小型笼具中对基因工程按蚊的实验室试验

本文所述方案适用于在小型实验室笼具试验中评估转基因蚊子的性能，并将其与野生型蚊子进行比较。小型笼具试验对于提供实证数据至关重要，这些数据将有助于推动新型疟疾消除技术的实际应用。该笼具试验方法可适应其他实验设计，也适用于评估特定转基因在种群中扩散动态的潜在风险。

在引入转基因个体后，通过设置三个0.216立方米的笼子（每个设置三个重复）来启动实验的初始阶段，并在连续三周内每周向每个笼子中加入60只二龄野生型幼虫。

每周为每个笼中的成年雌性提供麻醉小鼠作为血液餐源，并在血液餐后三天提供产卵容器。每周收集各笼中的卵进行孵化。

从第四周到第八周，随机选取60只二龄L2幼虫，放回各自对应的饲养笼中。第九周时，随机指定一组三份重复的饲养笼作为对照组，其余每组分别用于设定不同的释放比例。每周向对照组饲养笼中添加60只野生型蛹，其中包含30只雄性和30只雌性。

每周向每个相应的笼子中加入30只转基因雄性蛹和60只野生型蛹，以维持1:1的比例。对于1:0.1的比例，每周向每个相应的笼子中加入300只转基因雄性蛹和60只野生型蛹。每周重复向笼内添加蚊蛹，提供血液餐并孵化卵。

从每个笼子中随机选取总共 300 头幼虫进行筛选。在体视显微镜下使用荧光滤光片，检测幼虫和蛹阶段荧光显性标记的表达情况。记录所获得蛹的性别。

在基因驱动实验中，采用屏障策略，将蚊子饲养在安全的昆虫饲养室内，并遵循标准操作程序进行定期监测。为每种所需的转基因雄蚊与野生型雄蚊释放比例，准备两组三重复的0.216立方米笼具。为实现1:1的雄蚊释放比例，向每个重复组笼具中加入120只转基因雄蚊、120只野生型雄蚊以及处于蛹阶段的雌蚊。

使用麻醉的小鼠为每个笼子中4至7日龄的雌蚊提供血餐。在幼虫盘中孵化卵后，从每个笼子中随机选取约240条一龄L1幼虫，饲养至化蛹，然后将其放回各自的笼子中。按照之前所述的方法，对幼虫进行眼标记和性别表型的筛选与鉴定。

为每个特定的转基因雄蚊与野生型雄蚊释放比例，设置三个重复的0.005立方米笼具，每个笼具中雌雄数量相等。使用人工饲喂装置，对每个笼具中4至7日龄的雌蚊连续两天提供血液餐。第二次血餐后三天，放入产卵容器，并在三天后移除容器。

按性别统计笼内所有死亡和存活的成虫数量后，将其在零下80摄氏度保存，用于分子分析。孵化卵并挑选200条L1幼虫，将这些幼虫单独培养以建立下一代的新笼群。然后从每个预留的笼中随机选取另外500条幼虫用于筛选。

将选定的200只幼虫饲养至蛹期，另将500只幼虫饲养至四龄幼虫阶段。将来自200个培养皿的蛹转移至新笼中用于繁殖。如前所述，随机选取幼虫筛选眼标记和性别表型。

在代表性分析中，展示了不同种群替换笼式试验方案下表现最佳的重复组中预期的表型动态。结果显示，在七代内，携带 DsRed 标记表型的幼虫比例呈线性增加。以 1:1 比例释放非基因驱动型个体时，七代内转基因引入率略高于 80%。

基因驱动技术在三到四代内即实现了这一目标。从而验证了单次释放基因驱动系统在转基因引入方面可能更为高效。在观察期结束时，转基因在基因驱动系统中的扩散已接近完全引入。

重要参数，例如释放比例、种群年龄结构、笼具大小等，将根据实验目的和具体目标而有所不同。可开展用于评估适合度参数（如生育力和繁殖力）的实验。此外，笼养试验中获得的更多实证数据可用于对种群动态的数学模型进行参数化。