Name: 用于分析 念珠菌 Cdr1-mGFPHis分析的小尺度等离子膜制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习小规模质膜分离技术用于分析酿酒酵母中ABC转运蛋白Cdr1的表达与ATP酶活性。该方法经济快速，利用mGFPHis双标签实现膜蛋白的高效表征，为膜蛋白研究提供可靠工具。

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作者们衷心感谢新西兰马斯登基金（项目编号 UOO1305）以及泰国曼谷朱拉隆功大学医学院提供的项目经费（M. Niimi）。他们感谢奥塔哥大学为 G. Madani 提供的博士奖学金。作者们还希望感谢斯特凡·劳瑟教授及其同事阿米尔·阿佩尔鲍姆博士和戴瓦纳亚加巴里亚蒂·维纳亚甘博士，在 G. Madani 于德国多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所（MPIMP）为期六个月的访问期间所提供的支持与指导。作者们同时感谢德国学术交流中心（DAAD）为 G. Madani 提供的研究资助（项目编号 57381332），以支持其访问 MPIMP。

1. 制备新鲜或冷冻的感受态ADΔ和ADΔΔ细胞菌种
<ol>
	<li>用单个酵母菌落接种25 mL的2x YPCD培养基[即2x YPD；2% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 蛋白胨，4% (w/v) 葡萄糖，0.079% (w/v) 完全补充混合物(CSM)]35，在30 °C、200转/分钟(rpm)振荡条件下过夜(o/n)培养16小时。</li>
	<li>用25 mL&#160;过夜培养物接种225 mL的2x YPCD培养基，并检测细胞在600 nm处的光密度(OD600)；OD600通常约为0.5–1.0。 
	注意：在此阶段，请确保后续转化实验所需的所有材料均已准备就绪。</li>
	<li>继续在30 °C、200 rpm振荡条件下培养约6–8小时，直至细胞密度达到OD600约6–8。 
	注意：除非另有说明，以下所有步骤均在室温(RT)下进行。</li>
	<li>在3,000 x g条件下离心3分钟，收集处于对数生长期的细胞。</li>
	<li>用无菌的双蒸水(ddH2O)将细胞重悬并洗涤两次（即先用200 mL，再用20 mL）。</li>
	<li>在3,000 x g条件下离心3分钟，收集细胞。</li>
	<li>在冰上将细胞沉淀缓慢重悬于X mL的FCC溶液[5% (w/v) 甘油，10% (v/v) 二甲基亚砜(DMSO)]中（即每分钟加入1份，共30等份，持续30分钟）（其中X = OD600；例如，若OD600 = 6，则用6 mL重悬；若OD600 = 3，则用3 mL重悬）。 
	注意：正确的FCC溶液组成对转化成功至关重要。</li>
	<li>转化前将细胞置于冰上保存2小时，或分装后储存于-80 °C备用。 
	注意：ADΔ和ADΔΔ细胞对冷冻极为敏感。因此，必须缓慢降温至-80 °C：将装有50–600 µL细胞分装液的冰冻微量离心管放入塑料储存盒中（室温RT）。将该盒放入较大的聚苯乙烯容器中（室温RT），并用匹配的聚苯乙烯盖子封好，然后将容器放入-80 °C冰箱中。 
	&#8203;警告：缓慢冷冻对细胞存活至关重要。</li>
</ol>
2. 将 CaCDR1-XLmGFPHis 转化至 ADΔ 和 ADΔΔ 中，并通过菌落 PCR 和 DNA 测序验证正确转化子
注意：质粒 pABC3-CDR1-mGFPHis 是通过 Lamping 等人（2010）55 中详细描述的传统克隆策略构建的，如图 1B所示。野生型C. albicans CDR1 以 PacI/NotI 片段的形式从质粒 pABC3-CaCDR1A-GFP14 中分离，并克隆至 pABC3-XLmGFPHis26 中。
<ol>
	<li>PCR 扩增整个 CDR1 使用高保真DNA聚合酶和引物对PDR5-pro/PDR5-ter扩增的转化盒35 使用1-10 ng的pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis作为DNA模板，或者 alternatively，消化2 &#181;用10 U限制性内切酶将pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis完全消化 AscI 在 37 &#176;C (图1A，B). 
