Name: 基因工程按蚊的小笼实验室试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解基因工程按蚊小笼实验室试验的操作流程，评估转基因蚊子的性能表现，比较其与野生型对照组的差异，为疟疾防控新技术的实施提供实证数据支持。

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我们感谢Drusilla Stillinger、Kiona Parker、Parrish Powell和Madeline Nottoli在蚊虫饲养方面提供的帮助。本研究由加州大学欧文分校疟疾倡议项目提供资金支持。AAJ是加州大学欧文分校的Donald Bren讲席教授。

动物伦理声明 
本研究严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案经加州大学机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committees of the University of California）批准（动物福利保证编号 A3416.01）。
1. 非基因驱动蚊子的淹没式释放试验（图1）
<ol>
	<li>笼具设置与维护
	<ol>
		<li>设置三组平行样，每组三个，使用 0.216 m3&#160;通过连续三周每周在每个笼中添加60只二龄野生型（WT）幼虫来建立虫笼。 
		注意：无法通过光学显微镜确定二龄幼虫的性别，因此每个饲养笼中添加的样本将包含雄性和雌性个体。</li>
		<li>每周为每笼成年雌性提供麻醉小鼠作为血餐来源（图 2A）以及在吸血后3天提供产卵容器。 
		注意：尽管可使用其他人工喂饲装置，但提供活体麻醉小鼠作为血餐可使这些大型（0.216 m³）容器中的蚊虫获得更佳的吸血表现。3) 笼具规格。使用小鼠需要经过批准的动物使用方案以及相关机构（例如，机构动物护理与使用委员会，IACUC）的批准。 
		注意：每只小鼠使用4 mg/小鼠的盐酸氯胺酮混合物进行麻醉，&#160;0.4 毫克/只赛拉嗪。每只动物注射该混合物的体积为 0.1–0.5 毫升。</li>
		<li>每周从每个笼中孵化虫卵，并随机选取60只二龄（L2）幼虫放回各自的笼中，以补偿死亡率（第4–8周）。 
		注意：步骤 1.1.1 至 1.1.3 是建立稳定且具有年龄结构分布的笼养种群所必需的，该阶段称为“初始阶段”。</li>
		<li>第9周时，将步骤1.1.1中组装的笼子随机分组，每组三个重复，用于释放目标雄性比例的个体。
		<ol>
			<li>将一组三个重复的笼子指定为对照组，以评估整个实验过程中的一致性。</li>
			<li>为每种目标释放比例（例如，1:1 或 1:0.1 转基因雄性:野生型雄性）指定一组三个重复样本. 
			注意：此时间点之后称为“实验阶段”。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复实验与释放比率
	<ol>
		<li>每周向对照组笼中加入60只野生型蛹（30只雄性和30只雌性）。</li>
		<li>为保持1:1的比例，每周向每个笼子中分别加入30只转基因雄性蛹以及60只野生型蛹（30只雄性和30只雌性）。</li>
		<li>为保持1:0.1的比例，每周向每个笼子中分别加入300只转基因雄性蛹和60只野生型蛹（30只雄性和30只雌性）。 
		注意：持续向笼中添加野生蚊子以维持笼内密度，由于与年龄相关的成蚊死亡率，预计每周笼内密度会有所下降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表型筛选
	<ol>
		<li>从每个笼子中随机选取总共300只幼虫。使用配备荧光滤光片的体视显微镜，在幼虫和蛹阶段筛选荧光显性标记的表达，并记录所获得成虫的性别。图3). 
		注意：表型筛选将取决于整合到蚊子体内的转基因构建体中所包含的显性标记（例如， Discosoma 红色荧光蛋白 [DsRed]、青色荧光蛋白 [CFP]、绿色荧光蛋白 [GFP]），以及驱动其表达的启动子（蚊子转基因中最常用的是3xP3启动子，可在复眼和神经索中驱动表达）。</li>
