冈 比亚按蚊 胚胎的显微注射方法

显微注射技术对于将外源基因引入蚊子的基因组至关重要。该协议解释了詹姆斯实验室使用的一种方法，该方法将DNA构建体微注射到 冈比亚按蚊 胚胎中以产生转化的蚊子。

该协议具有重要意义，因为它为冈比亚按蚊提供了一种特定的显微注射方法，这在历史上很难使用常见的基因工程技术进行转化。这种技术的主要优点是它可靠地产生转基因冈比亚按蚊。该技术的应用通过促进产生适合抑制种群或改变野生型冈比亚按蚊种群的蚊子，扩展到消除疟疾的新策略。

这种方法可以很容易地适应不同的蚊子种类。我们的显微注射技术需要耐心和实践。有一个学习曲线。

首先，使用吸气器将20至30名雌性放入透明的50毫升锥形管中。确保管子的两端被切开，一端覆盖乳胶牙科薄膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸，蚊子将在那里产卵。将充满蚊子的管子放入装满双蒸馏水的小培养皿中，然后将管子和培养皿置于28摄氏度的培养箱中45分钟。

从培养箱中取出试管，然后将试管插入空笼中。轻轻敲击管子，让蚊子飞出。一旦所有的蚊子都飞了出来，就从笼子里取出管子。

当管子没有蚊子时，拧下底圈，取下尼龙，然后用镊子小心地从管子中取出带有鸡蛋的滤纸。将装满鸡蛋的滤纸放入装有一层水润湿的滤纸的塑料培养皿中。将膜放在干净的载玻片上，并使用干净的镊子用一张滤纸覆盖膜，留下约一毫米的膜过滤器。

用去离子水润湿滤纸，然后用刷子轻轻地将30至50个胚胎转移到膜的边缘，并沿着膜垂直排列卵子。将卵子朝向同一方向，以便在显微注射显微镜下观察卵子时，后端处于向下位置并与针头形成15度角。用卵子排列膜的整个边缘。

使用微量加载器尖端用两微升DNA混合物填充针头。将针插入针座并连接自动压力泵管。对齐指针，使其与幻灯片的平面成 15 度的角度。

通过小心地触摸第一个卵子打开针尖，然后将针尖插入后极约10微米处。成功的注射将导致卵子内细胞质的小运动。使用显微镜同轴载物台对照移动到下一个卵子继续注射。

为了确保针尖保持打开并且没有堵塞，请在进入另一个胚胎之前按下注射按钮，并可视化针头开口处的小液滴。如果针头堵塞，请按"清除"按钮清除针头并重复液滴可视化测试。如果针尖开口稍大，请根据需要调整压力，以确保液滴尺寸保持较小。

用一根针头注射约40至50个卵。注射完成后，将鸡蛋冲洗到衬有滤纸并装满50毫升去离子水的玻璃容器中。使用该协议，将自主基因驱动系统插入冈比亚按蚊实验室菌株G3的种系中。

该系统旨在针对该物种第三条染色体上的基本同源物或Agcd。图中显示了质粒pCO37。它含有化脓性链球菌Cas9内切酶，由纳米基因同源物的调节元件控制。

此外，它具有在U6基因启动子和表达青色荧光蛋白的3XP3 CFP显性标记盒的控制下引导RNA。分子方法验证了约10千克碱基对DNA的准确插入，该DNA被命名为AgNosCd-1。广泛的后续分析表明，AgNosCd-1在驱动时效率很高，产生较少的抗性等位基因，并且由于基因驱动系统的整合和表达而没有主要的遗传负荷。

含有蚊子的纯合子基因驱动是功能丧失突变体，幼虫，蛹和新出现的成虫具有红眼表型。在尝试这种方案时，保持在88对于孵化浅灰色的蛋和避免白色的蛋至关重要。