	注意： CDR1 转化盒（图 1A) 包括 PDR5 启动子 - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 终止子 - URA3 筛选标记 - PDR5 下游区段</li>
	<li>进行琼脂糖凝胶电泳，并从凝胶中回收约8 kb的转化盒。 
	注意：对约 8 kb 的凝胶纯化 CaCDR1 转化盒可去除任何可能未被消化的质粒DNA，从而避免产生错误的转化子——这些转化子可能将完整的质粒而非线性化的转化盒整合到基因组中 PDR5 基因座</li>
	<li>将所需量的鲑鱼精子载体DNA（2 mg/mL；10 mM Tris，1 mM EDTA；pH 7.5）置于沸水浴中变性10分钟，随后置于冰上保存。煮沸鲑鱼精子DNA时应使用螺旋盖试管，以防止管盖松开。</li>
	<li>混合 50 &#181;变性鲑鱼精子DNA的L值为14 &#181;L 转化盒（500–2,000 ng），并保留 64 &#181;将DNA混合物置于冰上保存，直至进一步使用。 
	注意：使用 10 ng 的一种 E. coli-酵母穿梭质粒（例如 pYES2）作为阳性转化对照（图2B).</li>
	<li>将新鲜或经5分钟快速解冻的冻存感受态细胞重悬于30 &#176;C 水浴并将其分为 50 &#181;1.5 mL 微型离心管中的等分试样。</li>
	<li>通过离心收集细胞，在微型离心机中以最大速度（18,000 × g）离心1分钟 g).</li>
	<li>移除上清液，将细胞沉淀置于室温。</li>
	<li>每次转化时，混合 296 &#181;260种组合（RT） &#181;50% (w/v) 聚乙二醇（PEG 3350）溶液 36 L &#181;1 M 醋酸锂（LiAc）溶液，通过反复吹打混匀，加入适量的 64 &#181;冰浴中的DNA混合物，体积为L。</li>
	<li>立即向50 &#181;L感受态细胞沉淀等分试样。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 360 &#181;用移液器充分涡旋震荡约30秒，将PEG-LiAc-DNA混合物混匀。</li>
	<li>将细胞混合物在 30 °C 下孵育 &#176;37°C 水浴 1 小时。 
	注意：AD&#916; 和 AD&#916;&#916; 细胞在30℃下转化效果更佳 &#176;C 而非 42 &#176;C35.</li>
	<li>在18,000 x g下收获细胞 g 10 秒。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 80 &#181;升 ddH₂O2O.</li>
	<li>将细胞涂布于CSM-URA琼脂平板上35 [即 0.67% (w/v) 无氨基酸酵母氮源基础培养基、0.077% (w/v) 缺尿嘧啶的 CSM、2% (w/v) 葡萄糖和 2% (w/v) 琼脂]</li>
	<li>在30℃下孵育平板2-3天 &#176;待尿嘧啶原养型转化子明显可见后，继续培养。 
	注：预期每微克质粒DNA可获得约100个转化子 &#181;约 8 kb 的线性 CaCDR1 转化盒和约 4 x 104 每微克DNA的转化子数 &#181;g pYES2</li>
	<li>挑取五个独立的转化子，将其划线接种于新鲜的CSM-URA平板上，以分离尿嘧啶原养型转化子与未转化宿主细胞的残留物。</li>
	<li>通过在YPG-琼脂平板[1%（w/v）酵母提取物、2%（w/v）蛋白胨、2%（v/v）甘油和2%（w/v）琼脂]上培养转化子，去除可能存在的 petite 突变体（图 2D). 
	注意：小菌落突变体的线粒体功能缺陷，因此无法在非发酵性碳源上生长。这类突变体非常常见 S. cerevisiae56. S. cerevisiae AD&#916; 和 AD&#916;&#916; 特别容易获得微小表型。</li>
	<li>进行酵母菌落PCR，确认至少三个独立转化子已正确整合至基因组 PDR5 基因座 (图1C通过扩增整个约 8 kb 的片段 CaCDR1 使用经过优化的特定DNA聚合酶扩增来自不纯DNA模板来源的PCR产物的转化盒。采用一组结合在整合位点外侧的引物。 &#181;L ddH₂O 中的细胞悬液等分试样2O）以单菌落来源的DNA为模板。 
	注意：这种特定的DNA聚合酶能够从完整的酵母细胞中可靠地扩增约8 kb的PCR片段。然而，为了实现可靠的扩增，需要进行45个PCR循环，并且必须将酵母细胞重悬于OD600 1-10 在 ddH₂O 中2O.</li>
	<li>通过1 μL DNA琼脂糖凝胶电泳确认正确的约8 kb PCR扩增产物 &#181;PCR 反应的 L 部分。</li>
	<li>去除10 μL扩增引物过量产物 &#181;按照制造商的说明，在测序之前，取PCR反应的L部分，用单链DNA外切核酸酶和磷酸酶的酶混合物处理DNA样品，再使用适当的引物对处理后的DNA样品部分进行完整ORF的测序。</li>
</ol>
3. 小规模酵母质膜分离方案
<ol>
	<li>培养酵母细胞
	<ol>
		<li>将单个酵母菌落接种于10 mL YPD培养基中，于30 °C、200 rpm振荡培养约7–8小时。</li>
		<li>取10 mL预培养液接种至40 mL YPD培养基中，30 °C过夜（约16小时）振荡培养（200 rpm），直至细胞密度达到OD600为1–3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集酵母细胞
	<ol>
		<li>在4 °C、4,200 × g条件下离心5分钟，收集40 OD单位（ODU；例如，OD600为1时1 mL = 1 ODU）的对数生长期细胞。</li>
		<li>用冰冻的无菌ddH2O洗涤细胞两次（分别为40 mL和1 mL；每次洗涤后在4 °C、4,200 × g离心5分钟）。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL冰冻的无菌ddH2O中，并将细胞悬液转移至预冷（置于冰上）的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在4 °C、3,300 × g条件下离心3分钟，收集细胞。</li>