		<li>根据实验设计中定义的结果参数，按需重复此方案若干代。 
		&#8203;注意：当所有蚊子至少含有一个拷贝的转基因（通过显性荧光标记的存在来确定）时，或当笼中转基因蚊子与野生型蚊子的比例在几代（3–5 代）后趋于稳定且无明显波动时，试验通常终止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基因驱动蚊子的重叠世代试验（图4）
注意：携带基因驱动系统的蚊子需要有书面并经过审查的方案，并应获得机构生物安全委员会（IBC）或同等机构的批准，以及其他必要部门的批准。蚊子的保藏（ACL 2+ 级别）应遵循推荐的操作程序5,6,7。具体而言，基因驱动实验应采用两种严格的封闭策略。第一种通常是生物体与环境之间的物理屏障（屏障策略），这要求具备安全的昆虫饲养设施以及标准操作程序（包括监测），以确保蚊子不会逃逸。第二种封闭策略可以是分子层面、生态层面或生殖层面的5。
<ol>
	<li>笼具设置
	<ol>
		<li>为每个期望的转基因:野生型雄性释放比例，设置两组三个重复的 0.216 m3 笼具。
		<ol>
			<li>为实现 1:1 的雄性释放比例，在每个重复笼具中于蛹阶段加入 120 只转基因雄蚊、120 只野生型雄蚊和 120 只野生型雌蚊。</li>
			<li>为实现 1:10 的释放比例，在每个重复笼具中于蛹阶段加入 12 只转基因雄蚊、120 只野生型雄蚊和 120 只野生型雌蚊。 
			&#8203;注意：可测试不同的释放比例（如 1:1、1:3、1:10 等），用于启动实验的蚊虫数量相应变化。但需注意低数量对数据统计分析的影响。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>种群维持与筛选
	<ol>
		<li>使用麻醉小鼠为每个笼具中 4–7 日龄的雌蚊提供血餐（图 2A）。</li>
		<li>血餐后三天，在每个笼具中放入一个产卵容器。</li>
		<li>将卵在幼虫盘中孵化，从每个笼具中随机选取约 240 只一龄幼虫（L1），饲养至成虫，并将其放回对应的笼具中。</li>
		<li>如步骤 2.2.1 所述，每隔 3–4 天为新羽化的成虫额外提供 2–3 次血餐。 
		注意：在后续各世代中不再额外添加转基因雄蚊。</li>
		<li>从每个笼具中随机选取共 300 只幼虫，使用荧光体视显微镜在幼虫和蛹阶段检测其是否存在显性标记表型，并对羽化成虫进行性别鉴定（图 3）。 
		注意：如前所述，表型筛选取决于基因驱动系统中包含的显性标记和启动子，以及整合到转基因蚊中的元件（例如 DsRed、CFP 或 GFP）。若靶基因的纯合或异等位基因破坏导致可见表型（例如与眼色素相关的基因），则对该性状的筛选应依据在哪个发育阶段更容易观察到表型变化而定。</li>
		<li>根据实验设计所定义的结果参数，按此方案持续进行所需世代数。 
		&#8203;注意：每一代（以血餐为界）约持续三周。通常当所有蚊虫均被判定为对基因驱动元件呈纯合状态，或携带至少一个拷贝基因驱动元件的蚊虫比例达到最大并趋于稳定时，试验即告终止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 基因驱动蚊子的非重叠世代试验（图5）。
<ol>
	<li>笼具设置
	<ol>
		<li>针对每种特定的转基因雄蚊与野生型（WT）雄蚊释放比例，分别设置三个重复的0.005 m3笼具种群（例如，分别设置三组重复笼具，每组对应1:1、1:3和1:10的释放比例）。所有笼具中雄蚊和雌蚊的总数应保持一致。 
		注： 补充文件 是一个视频，演示了0.005 m3种群笼具的构建过程。
		<ol>
			<li>在三个重复笼具中，每个笼具加入50只转基因雄蚊、50只野生型雄蚊和100只野生型雌蚊，以实现1:1的雄蚊释放比例。</li>
			<li>在三个重复笼具中，每个笼具加入25只转基因雄蚊、75只野生型雄蚊和100只野生型雌蚊，以实现1:3的雄蚊释放比例。</li>
			<li>在三个重复笼具中，每个笼具加入9&#160;只转基因雄蚊、90只野生型雄蚊和100只野生型雌蚊，以实现1:10的雄蚊释放比例。 
