Name: 冈 比亚按蚊 胚胎的显微注射方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 学习冈比亚按蚊胚胎显微注射技术，掌握将外源基因导入蚊卵的方法。该技术可稳定培育转基因蚊子，为疟疾防治和媒介生物学研究提供可靠工具。

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我们感谢Drusilla Stillinger、Kiona Parker、Parrish Powell和Madeline Nottoli在蚊虫饲养方面提供的帮助。本研究由加州大学欧文分校疟疾倡议项目提供资金支持。AAJ是加州大学欧文分校的Donald Bren讲席教授。

1. 准备受微注射的蚊子
<ol>
	<li>将约100只雄性和200-300只羽化后1-2日龄的雌性成蚊放入一个笼子（~5000 cm3）中，使其交配2天13。</li>
	<li>交配期结束后，使用人工饲血装置提供2 mL血液，或根据昆虫饲养室的操作惯例使用活体麻醉动物为蚊子提供血餐14。次日再提供第二次血餐，以确保所有已交配的雌蚊都有机会吸血，并使部分吸血的蚊子完全吸饱。</li>
	<li>在第二次血餐后的2-4天内收集蚊子的胚胎。 
	&#8203;注意：幼虫期的营养对成虫的健壮性和繁殖适应性至关重要。有关健康昆虫的饲养方法，请参见Benedict等（2020）14。当使用人工饲血器或活体麻醉动物喂养蚊子时，产卵量未观察到显著差异。可采用昆虫饲养室中常规用于Anopheles gambiae的方法。</li>
</ol>
2. 胚胎制备
<ol>
	<li>使用吸虫器将20-30只雌蚊放入一个透明的50 mL锥形管中，该锥形管已被带锯切割成两端开口，一端覆盖乳胶牙科膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸（图1）。 
	注意：蚊子会将卵产在滤纸上，尼龙网可确保滤纸牢固固定。蚊卵呈圆柱形，长约500 µm，最宽处直径约200 µm，前后两端逐渐变细（图2）。</li>
	<li>将装有蚊子的管子放入盛有双蒸水（ddH2O）的小型（60 mm × 15 mm）培养皿中，并将管子和培养皿置于28 °C的培养箱中孵育45分钟（图3）。</li>
	<li>从培养箱中取出管子，将其插入一个空的饲养笼中。轻轻敲击管子，使蚊子飞出，待所有蚊子飞出后将管子从笼中移除。</li>
	<li>当管子中无蚊子后，拧开底部环，取下尼龙网，并用镊子小心地将带有卵的滤纸从管中取出。将滤纸放入一个塑料培养皿（100 mm × 15 mm）中，培养皿内含一层用ddH2O润湿的滤纸。</li>
	<li>观察卵的状态。当卵老化至呈浅灰色时（图4），即可用于后续的排列操作。
	<ol>
		<li>若卵仍为白色，则将其放回培养箱，并每隔5分钟检查一次颜色。白色卵较为脆弱，容易破裂，注射后存活率低，导致孵化率下降。</li>
		<li>呈深灰色或黑色的卵已过度老化，不可使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胚胎排列
<ol>
	<li>用剃刀裁剪一块尼龙印迹膜（2 cm × 1 cm），确保边缘整齐。 
	注意：如果边缘不平整，卵在注射过程中将无法牢固地附着在膜上。</li>
	<li>将膜放置在玻璃上&#160;将膜用一张滤纸（2 cm × 2 cm）覆盖，滤纸略小于膜，留出约 1 mm 的膜边缘不被覆盖（图5). 
	注意：使用前确保显微镜载玻片清洁，并使用洁净的镊子操作膜滤器。</li>
	<li>用去离子水润湿滤纸2O型卵在长时间干燥后会死亡。 
	注意：不要在纸片上滴加过多水分，否则胚胎在注射过程中会移动，但需确保有足够的水分以防止胚胎干燥图6A，B）。可用滤纸吸去多余的水分.</li>