		<li>吸除上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于0.5 mL匀浆缓冲液[HB；50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 20% (v/v) 甘油；pH 7.5]中，该缓冲液需新鲜添加1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。 
		注：PMSF需现用现加，因其遇水后迅速失活。 
		注意：PMSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有强腐蚀性并对组织有破坏作用，可能造成不可逆的眼部损伤。</li>
		<li>将细胞悬液置于-80 °C保存或&#160;立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质膜的分离
	<ol>
		<li>若细胞已冷冻，则在冰上解冻约1小时。</li>
		<li>向0.5 mL细胞悬液中加入冰冻的直径为0.5 mm的玻璃珠，使总体积达到1 mL。</li>
		<li>以最大振荡强度涡旋振荡1分钟，随后在冰上冷却3分钟，重复此过程共6个循环，以破碎细胞。</li>
		<li>用加热的手术刀片在管底打一小孔。</li>
		<li>将装有破碎细胞匀浆的离心管插入另一预冷的1.5 mL微量离心管中，低速（约200 rpm）离心10秒，使匀浆液从管底小孔流出。 
		注：此步骤可确保玻璃珠保留在原管中。</li>
		<li>在4 °C、5,156 × g条件下离心5分钟，去除细胞碎片、未破碎细胞及细胞核。</li>
		<li>将450 µL上清液转移至冰冻的1.5 mL微量离心管中，并加入额外1 mL含新鲜PMSF（1 mM）的冰冻HB缓冲液。 
		&#8203;注：此稀释步骤对高质量回收质膜蛋白至关重要。</li>
		<li>在4 °C、17,968 × g条件下离心1小时，收集质膜沉淀，并通过反复吹打将其重悬于100 µL新鲜添加1 mM PMSF的HB缓冲液中。在释放100 µL HB前，先用100 µL移液枪头轻轻搅拌细胞沉淀，以充分松散沉淀，确保质膜均匀分散。</li>
		<li>使用适用于含还原剂和去垢剂缓冲液的蛋白定量试剂盒测定质膜制备物的蛋白浓度。</li>
		<li>将质膜样品置于-80 °C保存，或置于冰上以供立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
<ol>
	<li>组装用于制备聚丙烯酰胺凝胶的装置。</li>
	<li>配制两块分离胶（7%聚丙烯酰胺），混合2.1 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、3 mL 4×分离胶缓冲液（1.5 M Tris，0.4%十二烷基硫酸钠[SDS]（w/v）；pH 8.8）和6.9 mL ddH2O。加入8 µL四甲基乙二胺（TEMED）和60 µL 10%过硫酸铵（APS）以引发丙烯酰胺的聚合反应。 
	注意：丙烯酰胺/双丙烯酰胺具有高毒性，可引起皮肤刺激、周围神经病变，且为致癌物。TEMED若吞咽或吸入有害。APS若吞咽有害，可引起严重的眼部和皮肤刺激。</li>
	<li>将约4–5 mL上述混合液倒入已组装的凝胶装置中，加至距离顶部约2 cm处。</li>
	<li>小心地在上层覆盖约1–2 mL 0.1% SDS，以形成平整的弯月面。</li>
	<li>室温下静置约60分钟，使聚丙烯酰胺凝胶充分凝固。</li>
	<li>配制两块浓缩胶的混合液：混合0.5 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1 mL 4×浓缩胶缓冲液（0.5 M Tris，0.4% SDS（w/v）；pH 6.8）和6.9 mL ddH2O。加入2 µL TEMED和30 µL 10% APS以引发丙烯酰胺聚合。</li>
	<li>从已聚合的分离胶上移除0.1% SDS层，并用ddH2O冲洗，以去除残留的SDS。</li>
	<li>将浓缩胶混合液倒入分离胶上方。</li>
	<li>插入梳子，并清除梳子周围的气泡。</li>
	<li>室温下静置约60分钟，使浓缩胶充分凝固。</li>
	<li>取出梳子，并用水冲洗加样孔。将凝胶放入电泳槽中，并用1×电泳缓冲液（24.8 mM Tris，190 mM甘氨酸，0.1% SDS）加至电泳槽顶部。 
	注意：1×电泳缓冲液由储存于室温的10×缓冲液母液（248 mM Tris，1.9 M甘氨酸，1% SDS（w/v）溶于ddH2O）稀释配制而成。</li>
	<li>取5–10 µL质膜样品（即10–20 µg蛋白），与等体积的2×蛋白上样染料[120 mM Tris-HCl（pH 6.8）、20%甘油、0.02%溴酚蓝、4% SDS、200 mM二硫苏糖醇（DTT）]混合，立即加入电泳槽中浸没于运行缓冲液的加样孔中。 
	注意：DTT若吞咽有害，可引起严重的眼部和皮肤刺激。 
	注意：配制10 mL 2×蛋白上样染料，分装后于-20 °C保存。混合后的样品切勿加热，应立即上样，以避免GFP标签变性，从而确保凝胶内荧光信号可被检测。</li>
	<li>在单独的加样孔中加入蛋白分子量标准品（分子量范围10–245 kDa），以便估算各蛋白条带的大小。</li>
	<li>以200 V进行电泳，直至蓝色上样染料迁移至凝胶底部（通常需45–55分钟）。</li>
	<li>使用凝胶成像系统检测凝胶内的GFP荧光（激发波长475–485 nm，发射波长520 nm）。</li>
	<li>完成凝胶内荧光成像后，将凝胶置于约10–20 mL蛋白凝胶固定液（40%乙醇，10%乙酸）中，室温轻柔振荡固定15分钟。</li>