			注：可测试不同的释放比例，起始实验所用蚊虫数量也可相应调整。但需注意蚊虫数量过低对统计分析的影响。本实验为单次释放，后续世代不再补充任何转基因雄蚊。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>种群维持与筛选
	<ol>
		<li>使用人工饲血装置（图2B），连续两天为每个笼具中4–7日龄的雌蚊提供血液餐。 
		注：雌蚊的常规血液餐采用市售血液来源（如小牛血），通过饲血装置提供。仅在较大笼具（0.216 m3）中为提高取食效率时，才使用活体麻醉小鼠提供血液餐。</li>
		<li>在第二次血液餐后第3天，放入产卵容器。3天后取出产卵容器。 
		注：在此步骤中，可根据需要从每个笼具中随机选取5–10只雌蚊，单独放入小管中，以评估其他适合度参数，如生育力和繁殖力。</li>
		<li>对笼内所有成蚊（包括死亡和存活个体）进行性别鉴定，并将其储存于-80°C用于分子分析。</li>
		<li>孵化卵后，从1:1和1:3比例的笼具中随机选取200只L1幼虫，用于建立下一代的新笼具种群。 
		注：由于1:10比例笼具中起始转基因个体频率较低，随机取样可能导致下一代转基因后代过度丢失，无法维持种群延续。</li>
		<li>为确保1:10比例笼具的准确取样并获得足够数量的转基因蚊虫，应对所有幼虫进行显性标记筛选，并根据观察到的转基因频率选择200只幼虫建立新笼具。 
		注：当1:10比例笼具中转基因频率达到或超过80%时，可与1:1和1:3比例笼具采用相同方式进行维持。</li>
		<li>从每个笼具中随机选取500只幼虫进行深入分析。在荧光体视显微镜下检测幼虫和蛹阶段预期的标记表型，并记录成蚊的性别&#160;（图3）。 
		注：可选择“异常”表型个体进行进一步杂交和分子分析，以监测抗性等位基因的形成。</li>
		<li>本方案可根据实验设计中定义的结果参数，持续进行多代。 
		注：每一代以血液餐为界限，周期约为三周。通常当所有蚊虫均被判定为基因驱动构建体的纯合子，或转基因蚊虫在种群中达到最大流行率并趋于稳定时，试验终止。此外，表型筛选将取决于转基因蚊虫中整合的显性标记和启动子（例如DsRed、CFP、GFP），或靶基因是否表现出可见表型（例如与眼色素相关的基因）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li>
<li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).</li>
<li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li>
<li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Vector-Borne+and+Zoonotic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li>
<li>CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. (6th Edition). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf">http://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf</a> 1(2020).</li>
<li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li>
<li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li>
<li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+Vectors%22%5BJournal%5D)">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70(2019).</li>
</ol>

