尔德霉素A以阻止细胞因子的胞外分泌，并继续在旋转条件下孵育细胞悬液16至22小时。次日，用500微升含1%牛血清白蛋白和0.01%叠氮化钠的PBS洗涤细胞悬液。接着，用特异性的人淋巴细胞表面标志物抗体对细胞悬液染色一小时。然后用PBS洗涤细胞，并按照之前所示的方法进行固定和透化处理。随后，将细胞与细胞内细胞因子染色抗体孵育一小时。然后洗涤细胞，并在流式细胞仪检测前将细胞重悬于100 µL PBS中。通过金属蛋白酶的作用检测蛋白水解活性，将荧光素标记的明胶底物直接加到肺组织切片上。将切片水平放置，在37°C避光湿盒中孵育一小时。为了制备阴性对照，在切片中加入不含荧光明胶的一倍反应缓冲液，用于后续分析。使用前向散射和侧向散射对外周血单个核细胞进行设门，以确定吞噬细胞群。通过CD14表达进一步界定吞噬细胞群，以标记单核细胞。通过DHR 123氧化产生荧光来检测活性氧（ROS）水平。将刺激样本的中位荧光强度与对照组进行比较。采用流式细胞术检测淋巴细胞的细胞内细胞因子产生情况。首先分析细胞对白细胞标志物CD45的表达，然后分析CD3、CD4和CD8的表达。在对照和刺激样本中，评估CD3、CD4阳性细胞的胞内细胞因子产生情况。通过非固定肺组织切片的NC2明胶酶谱法测定蛋白酶活性。荧光染色显示存在基质金属蛋白酶（MMP）活性，且该活性与染色质的表达共定位。向肺组织样本中添加抗体需要进行浓度优化，细胞染色步骤也需通过预实验进行条件优化。肺组织样本的上清液可进一步用于分析其他炎症介质，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术。这些技术可用于评估潜在疗法对肺部炎症的影响。

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科研

JoVE Journal

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无接触共培养模型用于研究呼吸道病毒感染期间的固有免疫细胞活化

了解评估流感嗜血杆菌呼吸道免疫应答的实验方法，利用流式细胞术和共聚焦显微镜检测吞噬作用、细胞因子产生及蛋白酶活性，为慢性肺部疾病研究提供技术支持。

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