用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

小规模质膜分离方案结合mGFPHis双标签，为在真核模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表征膜蛋白提供了一种经济、快速、可靠且简便的方法。该技术最大的优势在于能够快速、简便地确定膜蛋白的表达水平、ATP酶活性以及最适合其纯化的去垢剂。该技术具有很高的用户友好性。

但需要牢记的一个重要要点是，应在 OD 600 为 2 时收获细胞，这可确保线粒体污染最低，并获得尽可能高的 ATP 酶活性。首先，在 30 摄氏度、200 转/分钟的条件下，将单个酵母菌落预培养于 10 毫升 YPD 培养基中 7 至 8 小时。然后取 10 毫升预培养物接种于 40 毫升新鲜 YPD 培养基中。

然后将细胞在30摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养，直至细胞密度达到OD 600为1至3。次日，通过在4摄氏度、4,200 ×g条件下离心5分钟，收集40个光密度单位（ODU）的对数期细胞。用40毫升冰冻的无菌双蒸水重悬并洗涤细胞。

用1毫升预冷的冰水重复洗涤，并在每次洗涤步骤之间进行离心。将沉淀重悬于1毫升预冷的无菌冰水中，然后将细胞悬液转移至预先在冰上预冷的1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以3,300 ×g离心3分钟收集细胞。

吸弃上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升新鲜添加了1毫摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF）的匀浆缓冲液中。将细胞悬液于-80摄氏度保存，直至后续使用。在冰上解冻细胞约一小时。

然后向500微升细胞悬液中加入冰冷的直径为0.5毫米的二氧化硅珠，使总体积达到1毫升。为了破碎细胞，将细胞悬液在最大振荡强度下涡旋震荡1分钟，重复6个循环，每个循环之间在冰上冷却3分钟。涡旋处理后，用加热的手术刀片在管底打一个细小的孔，通过低速离心10秒，将破碎的细胞匀浆收集到另一个预冷的1.5毫升微量离心管中。

将收集的细胞匀浆在4°C条件下以5,156 × g离心5分钟，以去除细胞碎片。取450 µL上清液转移至预冷的1.5 mL微量离心管中，加入1 mL预冷的匀浆缓冲液（含1 mM新鲜PMSF）。为分离血浆膜，将细胞悬液在4°C条件下以17,968 × g离心1小时。

弃去上清液，加入100 µL新配制的含有1 mM PMSF的匀浆缓冲液。然后用100 µL移液枪头轻轻搅拌，使质膜沉淀松散，并通过反复吹打重悬沉淀。使用与含有还原剂和去污剂的缓冲液相容的蛋白检测试剂盒，测定质膜制备物的蛋白浓度。

将质膜储存在负80摄氏度，或置于冰上以立即使用。在组装好的凝胶装置中加入四到五毫升分离胶，加至距顶部两厘米处。小心地在上层覆盖一到两毫升0.1% SDS，并在室温下静置60分钟，使聚丙烯酰胺凝胶充分凝固。

一小时后，从已聚合的分离胶上移除0.1% SDS层，并用双蒸水冲洗凝胶以去除残留的SDS。将浓缩胶混合液倒入分离胶上。将梳子插入浓缩胶中，并除去梳子周围的气泡。

然后在室温下静置 60 分钟，使浓缩胶凝固。取出梳子，用水冲洗胶孔。将凝胶放入电泳槽中，并用运行缓冲液将电泳槽加满至顶部。

取5至10微升质膜样品，与等体积的2倍蛋白上样缓冲液混合，立即将样品混合物加入凝胶的各个加样孔中，并浸没于电泳缓冲液中。在单独的加样孔中加入分子量范围为10至245千道尔顿的蛋白质分子量标记物，以便对各个蛋白质条带的大小进行估算。以200伏电压进行凝胶电泳，直至蓝色上样染料迁移至凝胶底部。

使用凝胶成像系统检测凝胶中的原位GFP荧光。荧光成像后，在室温下将凝胶加入10至20毫升蛋白质凝胶固定液中，轻轻振荡15分钟以固定蛋白质。随后用10毫升双蒸水漂洗两次，每次10分钟，然后将凝胶置于10毫升胶体考马斯亮蓝染色液中，在室温下轻轻振荡染色1小时，以显示蛋白质条带。

为了更清晰地观察蛋白质条带，在使用凝胶成像系统记录图像之前，用20毫升双蒸水脱色一次或两次，每次一小时。使用阳性对照质粒PS2对酿酒酵母A D Delta Delta进行转化，获得了较高的转化频率。阴性对照未获得Eurocell Prototron转化子。

在将转化后的AD Delta Delta细胞接种于CSM缺失尿嘧啶（URA）平板并培养三天后，获得了约50个URA营养型CDR1-mGFPHis转化子。无法在YPG琼脂平板上生长的小菌落（petite）转化子被剔除。采用凝胶内荧光法对不同浓度的CDR1-mGFPHis样品进行定量分析。

mGFP 荧光强度在整个浓度范围内呈线性关系，且背景荧光极低。通过改变细胞密度发现，裂解 40 ODU 的细胞可获得质量最高且 CDR1 ATPase 活性最高的质膜。然而，质膜的产量随细胞密度的增加而相应增加。

通过SDS-PAGE检测了31种具有不同性质的去垢剂对AD Delta Delta、CDR1-mGHPHis细胞粗制质膜中CDR1-mGHPHis蛋白的增溶能力。其中，β-和α-DDM以及Fos-choline 13是增溶CDR1-mGHPHis效果最好的去垢剂。然而，Fos-choline 13会导致CDR1-mGHPHis发生部分水解。

使用1%去垢剂溶解的粗制质膜蛋白，通过Superose 6 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱进行分离。麦芽糖苷和LMNG提取的蛋白洗脱图谱显示，大部分CDR1-mGHPHis以形状良好的高斯峰在15.5毫升处洗脱；而用含葡萄糖的去垢剂溶解的CDR1-mGHPHis则表现为聚集态或宽幅聚集峰。DDM条件下的较高峰表明，大量由DDM溶解的CDR1-mGHPHis可能已发生变性。

在FSCC色谱图中，两性离子型Fos-胆碱和两种非离子型去垢剂中，仅Digitonin的色谱图与DDM相似。Fos-胆碱13呈现对称且尖锐的峰形，但其洗脱体积显著低于DDM。优化的双重标签还提高了纯化产率，并有助于确定膜蛋白的定位、转运及热稳定性。

异源表达技术还可用于高通量药物筛选，以及对多种其他膜蛋白的详细表征。