作者无披露信息。

具有阻断病原体能力或携带不育基因的基因工程蚊子构成了控制虫媒传播疾病的新工具。鉴于这些替代策略涉及多种参数，其研究中的关键步骤是在实验室受控条件下进行实验评估，以快速、安全地预测为控制目的释放合成转基因可能带来的结果1。
由于在封闭种群中对转基因动态的监测可能持续数月，因此实验方案的一个核心方面是在重复实验之间保持实验设计的一致性（包括蚊虫饲养、笼具尺寸、年龄结构化种群、固定的释放比例、稳定的血液饲料来源以及 minimally invasive 筛查程序）。
仅释放雄性蚊子被认为是理想策略，因为雄性蚊子既不传播病原体，也不吸食人血，因此可安全地将可遗传性状引入野生种群。在实验室笼养实验中，有可能检测到某些转基因品系存在雄蚊交配竞争力下降以及其他与转基因整合相关的适合度负荷。然而，可通过直接且特定的实验（例如在大型笼中进行的实验10）来更准确地分析雄蚊的竞争力以及在更接近自然密度条件下的雌蚊繁殖力2。此外，笼养试验获得的实证数据可用于对笼内种群动态模型进行参数化，包括抗性等位基因的形成，并为所提出技术的有效性及可能的优化调整提供有用信息。
此处描述的实验方案可根据需要轻松适配于其他实验设计，对常规昆虫饲养设施和条件的要求极低。此外，除商用饲养笼和显微镜外，大多数材料成本低廉，可实现低成本的多次重复实验和迭代测试。值得注意的是，该方案还允许在小型饲养笼试验中对多个转基因品系进行预筛，从而优先选择表现最优的候选品系进入分阶段测试流程，并暂停对表现不佳品系的进一步测试。
最后，由于人们对使用转基因生物存在担忧，因此有必要制定相关框架，以指导蚊媒疾病防控遗传策略的开发、评估和应用5,8,9。本文所定义的实验方案的相关性和实施过程均符合这些指导原则。

基于基因工程蚊子的策略正在被用于控制媒介传播病原体的传播，例如引起疟疾的病原体1。这些策略包括两类技术：1）旨在减少按蚊（Anopheles）的数量和密度（种群压制）；或 2）旨在削弱媒介传播导致人类疾病寄生虫的能力（种群修饰、替换或改造），即通过基因工程使媒介表达能够阻断病原体传播的效应基因。CRISPR/Cas9 基因驱动技术的出现推动了这些遗传学方法的发展，在笼养蚊群中已实现有效传播携带性状以及抗寄生虫效应分子的概念验证。
小型实验室笼具试验是分阶段推进转基因品系进一步应用于野外之前，评估其特性的第一步2。具体的结果评估因素包括在竞争环境中导入DNA的遗传性、表型的外显率和表达强度，以及稳定性。相关的实验设计要素包括笼具尺寸、蚊虫密度、重复次数、世代是否重叠、具有年龄结构的目标种群、工程品系的单次或多次释放、仅雄性、仅雌性或混合性别的释放、释放比例、血液来源（人工或活体动物）以及筛选程序。
本文描述了用于评估按淹没式释放（无基因驱动系统）的按蚊品系以及携带由Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA）介导的自主基因驱动系统的按蚊品系的实验方案。这些方案的应用见于Pham et al. (2019)2、Carballar-Lejarazú et al. (2020)3 和 Adolfi et al. (2020)4。
大量释放试验通过将大量转基因蚊子多次释放到野生种群中，评估在孟德尔遗传模式下所设计的转基因的扩散速率。在转基因未与基因驱动系统相连的情况下，大量释放试验的数据可提供&#160;有关目标转基因在稳定种群中的适合度和动态变化的信息。
当蚊群中含有自主基因驱动系统时，需设计小型笼具试验，通过测定单次引入转基因雄蚊后显性标记的增加速率，来评估目的转基因扩散的动力学特征。自主基因驱动元件携带编码Cas9核酸酶、gRNA以及显性标记的基因，这些基因以特定方式连锁，可在后续世代中持续发挥作用。
“重叠”世代是指在同一笼中同时存在多个世代，以形成具有年龄结构的连续种群，而“非重叠”世代则是指每个连续的笼养种群中仅存在单一的离散世代2。一旦能够确定基因驱动（转化）速率的初始动态，基因驱动笼养实验即可终止（具体为8至10个世代，取决于构建体），这类实验虽然能够提供有关转基因在蚊群中短期稳定性的信息，但可能无法揭示当显性标记频率达到或接近完全引入（即每只蚊子至少携带一份基因驱动系统拷贝）时所发生的情况。