	<li>用画笔（0号）轻轻将30–50枚胚胎转移至膜的边缘。在载玻片上轻轻滚动胚胎，使卵垂直排列于膜上，腹面（凸面）朝上。</li>
	<li>将所有卵子朝向同一方向排列，以便在显微注射显微镜下观察时，卵子的后端（较尖的一端） 图6A，B）处于下压位置，并与针头形成约15°的夹角（图6C). 用卵（30–50枚）沿膜的整个边缘排列，并将载玻片置于显微镜下进行注射。 
	注意：仔细挑选卵子。弃去白色（过嫩或未发育）或深灰色（过老，易导致针头断裂）的卵子，以及形态异常的卵子图7). 确保滤纸始终保持湿润.</li>
</ol>
4. DNA 提取
<ol>
	<li>使用无内毒素的质粒DNA大提试剂盒，按照制造商提供的操作说明，纯化用于注射的质粒DNA。</li>
	<li>将DNA重悬于PCR级水中，在4 °C条件下，于冷冻离心机中以17,100 × g 离心30分钟。随后，将上清液&#160;转移至新的洁净1.5 mL离心管中。小心使用微量移液器操作，避免将柱中不需要的颗粒物质转移。</li>
	<li>使用十分之一体积的3 M醋酸钠和两倍体积的100%乙醇对DNA进行第二次沉淀。&#160;</li>
	<li>将DNA重悬于300–500 µL PCR级水中，使质粒终浓度达到1000 ng/µL。将质粒混合物加入注射缓冲液中，使质粒终浓度为300–400 ng/µL，并分装为10–20 µL每份。 
	&#8203;注意：DNA可在-20 °C保存。若含有RNA组分，显微注射用分装样品应保存于-80 °C；否则可保存于-20 °C。注射混合液中DNA浓度不得超过800 ng/µL，否则因黏度过高会导致注射针头堵塞。</li>
</ol>
5. 针头准备
<ol>
	<li>使用程序化微量移液器拉制仪拉制10 cm石英毛细管，以制备针头。</li>
	<li>在显微镜下检查针头，确保尖端成型良好。应确保程序化拉制仪的设置能使针尖在距末端约0.5 mm处开始逐渐变细，并最终形成细尖（见图6）。容易断裂的针头通常 taper 段过长。 
	注意：具体条件可能因针头拉制仪型号而异（作者可根据请求提供其所用程序化拉制仪的设置参数，但因期刊限制，无法提及特定品牌）。针头也可手工拉制，但该技术需要大多数实验室不具备的操作技能。</li>
</ol>
6. 胚胎显微注射
<ol>
	<li>使用微加载尖端将 2 µL DNA 混合物注入针头中。将针头插入针头架，并连接自动压力泵管路（图 8）。</li>
	<li>重要提示：调整针头位置，使其与载玻片平面成 15° 角（图 8）。</li>
	<li>通过轻轻触碰第一个卵来打开针尖，并将针尖插入卵的后极，插入深度 ≤ 10 µm，进行注射。成功的注射会导致卵内细胞质出现轻微移动。</li>
	<li>使用显微镜同轴载物台控制装置移动至下一个卵，继续注射。
	<ol>
		<li>为确保针尖保持通畅且未堵塞，在进入另一个胚胎前按下“注射”按钮，并观察针尖开口处形成的小液滴。</li>
		<li>如果针头发生堵塞，按下“清除”按钮以疏通针头，并重复液滴观察测试。若针尖开口略有扩大，可根据需要调整压力，以确保液滴大小保持较小。</li>
		<li>每根针头可注射约 40–50 个卵。 
		注意：务必始终保持滤纸湿润。对针头保持足够的回压以维持通畅。若针头无法疏通，则必须更换新针头。使用具有同轴控制功能的显微镜进行胚胎定位、针头插入和注射操作将更为便捷（图 9）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成注射后，将卵冲洗到铺有滤纸并盛有 50 mL 去离子 H2O 的玻璃容器中（图 10）。 
	注意：胚胎通常在注射后 2 天开始孵化，可能需要 3–5 天时间。孵化出的一龄幼虫必须立即转移（每日检查两次）至含有水和食物的洁净容器中。</li>
</ol>