	<li>用10 mL ddH2O冲洗凝胶两次，每次10分钟；随后将凝胶置于10 mL胶体考马斯亮蓝染色液中，室温轻柔振荡染色约1小时，以显色蛋白条带。</li>
	<li>为更清晰地观察蛋白条带，可在成像前用约20 mL ddH2O脱色一次或两次，每次约1小时。</li>
</ol>
5. Cdr1 ATP酶活性的测定&#160;57
<ol>
	<li>稀释质膜样品 &#62;2.2 mg/mL 至 1-2 mg/mL，在 HB 中。</li>
	<li>将ATP酶测定混合液（75 mM MES-Tris，75 mM 硝酸钾，0.3 mM 钼酸铵，7.5 mM 叠氮化钠；pH 7.5）和Mg-ATP（28.8 mM 三磷酸腺苷二钠盐，28.8 mM MgCl₂）置于相同温度下平衡2；pH 7.0）至 30 &#176;C in a 30 &#176;C 恒温培养箱 
	警告：叠氮化钠具有高毒性。 
	注意：确保所有缓冲液储备液和瓶子均不含磷酸盐；即用 1% (vol/vol) HCl 清洗玻璃器皿，并用 ddH₂O 多次冲洗。2此外，应将其与其他可能残留洗涤剂中常见磷酸盐痕迹的玻璃器皿分开存放。</li>
	<li>加入90 &#181;L 含或不含 Cdr1-ATP酶抑制剂（20 &#181;将寡霉素（M）加入96孔微孔板的各个孔中。 
	注意：该实验需设三个重复。</li>
	<li>加入5 &#181;L 的分离质膜（约 5-10） &#181;g蛋白）或磷酸盐标准品（0-100 nmol Pi）加入微孔板的相应孔中。 
	注意：将第一列和最后一列保留用于两组独立的磷酸盐标准品。</li>
	<li>开始实验，加入25 &#181;L 预热的 28.8 mM Mg-ATP（终浓度 6 mM）加入各孔中，用多通道移液器混匀后于 30 °C 孵育 &#176;30 分钟，30 °C</li>
	<li>通过加入130 μL终止反应 &#181;1.6% 的 L-抗坏血酸钠、1% 的十二烷基硫酸钠（SDS）、12% 的钼酸铵溶于 6 M 硫酸中的显色试剂溶液 
	警告：浓硫酸与水剧烈反应，具有腐蚀性，可能造成皮肤和肺部损伤。</li>
	<li>室温孵育10分钟。</li>
	<li>使用微孔板读数仪在 750 nm 处测定微孔板各孔的吸光度。 
	&#8203;注意：显色反应（即还原型磷钼酸复合物生成蓝色染料）的孵育时间必须严格控制在10分钟，因为蓝色染料的生成会随时间持续进行，这对检测结果的准确性至关重要。</li>
	<li>通过从无寡霉素存在时的总ATP酶活性中减去寡霉素存在时的ATP酶活性，计算获得Cdr1特异性ATP酶活性（即寡霉素敏感型ATP酶活性）。</li>
</ol>
6. 小规模去垢剂筛选
<ol>
	<li>将过表达 Cdr1-mGFPHis 的细胞的质膜制备物（即 2.5 mg 质膜蛋白）与 GTED-20 缓冲液 [10 mM Tris、0.5 mM EDTA、20 % (w/v) 甘油；pH 7.5；新鲜添加 1 mM PMSF] 混合，并加入 5 mg 待测去垢剂，使总体积达到 0.5 mL，并含有 1% (w/v) 去垢剂。</li>
	<li>在 4–8 °C 下，使用旋转装置旋转混合物 2 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下以 141,000 × g 离心 1 小时。</li>
	<li>将含有已溶解组分的上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>向不溶性沉淀部分加入 0.5 mL 含 2% (w/v) SDS 的 GTED-20 缓冲液，在摇床培养箱中 30 °C 过夜孵育，以提取所有去垢剂不溶性膜蛋白。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分析并比较上清液和已溶解沉淀部分。</li>
	<li>在考马斯亮蓝染色前，对含有 GFP 标签蛋白的凝胶进行胶内 GFP 荧光成像并拍照，并使用成像系统定量表达水平。</li>
	<li>将可溶性膜蛋白组分用于后续应用，例如荧光尺寸排阻色谱法（FSEC）58，以鉴定合适的去垢剂。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管膜蛋白的结构分析已取得最新进展，但目前尚无Cdr1或任何其他PDR转运蛋白的三维结构。因此，了解Cdr1的结构及其生化特征至关重要，这不仅有助于合理设计新型药物以克服外排介导的耐药性，还将揭示ABC蛋白一个重要亚家族的功能机制。
膜蛋白结构表征的主要要求之一是以X射线晶体学或冷冻电镜所需的数量表达正确折叠且完整的膜蛋白。在选择表达系统时，重要的标准包括操作的简便性、生长速率和成本，以及表达具有翻译后修饰蛋白的能力，这些修饰对蛋白的功能和/或稳定性可能至关重要61,62。
在过去的二十年中 S. cerevisiae 膜蛋白表达技术60 已优化14 以促进目标膜蛋白的一步法克隆24 在N端或C端标记了各种亲和标签、表位标签或报告标签，并且在需要时，其...

从天然脂质环境中提取膜整合蛋白可能会显著影响其结构和功能1,2,3,4。生物膜复杂的脂质组成5确保了关键的蛋白质-脂质相互作用得以发生6。脂质维持膜蛋白的结构完整性，从而使其能够在目标膜区室中正常发挥功能7,8。因此，膜蛋白纯化过程中的关键第一步是从其天然环境中提取蛋白，同时不破坏其结构和/或功能。
膜蛋白结构表征存在诸多障碍，其中大多数与膜蛋白的疏水性质有关，以及难以表达出足够数量正确折叠且具有功能的膜蛋白，以满足X射线晶体学或冷冻电子显微镜（cryo-EM）9,10,11,12的研究需求。膜蛋白表达系统主要有三种类型：同源表达系统9、异源表达系统13,14,15和体外（in vitro）表达系统16,17。由于许多表达系统表达水平较低或成本过高，目前仅有少数宿主成为生产膜蛋白的首选。这些宿主包括细菌宿主大肠杆菌（Escherichia coli）、酵母酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris），以及较高等真核生物如Sf9昆虫细胞或哺乳动物细胞系18。所有膜蛋白表达技术均有其优缺点；然而，酿酒酵母（S. cerevisiae）可能是目前研究最为深入、适用于膜蛋白生产的真核模式生物。它在基因工程、药物发现、合成生物学以及真核膜蛋白表达等方面具有高度的多功能性14,19,20,21。