<table><tbody><tr><td>人工饲喂器</td><td>Hemotek</td><td>SP6W1-3</td><td>入门套装 &amp;ndash; 含6个带3ml储液器的饲喂器</td></tr><tr><td>商用饲养笼</td><td>BioQuip</td><td>1450D</td><td>可折叠饲养笼，24 × 24 × 24&quot; - 0.216 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; (60 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>笼桶（爆米花型）</td><td>Amazon.com</td><td>VP170-0006</td><td>0.005 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; (170 fl oz)</td></tr><tr><td>带荧光光源和滤光片的解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>胶棒</td><td>Michaels</td><td>88646598807</td><td>胶棒40支装，&amp;nbsp; 0.4×4&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>热熔胶枪</td><td>Woodwards Ace</td><td>2382513</td><td>Stanley，40瓦，GR20</td></tr><tr><td>尼龙网筛（网布）</td><td>Joann.com</td><td>1102912</td><td>塔夫绸，宽108&quot; × 50码 - 约35.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (14 in&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>产卵杯</td><td>Fisher</td><td>259126</td><td>聚丙烯刻度烧杯，50 mL</td></tr><tr><td>刀片切割工具</td><td>Office Depot</td><td>487899</td><td>美工刀</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Office Depot</td><td>978561</td><td>Scotch Precision Ultra Edge 钛涂层不粘剪刀，8&quot;</td></tr><tr><td>订书机</td><td>Office Depot</td><td>908194</td><td>Swingline 商用桌面订书机</td></tr><tr><td>外科套袖（弹力网套）</td><td>VWR</td><td>56612-664</td><td>从整卷材料上裁下约48 cm (19&amp;rdquo;)，整卷宽约15 cm (6&amp;rdquo;) × 长约23 m (25码)</td></tr><tr><td>扎带</td><td>Home Depot</td><td>295715</td><td>100条/包，14&amp;rdquo; 扎带 - 35.6 cm (14 in)</td></tr></tbody></table>

小型笼具中对基因工程按蚊的实验室试验

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

利用基因改造媒介控制蚊媒病原体已被提议作为补充传统防控策略的一种有前景的工具。基于CRISPR的归巢基因驱动系统使转基因技术在科学界更易于获取。在小型实验室笼具试验中评估转基因蚊子的表现，并将其与野生型同类进行比较，可为后续的野外笼具实验和实验性评估提供宝贵数据，以优化疾病预防策略。本文介绍了在实验室环境中用于评估疟疾按蚊媒介中转基因扩散的三种不同方案。这些方案包括淹没式释放（无基因驱动系统）、基因驱动重叠世代试验以及非重叠世代试验。这三种试验在多个参数上有所不同，可根据所需的实验条件进行调整。此外，在小型笼具中开展的昆虫饲养研究是工程化昆虫从实验室逐步过渡到开放环境释放的重要环节。因此，本文所述的方案是提供实证数据的宝贵工具，最终将有助于推动消除疟疾新技术在实地的应用。