<ol><li>Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeramisco%2C+J+%22Microinjection.+Methods+and+Tools+in+Biosciences+and+Medicine%22">Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine</a>. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).</li>
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<li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pragmatic+selection+of+larval+mosquito+diets+for+insectary+rearing+of+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着CRISPR/Cas9等精确且灵活的基因工程技术的日益普及，转基因生物的构建比以往更加直接和稳定。这些工具使研究人员能够创建转基因蚊媒品系，在实现对病原体不敏感（种群修饰）或可遗传不育（种群抑制）等理想特性方面已非常接近目标。然而，为了开发出尽可能安全且稳定的转基因蚊虫，还需创建并评估更多的转基因品系，以筛选出最适合开展野外研究的最优品系。本文所述方案可提高冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）转基因个体的制备效率，从而推动更多适用于种群修饰与种群抑制策略的候选品系的开发。
本文所述的显微注射操作使用了在常规进行蚊虫或其他节肢动物媒介显微注射的实验室中可能已具备的设备和材料。在整个实验流程中保持对细节的关注至关重要。如果在选择优质卵子等步骤上仓促行事，或省略如第二次DNA沉淀等关键步骤，将会影响实验结果，导致孵化率降低和转化效率下降。此外，若在蚊虫饲养过程中未加以细致管理，操作中也会遇到诸多困难。在过度拥挤的环境中饲养或营养不足的蚊虫所产的卵数量较少且质量较差14，这将造成显微注射工作流程中的瓶颈，延长...

显微注射技术自20世纪初以来已被用于对生物体进行实验性操作1。该技术已被用于研究基本的生物学功能，和/或在目标生物体中引入重要的生物学改变。显微注射技术尤其受到媒介生物学研究者的关注，并被广泛应用于媒介基因组的改造2-11。节肢动物媒介中的转基因实验通常旨在通过降低媒介的适应性或增强其对所传播病原体的抗性，从而使媒介传播病原体的效率降低。蚊子可传播多种人类病原体，对全球范围内的发病率和死亡率具有显著影响。Anopheles 属蚊子传播人类疟疾寄生虫病原体&#160;Plasmodium spp.&#160;。针对Anopheles 蚊子的基因工程实验旨在更深入地理解其生物学特性，并降低其作为媒介的传播能力，以推动新型疟疾根除策略的开发。
在全球范围内引起最多疟疾感染的蚊媒属于Anopheles gambiae种复合体。然而，大多数成功的转基因实验都是在印度次大陆的疟疾媒介Anopheles stephensi上进行的。尽管已存在大量实验室驯化的Anopheles gambiae品系，但文献中报道的转基因Anopheles gambiae spp.品系数量远不及Anopheles stephensi。人们认为，与Anopheles stephensi相比，Anopheles gambiae胚胎更难进行显微注射并实现成功的转基因，但造成这些差异的原因尚不清楚。本方案描述了一种通过显微注射实现Anopheles gambiae胚胎转基因的、已被证实持续有效的方法。该方案基于Hervé Bossin和Mark Benedict先前开发的方法12，并增加了一些额外的细节和改进，这些改进已被证明可提高转基因效率。

<table><tbody><tr><td>10x 显微注射缓冲液</td><td>-</td><td>-</td><td>1 mM NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液，pH 6.8，50 mM KCl</td></tr><tr><td>印迹膜（Zeta-Probe GT 基因组检测印迹膜）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td>整齐地切成 2x1 cm 的片状</td></tr><tr><td>50 ml 锥形管（一次性离心管，聚丙烯）</td><td>Fisher Brand</td><td></td><td>末端切割</td></tr><tr><td>去离子水或双蒸馏水（ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)&amp;nbsp;</td><td>Mili-Q</td><td></td><td>在洗瓶中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>解剖显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Leica MZ12</td><td>用于胚胎定位</td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5号大小&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃容器&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>编号 3140</td><td>125 x 65</td></tr><tr><td>载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>No. 12-549-3</td><td>75x26 毫米</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Barnsted 实验室线</td><td>型号 150</td><td>28 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>50 mM</td></tr><tr><td>乳胶牙科薄膜&amp;nbsp;</td><td>Crosstex International</td><td>19302号</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>XenoWorks 数字显微注射仪</td></tr><tr><td>微量移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td></td><td>20 &amp;micro;L 微量移液器吸头 epT.I.P.S.</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>XenoWorks 微操作仪</td></tr><tr><td>微量移液器&amp;nbsp;</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td></td><td>20 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>Sutter P-2000 微量移液器拉制仪</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>DM 1000 LED 或 M165 FC</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>最小纤维滤纸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>No. 05-714-4</td><td>厚层析纸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蚊子&amp;nbsp;</td><td>MR4，BEI资源</td><td></td><td>冈比亚按蚊，交配后的成年雌蚊，羽化后4-5天内吸血</td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1 mM，pH 6.8</td></tr><tr><td>尼龙网</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>布利克</td><td>05831-7040</td><td>细，4/0号</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>塑料，（60×15 mm，90×15 mm）</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;3M</td></tr><tr><td>石英玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>No. QF100-70-10</td><td>带细丝，1 mm 外径，&amp;nbsp; ID 0.7 10 厘米长度</td></tr><tr><td>PCR级水&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>03315843001</td><td></td></tr></tbody></table>

anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

胚胎显微注射技术对于多种昆虫物种的分子和遗传学研究至关重要。该技术能够以稳定且可遗传的方式，将编码目的基因及优良性状的外源DNA片段导入昆虫生殖系。由此获得的转基因品系可用于研究外源DNA表达所导致的表型变化，以回答基础科学问题，或用于实际应用。尽管该技术原理简单，但需要研究者具备耐心并经过反复练习，才能掌握高效操作所需的技能。本文展示了一种针对非洲疟蚊Anopheles gambiae胚胎的显微注射方法。其目标是通过显微注射将外源DNA递送至胚胎中，使其被发育中的生殖细胞（极细胞）所吸收。注射的DNA若表达转座酶、整合酶、重组酶或其他核酸酶（例如CRISPR相关蛋白Cas），可触发一系列反应，促使该DNA共价插入染色体中。利用这些技术所获得的转基因An. gambiae已广泛应用于免疫系统组分、与吸血相关的基因以及嗅觉系统元件的基础研究。此外，这些技术还被用于培育具有特定性状的An. gambiae品系，这些性状可能有助于控制疟原虫的传播。

Carballar-Lejarazú 等人5的研究中展示了本文所述显微注射方案的一个代表性应用实例。该研究旨在将一个自主型基因驱动系统插入实验室品系 G3 的An. gambiae种系中。该系统被设计用于靶向该物种第三号染色体上的cardinal同源位点（Agcd），该位点编码一种血红素过氧化物酶，可催化3-羟基犬尿氨酸转化为眼色素（ommochrome）生物合成的最后一步产物——黄色眼色素（xanthommatin）（图11）。携带纯合基因驱动的蚊子为cardinal基因功能缺失型突变体，其幼虫、蛹及新羽化的成虫均表现为红眼表型。含有该驱动系统的质粒pCO37可在An. gambiae nanos基因同源物的调控元件控制下表达Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）内切酶，同时在An. gambiae U6基因启动子控制下表达一段23个核苷酸的向导RNA（gRNA），并包含一...

显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles gambiae胚胎显微注射DNA构建体以产生转基因蚊子的方法。

Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

胚胎显微注射技术对于多种昆虫物种的分子与遗传学研究至关重要。该技术提供了一种将外源DNA导入的方法……

本方案具有重要意义，因为它提供了一种针对冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的特异性显微注射方法，而该物种历来难以通过常规基因工程技术进行转化。该技术的主要优势在于能够稳定地创制转基因冈比亚按蚊。该技术的应用前景涵盖疟疾根除的新策略，通过创制适用于种群压制或改造野生型冈比亚按蚊种群的蚊子，推动相关研究的发展。该方法可轻松适用于不同的蚊虫种类。我们的显微注射技术需要耐心和练习，存在一定的学习曲线。首先，使用吸虫器将20至30只雌蚊放入一个透明的50毫升锥形管中。确保该管两端均被切开，一端覆盖乳胶牙科膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸，蚊子将在该端产卵。将装有蚊子的管子置于盛有双蒸水的小型培养皿中，然后将管子和培养皿放入28°C的培养箱中孵育45分钟。从培养箱中取出试管，将其插入一个空的笼子中。轻轻敲击试管，使蚊子飞出。待所有蚊子都飞出后，将试管从笼子中移除。当管内无蚊子时，拧开底部环，取下尼龙网，并用镊子小心地将带有卵的滤纸从管中取出。将附有卵的滤纸放入一个塑料培养皿中，培养皿内预先放置一层用水润湿的滤纸。取一张膜置于干净的载玻片上，用干净的镊子将一小片滤纸覆盖在膜上，保留约一毫米的膜过滤区域不被覆盖。用去离子水润湿滤纸，然后用刷子轻轻将30至50个胚胎转移到膜的边缘，并沿膜垂直排列卵子。将卵子朝向同一方向摆放，以便在显微注射显微镜下观察时，卵子的后端朝下，并与注射针成15度角。沿膜的整个边缘排满卵子。使用微载样头吸取两微升（2 µL）DNA 混合物以填充针头。将针头插入针座，并连接自动压力泵管路。调整针头方向，使其与载玻片平面成 15 度角。通过轻轻触碰第一个卵子来打开针尖，然后将针尖插入卵子后极约10微米处。成功的注射会导致卵子内部细胞质出现轻微移动。使用显微镜同轴载物台控制装置移动至下一个卵子，继续注射。为确保针尖保持通畅且未堵塞，在进入另一个胚胎前按下“注射”按钮，并观察针尖开口处形成的小液滴。如果针尖发生堵塞，请按下“清除”按钮以疏通针尖，并重复进行液滴观察测试。若针尖开口略有变大，可根据需要调整压力，以确保液滴大小保持较小。每根针注射约40至50枚卵。注射完成后，将卵冲洗至一个内衬滤纸并装有50毫升去离子水的玻璃容器中。采用此方案，已将一个自主基因驱动系统插入到冈比亚按蚊G3实验室品系的生殖系中。该系统旨在靶向该物种第三条染色体上的核心直系同源基因（Agcd）。图示为质粒pCO37，其包含受nanos基因直系同源物调控元件控制的化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9内切酶。此外，该系统包含一个由U6基因启动子调控的引导RNA，以及一个表达青色荧光蛋白的3XP3 CFP显性标记盒。分子学方法证实了约10千碱基对DNA的准确插入，该序列被命名为AgNosCd-1。后续的深入分析表明，AgNosCd-1在基因驱动中效率很高，产生的抗性等位基因极少，并且由于基因驱动系统的整合与表达未引起显著的遗传负荷。携带纯合基因驱动的蚊子为功能缺失型突变体，其幼虫、蛹和新羽化的成虫均表现为红眼表型。在实施本方案时，将温度维持在88至关重要，以确保良好的孵化率，获得浅灰色虫卵，并避免出现白色虫卵。

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遗传学

冈 比亚按蚊 胚胎的显微注射方法

斯氏按蚊是分布在印度及整个亚洲的疟疾传播媒介。本视频展示了对该蚊种进行显微注射的技术，通过导入可使蚊子对疟疾产生抗性的外源基因。本视频所展示的大部分方法同样适用于其他蚊种的显微注射技术。...

显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

在本视频中，Nijole Jasinskiene 演示了用于创制转基因埃及伊蚊（Aedes...

埃及伊蚊胚胎显微注射获得转基因蚊子

在本视频中，我们通过显微注射展示了在Anopheles胚胎中利用phiC31介导的位点特异性外源基因整合技术。该方法有助于将目的基因导入宿主系统，用于科研与工业应用。...

phiC31整合酶介导的定点转基因整合：一种用于将转基因特异性整合至基因组位点的显微注射技术 按蚊属 载体

在本视频中，我们通过胚胎显微注射技术，将基因驱动载体导入冈比亚按蚊（Anopheles...

蚊虫胚胎显微注射：一种将外源DNA递送至胚胎卵黄的技术 Anopheles gambiae 生成生殖系突变

研究发育机制和基因调控网络需要能够产生形态异常胚胎的方法。Patiria...

一种对Patiria minata受精卵进行显微注射的方法

通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换...

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

学习冈比亚按蚊胚胎显微注射技术，掌握将外源基因导入蚊卵的方法。该技术可稳定培育转基因蚊子，为疟疾防治和媒介生物学研究提供可靠工具。

Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

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