在本研究中，一项已获专利的 S. cerevisiae 膜蛋白表达技术21 使用了，与 S. cerevisiae ADΔ14 和 ADΔΔ22 作为首选宿主（图1A），以过表达并研究主要的 白色念珠菌 多药外排泵 Cdr1。两者均 S. cerevisiae 菌株为AD1-8u的衍生株-&#160;23 具有以下任一特征的 ura3 (ADΔ) 或两者 ura3 和 his1 (ADΔΔ) 基因被删除，以消除因非预期整合在该位点而产生的任何尿嘧啶或组氨酸原养型假阳性转化子 URA3 或 HIS1 基因组位点。7种主要多药外排泵的缺失23，如图所示 图1A, 使ADΔΔ对大多数外源性物质极为敏感。功能获得性突变转录因子Pdr1-3导致异源膜蛋白（如Cdr1，图中红色八边形）的组成型过表达 图1A) 在含有异源ORF的转化盒整合后（图1A) 在基因组水平 PDR5 位点（蓝色矩形在 图1A) 通过两次同源重组事件实现。可通过共聚焦显微镜确认C末端mGFPHis标签蛋白是否正确地定位于质膜图1A），His标签可用于镍亲和层析纯化该标记蛋白。克隆某些真菌ABC转运蛋白（例如， Candida krusei ABC1）插入 pABC3 衍生质粒中是不可行的，因为这些质粒无法被扩增&#160;在 大肠杆菌 由于细胞毒性问题，这促使了膜蛋白一步克隆技术的开发14,24 在其N端或C端标记了各种亲和标签、表位标签或报告标签 S. cerevisiae ADΔΔ图1C). S. cerevisiae ADΔΔ菌株过表达各种 CDR1 通过使用多达五个、彼此重叠25 bp的独立PCR片段，也可高效地以此方法构建突变体（图1C）。采用该方案，可在极短时间内以较低成本高效地克隆、表达并表征大量目标ORF。每增加一个PCR片段，转化效率仅下降约2倍。
如有需要，还可通过引物设计便捷地调控表达水平，从而可预测地将表达水平调节至通常较高的组成型表达水平的0.1%至50%之间25。优化的多功能克隆载体pABC314的衍生物pABC3-XLmGFPHis26（图1B）包含HRV-3C蛋白酶切割位点（X；LEVLFQ|GP），该蛋白酶在4 °C下的活性优于常用的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶27。L为一个五氨基酸（GSGGS）连接肽，mGFP是酵母增强型绿色荧光蛋白变体yEGFP330的单体突变体（A206K）28,29，His则为一个三氨基酸连接肽（GGS）后接六组氨酸（HHHHHH）镍亲和蛋白纯化标签。
该表达技术已成功应用于药物发现及膜蛋白研究。利用此技术，首次解析了真菌唑类药物靶点S. cerevisiae Erg1131的结构。该技术还实现了对C. albicans Cdr132,33,34的详细表征，并构建了适用于半胱氨酸交联研究的半胱氨酸缺陷型Cdr1分子35，以验证未来可能获得的高分辨率结构。利用该表达平台，还深入研究了多种主要人类致病真菌中的ABC转运蛋白&#160;(即C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei以及Fusarium solani种复合体)24,36,37,38,39。这使得研究人员构建出一系列过表达外排泵的S. cerevisiae菌株，并将其用于高通量筛选，从而发现了新型荧光外排泵底物尼罗红（Nile red）40，以及特异性41和广谱性14,33,42,43,44&#160;外排泵抑制剂。该系统的应用还促成了氯吉兰（clorgyline）的发现，这是首个具有广谱活性的真菌多药外排泵抑制剂42。
要实现膜蛋白的完全溶解，并制备出不含内源性脂质的均一膜蛋白-胶束复合物，需要使用高浓度的去垢剂45。然而，不幸的是，这通常会导致膜蛋白失活5,8,45,46。去垢剂单体的性质及其在溶液中的聚集行为，受到疏水尾部物理性质的影响，包括烷基链的长度和分支结构、是否存在芳香核或氟代烷基侧链，以及聚氧乙烯单元的数量。因此，去垢剂筛选是确定最适合膜蛋白溶解与纯化的去垢剂类型的重要第一步。
C. albicans 是一种主要的人类真菌病原体，可导致免疫功能低下个体发生严重的、危及生命的侵袭性感染47，并且其可能对唑类抗真菌药物产生耐药性48,49。C. albicans 多药耐药的主要机制之一是 Cdr1 的过表达50，Cdr1 是一种位于质膜上的 ABCG 亚家族的 II 型 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白51。完整的真菌 ABCG 转运蛋白（由两个核苷酸结合域 [NBDs] 和两个跨膜域 [TMDs] 组成）通常被称为多向性药物耐药（PDR）转运蛋白，其特征为独特的倒置结构域拓扑结构 [NBD-TMD]2。PDR 转运蛋白仅存在于植物52,53 和真菌54 中。尽管其具有重要性，目前尚无 PDR 转运蛋白的结构被解析；尽管近期已解析出人类半分子 ABCG 转运蛋白的结构，从而帮助建立了 Cdr1 的首个初步模型33。然而，我们最近的实验证据表明，该模型可能存在缺陷，原因可能是真菌 PDR 转运蛋白具有特征性的不对称 NBDs，从而可能导致一种独特的转运机制。因此，获得 Cdr1 的高分辨率结构，不仅对于合理设计新型外排泵抑制剂（有助于克服外排介导的药物耐药性）至关重要，而且对于深入了解这一重要 ABC 转运蛋白家族的作用机制也具有重要意义。
本研究的目的是建立可靠的方案，用于在基因改造的S. cerevisiae表达宿主中表达、增溶和纯化Cdr1，最终目标是获得Cdr1的高分辨率结构。在此过程中，设计了一种可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签（图1B），该标签通过一段16个残基的连接序列与Cdr1的C末端分隔，从而改善了连接的6x His亲和标签与镍亲和树脂的结合，并实现了在活细胞中以及整个纯化过程中对Cdr1表达水平的监测。此外，还建立了一种可重复的小规模酵母质膜蛋白制备方案，其中含有约10%的C. albicans Cdr1（根据SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色估算），可用于Cdr1的生物化学表征。