如“方案”部分所述，已构建携带非基因驱动或自主型基因驱动修饰的转基因按蚊&#160;，并用于笼养试验。此处展示的代表性结果来自Pham et al.（2019）2对斯氏按蚊（Anopheles stephensi）开展的笼养试验中表现最佳的重复实验，用以描绘表型动态变化。三项试验（分别为试验1–3：淹没式非基因驱动、重叠式基因驱动和非重叠式基因驱动）在多个参数上有所不同，例如笼子大小（0.216 m3 与 0.005 m3）、目标种群是否具有年龄结构、血液餐来源（小鼠或人工饲喂装置）以及释放比例。为便于展示，图6汇总了三种试验方案在相同释放比例（1:1）下，历经七代的观测数据。
1:1 非驱动释放达到 &#62;6-7代内实现80%的转基因引入率。在基因驱动转基因笼养试验中，无论非重叠还是重叠释放方案，以1:1比例释放均能在3-4代内达到该水平，从而验证了单次释放基因驱动系统在转基因引入方面可比非驱动的淹没式释放更高效。这一更快的引入趋势也可通过趋势线的斜率得以确认。尽管两种基因驱动方案的实验设置不同，但其趋势线角度和斜率变化相似。在观察期结束时，非驱动组笼内约80%个体携带转基因，而基因驱动组笼内则达到完全（或接近完全）的转基因引入。使用本方案开展的各个实验的完整数据及处理细节详见Pham的图1-3。 等 (2019)2，Carballar-Lejarazú 的图 2-3 等 (2020)3 和图3&#160;阿道菲 等 (2020)4.
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg" /> 
图1非驱动型大量释放试验示意图&#160; 九个 0.216 m3 笼中放入60只野生型二龄（混合性别）幼虫。从第3周开始，每周为雌蚊提供一次血餐，并收集卵并孵化。在第8周之前，每周随机选取60只幼虫放回各自对应的笼中，以在笼内建立年龄结构化的种群（初始阶段）。从第9周开始，将9个笼子根据转基因雄蚊与野生型雄蚊的释放比例随机分为三组重复，进入实验阶段。A组笼子（对照组）不添加转基因蛹；每周为雌蚊提供一次血餐，收集卵并孵化，将孵化的幼虫饲养至蛹期，然后将30只野生型雄蛹和30只野生型雌蛹重新放入原笼中。1:1组笼子额外添加30只转基因雄蛹。1:0.1组笼子额外添加300只转基因雄蛹。从9个笼子中各随机选取300只幼虫，检测荧光标记。该程序被重复执行&#160;每周一次，直至转基因固定（经过几代后转基因型与野生型蚊虫的比例趋于稳定）。改编自 Pham 等 (2019)2.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg" /> 
图2。笼养蚊群的吸血过程。&#160;&#160;(A) 对于0.216 m3的大笼或0.005 m3的小笼中的雌蚊，分别提供麻醉小鼠或(B) Hemotek血液饲喂装置进行吸血。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg" /> 
图3非驱动、重叠基因驱动和非重叠基因驱动笼养试验的表型筛选&#160; 转基因或野生型表型的幼虫、蛹和成虫的荧光图像。在此示例中， An. stephensi 个体通过眼睛中由3xP3启动子驱动的DsRed标记（DsRed+ 或 DsRed-）进行筛选，该标记在三个发育阶段均可见；成虫 дополнительно进行性别筛选（&#9792; 或 &#9794;）。注意野生型幼虫中肠内食团相关的背景荧光。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg" /> 
图4. 基因驱动重叠式笼养试验示意图。&#160;&#160;根据基因驱动型与野生型雄性释放比例，设置六个0.216 m3的笼子，每种处理设三个重复。每个笼子中加入120只野生型雄性和120只野生型雌性。基因驱动型雄性释放比例为1:1的笼子额外添加120只转基因雄性；释放比例为1:10的笼子额外添加12只转基因雄性。在转基因完全引入之前，每隔3周为成年雌性提供血餐，并收集卵并孵化。每次随机选取240只幼虫，放回各自对应的笼子中。另随机选取300只幼虫进行显性标记筛选，随后在蛹期和成虫期进一步筛选眼色和性别。原始笼子中不再额外添加转基因雄性。改编自 Pham et al. (2019)2。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg" /> 
图5。非重叠基因驱动笼试验示意图。&#160; 根据基因驱动型雄蚊与野生型雄蚊的释放比例，设置三组重复的9个小型（0.005 m3）笼子。在雄蚊释放比例为1:1的笼子中，加入100只野生型雌蚊、50只野生型雄蚊和50只基因驱动型雄蚊；在雄蚊释放比例为1:3的笼子中，加入100只野生型雌蚊、75只野生型雄蚊和25只基因驱动型雄蚊；在雄蚊释放比例为1:10的笼子中，加入100只野生型雌蚊、90只野生型雄蚊和9只基因驱动型雄蚊。雌蚊提供血液餐以产卵，所产卵被收集并孵化。对于1:1和1:3组的笼子，每代随机选取200条幼虫用于建立下一代的新笼子，与亲代分开饲养；另随机选取500条幼虫饲养至蛹期，并在此阶段筛选显性标记基因。随后将这500个蛹饲养至成虫，按性别进行统计。所有剩余的幼虫也进行标记基因检测。对于1:10组的笼子，在第1至12代中对所有幼虫进行基因型鉴定，并根据现有转基因频率随机选取200条幼虫用于建立下一代的新笼子。从第13代开始，这些笼子的设置方式与1:1和1:3组完全相同。改编自 Pham et al. (2019)2 和 Carballar-Lejarazú et al. (2020)3。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg" /> 
图6不同种群替换笼养试验中转基因固定动力学的预测结果&#160;&#160;Pham 所进行的每次笼养试验中表现最佳的重复组的预期表型动态示意图 等 (2019)2，持续监测了7代。实验设置详见《实验方案》。预测结果基于9个实验中1:1释放模型的数据（每种三种不同笼试实验方案均设三个重复）。X轴表示初次引入后的世代数，Y轴表示随时间推移携带DsRed标记表型（DsRed+）的幼虫比例。虚线代表数据的线性趋势线。DsRed+表型由至少含有一个修饰等位基因拷贝所致，因此结果反映了转基因在基因驱动系统加速下的传播情况，在观察期结束时达到（接近）完全引入。有关重复实验间的变异及实验的完整详细数据，请参见Pham 等 (2019)2，Carballar-Lejarazú R 等（2020）3 以及 Adolfi A 等人（2020）4图片改编自 Pham TB 等人（2019）《疟疾媒介蚊虫的实验性种群改造》 Anopheles stephensi. PLOS 遗传学 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A 等. (2020) 疟疾蚊媒中高效的种群修饰基因驱动救援系统 Anopheles stephensi. 自然通讯 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 以及 Carballar-Lejarazú R 等（2020）用于改造疟疾媒介蚊虫种群的下一代基因驱动技术 Anopheles gambiae. 美国国家科学院院刊 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充文件：0.005 m3 蜂群饲养笼的构建。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588 Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文报告的方案展示了在实验室封闭的小型笼具试验中评估用于病媒控制的基因工程蚊子性能的三种替代方法。每种方案均根据蚊子品系所携带的特定修饰（基因驱动或非基因驱动）以及所测量参数的类型进行定制。