<table><tbody><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 (Tris 碱；超纯)</td><td>Merck</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2,2-二癸基丙烷-1,3-双-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>NG310S</td><td>LMNG</td></tr><tr><td>2,2-二己基丙烷-1,3-双-&amp;beta;-D-葡萄糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>NG311S</td><td>OGNG (MNG-OG)</td></tr><tr><td>2,2-二辛基丙烷-1,3-双-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>NG322S</td><td>DMNG</td></tr><tr><td>4-反式-(4-反式-丙基环己基)-环己基 &amp;alpha;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Glycon Biochemicals GmbH</td><td>D99019-C</td><td>PCC-&amp;alpha;-M</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (37.5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>乙酸 (冰醋酸)</td><td>Merck</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Formedium</td><td>&amp;nbsp;009002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>钼酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>ATP 二钠盐</td><td>sigma-Aldrich</td><td>A-6419</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>34725-61-6</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td></td></tr><tr><td>CHAPSO</td><td>Anatrace</td><td>C317S</td><td></td></tr><tr><td>CSM</td><td>Formedium</td><td>DCS0019</td><td></td></tr><tr><td>CSM 缺尿嘧啶</td><td>Formedium</td><td>DCS0161</td><td></td></tr><tr><td>环己基-1-丁基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>C324S</td><td>CYMAL-4</td></tr><tr><td>环己基-1-庚基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>C327S</td><td>CYMAL-7</td></tr><tr><td>环己基-甲基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>C321S</td><td>CYMAL-1</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11024-24-1</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10197785103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA; Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR 产物纯化试剂</td><td>Applied Biosystems</td><td>78205</td><td>外切酶与磷酸酶的混合物</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Formedium</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Merck</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Formedium</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck</td><td>1003172510</td><td></td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>TOYOBO Co</td><td>KFX-201</td><td>用于可靠的菌落 PCR</td></tr><tr><td>乙酸锂 (LiAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546-89-4</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Formedium</td><td>145224-94-8</td><td></td></tr><tr><td>n-癸酰-N-羟乙基-葡萄糖酰胺</td><td>Anatrace</td><td>H110S</td><td>HEGA-10</td></tr><tr><td>n-癸酰-N-甲基-葡萄糖酰胺</td><td>Anatrace</td><td>M320S</td><td>MEGA-10</td></tr><tr><td>n-癸基-磷酰胆碱</td><td>Anatrace</td><td>F304S</td><td>Fos-choline-10</td></tr><tr><td>n-癸基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D322S</td><td>DM</td></tr><tr><td>n-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐</td><td>Anatrace</td><td>AZ312S</td><td>Anzergent 3-12</td></tr><tr><td>n-十二烷基-N,N-二甲基胺-N-氧化物</td><td>Anatrace</td><td>D360S</td><td>LDAO</td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;alpha;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310HA</td><td>&amp;alpha;-DDM</td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td>&amp;beta;-DDM</td></tr><tr><td>n-壬基-&amp;beta;-D-葡萄糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>N324S</td><td>NG</td></tr><tr><td>n-壬基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>N330S</td><td>NM</td></tr><tr><td>n-十八烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐</td><td>Anatrace</td><td>AZ318S</td><td>Anzergent 3-18</td></tr><tr><td>n-辛基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐</td><td>Anatrace</td><td>AZ308S</td><td>Anzergent 3-8</td></tr><tr><td>n-辛基-磷酰胆碱</td><td>Anatrace</td><td>F300S</td><td>Fos-choline-8</td></tr><tr><td>n-辛基-&amp;beta;-D-葡萄糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>O311S</td><td>OG</td></tr><tr><td>n-十四烷基-磷酰胆碱</td><td>Anatrace</td><td>F312S</td><td>Fos-choline-14</td></tr><tr><td>n-十四烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>T315S</td><td>TDM</td></tr><tr><td>n-十三烷基-磷酰胆碱</td><td>Anatrace</td><td>F310S</td><td>Fos-choline-13</td></tr><tr><td>n-十三烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>T323S</td><td>-</td></tr><tr><td>n-十一烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>U300S</td><td>UM (UDM)</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>辛基苯氧基聚乙氧基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>TRITON X-100</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Formedium</td><td>3049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;Hot Start Flex DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0535S</td><td>高保真 DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>聚乙二醇 (PEG 3350)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯山梨醇单油酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-65-6</td><td>TWEEN 80</td></tr><tr><td>硝酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8394</td><td></td></tr><tr><td>蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>5000122</td><td>RC DC 蛋白检测试剂盒 II</td></tr><tr><td>QC 胶体考马斯亮蓝染色液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Prism