利用基因改造媒介控制蚊媒病原体已被提议作为一种有前景的工具，以补充传统防控手段……

本文所述方案适用于在小型实验室笼具试验中评估转基因蚊子的性能，并将其与野生型蚊子进行比较。小型笼具试验对于提供实证数据至关重要，这些数据将有助于推动新型疟疾消除技术的实际应用。该笼具试验方法可适应其他实验设计，也适用于评估特定转基因在种群中扩散动态的潜在风险。在引入转基因个体后，通过设置三个0.216立方米的笼子（每个设置三个重复）来启动实验的初始阶段，并在连续三周内每周向每个笼子中加入60只二龄野生型幼虫。每周为每个笼中的成年雌性提供麻醉小鼠作为血液餐源，并在血液餐后三天提供产卵容器。每周收集各笼中的卵进行孵化。从第四周到第八周，随机选取60只二龄L2幼虫，放回各自对应的饲养笼中。第九周时，随机指定一组三份重复的饲养笼作为对照组，其余每组分别用于设定不同的释放比例。每周向对照组饲养笼中添加60只野生型蛹，其中包含30只雄性和30只雌性。每周向每个相应的笼子中加入30只转基因雄性蛹和60只野生型蛹，以维持1:1的比例。对于1:0.1的比例，每周向每个相应的笼子中加入300只转基因雄性蛹和60只野生型蛹。每周重复向笼内添加蚊蛹，提供血液餐并孵化卵。从每个笼子中随机选取总共 300 头幼虫进行筛选。在体视显微镜下使用荧光滤光片，检测幼虫和蛹阶段荧光显性标记的表达情况。记录所获得蛹的性别。在基因驱动实验中，采用屏障策略，将蚊子饲养在安全的昆虫饲养室内，并遵循标准操作程序进行定期监测。为每种所需的转基因雄蚊与野生型雄蚊释放比例，准备两组三重复的0.216立方米笼具。为实现1:1的雄蚊释放比例，向每个重复组笼具中加入120只转基因雄蚊、120只野生型雄蚊以及处于蛹阶段的雌蚊。使用麻醉的小鼠为每个笼子中4至7日龄的雌蚊提供血餐。在幼虫盘中孵化卵后，从每个笼子中随机选取约240条一龄L1幼虫，饲养至化蛹，然后将其放回各自的笼子中。按照之前所述的方法，对幼虫进行眼标记和性别表型的筛选与鉴定。为每个特定的转基因雄蚊与野生型雄蚊释放比例，设置三个重复的0.005立方米笼具，每个笼具中雌雄数量相等。使用人工饲喂装置，对每个笼具中4至7日龄的雌蚊连续两天提供血液餐。第二次血餐后三天，放入产卵容器，并在三天后移除容器。按性别统计笼内所有死亡和存活的成虫数量后，将其在零下80摄氏度保存，用于分子分析。孵化卵并挑选200条L1幼虫，将这些幼虫单独培养以建立下一代的新笼群。然后从每个预留的笼中随机选取另外500条幼虫用于筛选。将选定的200只幼虫饲养至蛹期，另将500只幼虫饲养至四龄幼虫阶段。将来自200个培养皿的蛹转移至新笼中用于繁殖。如前所述，随机选取幼虫筛选眼标记和性别表型。在代表性分析中，展示了不同种群替换笼式试验方案下表现最佳的重复组中预期的表型动态。结果显示，在七代内，携带 DsRed 标记表型的幼虫比例呈线性增加。以 1:1 比例释放非基因驱动型个体时，七代内转基因引入率略高于 80%。基因驱动技术在三到四代内即实现了这一目标。从而验证了单次释放基因驱动系统在转基因引入方面可能更为高效。在观察期结束时，转基因在基因驱动系统中的扩散已接近完全引入。重要参数，例如释放比例、种群年龄结构、笼具大小等，将根据实验目的和具体目标而有所不同。可开展用于评估适合度参数（如生育力和繁殖力）的实验。此外，笼养试验中获得的更多实证数据可用于对种群动态的数学模型进行参数化。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

基因工程按蚊的小笼实验室试验

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接种 Anopheles gambiae 利用微珠诱导并测量蚊子黑色素化免疫反应

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在野外可视化评估杀虫剂对病媒蚊虫的防治效果

提出了一种无血人工饲料的配制方案，用于饲养 按蚊属...

一种无需血液的按蚊饲养食谱

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex...

使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

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定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

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Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

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有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

本实验方案描述了如何测量埃及伊蚊（Aedes...

量化转基因中的适合度代价 埃及伊蚊 蚊子

了解基因工程按蚊小笼实验室试验的操作流程，评估转基因蚊子的性能表现，比较其与野生型对照组的差异，为疟疾防控新技术的实施提供实证数据支持。

小型笼具中对基因工程按蚊的实验室试验

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