Ultra 蛋白分子量标准 (10-245 kDa)</td><td>Abcam</td><td>AB116028</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151-21-3</td><td>SDS</td></tr><tr><td>钠-L-抗坏血酸 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖单十二烷酸酯</td><td>Anatrace</td><td>S350S</td><td>DDS</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Formedium</td><td>008013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>不含氨基酸的酵母氮源基础</td><td>Formedium</td><td>CYN0402</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;仪器（类型）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp; (Eppendorf 5804)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 (Beckman Ultra)</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 (Sorvall RC6)</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FSEC 装置（配备荧光检测器、自动进样器和组分收集器的 NGC 层析中压系统）</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像 (GelDoc EZ 成像仪)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板读数仪 (Synergy 2 多功能检测)</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增仪 (C1000 Touch)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源 (PowerPac)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱 (Multitron)</td><td>Infors HT, Bottmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GE17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见分光光度计 (Ultraspec 6300 pro)</td><td>Amersham BioSciences UK Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 cdr1-mgfphis

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

ABC转运蛋白的生化与生物物理表征的成功在很大程度上取决于异源表达系统的选择。在过去二十年中，我们开发了一种酵母膜蛋白表达平台，已用于研究多种重要的真菌膜蛋白。表达宿主 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ADΔΔ 缺失了七种主要的内源性 ABC 转运蛋白，且含有带有功能获得性突变的转录因子 Pdr1-3，该突变可实现外源膜蛋白基因在基因组中以单拷贝稳定整合后的组成型过表达 PDR5 基因座。多功能质粒载体的构建以及一步克隆策略的优化，使得异源ABC转运蛋白的快速、准确克隆、定点突变及表达成为可能。本文中，我们描述了一种新型可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签（即单体化的酵母增强型绿色荧光蛋白yEGFP3与六聚组氨酸亲和纯化标签的融合）的设计与应用，该设计旨在避免标签对目标蛋白功能的潜在干扰，并提高His标签与镍亲和树脂的结合效率。将mGFPHis标签与膜蛋白开放阅读框（ORF）融合，可通过聚丙烯酰胺凝胶观察实现蛋白的便捷定量，并检测仍保留mGFPHis标签的降解产物。我们展示了该特性如何促进去垢剂筛选以实现膜蛋白的有效溶解。同时提供了一种高效、快速且可靠的少量质粒膜蛋白制备方案，适用于C端标记的 白色念珠菌 多药外排转运蛋白 Cdr1 过表达于 S. cerevisiae ADΔΔ 的方法。该小规模质膜分离方案可在一个工作日内获得高质量的质膜。所制备的质膜可用于测定 Cdr1 及其突变体的酶活性。

使用pYES2质粒对S. cerevisiae ADΔΔ进行转化时获得了较高的转化频率（约4 × 104 个转化子/µg）（图2B）。如预期所示，无DNA对照组（即仅加入ddH2O）未产生任何转化子，而使用1 µg线性CDR1-mGFPHis转化盒（图1A）并结合优化的ADΔΔ转化方案，获得了约50个转化子（图2C）。此外，还检测了CDR1-mGFPHis转化子在非发酵性碳源上的生长能力，以排除可能存在的线粒体功能缺陷的petite突变体。在检测的25个尿嘧啶原养型转化子中，有3个（黄色圆圈；图2D）无法在YPG琼脂平板上生长，因此被排除在后续研究之外。由新构建的菌株ADΔΔ-CDR1-mGFPHis表达的Cdr1-mGFPHis蛋白正确地定位于质膜（<strong c...

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida albicans）ABC（ATP结合盒）蛋白Cdr1。设计了一种C端可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签，标签与Cdr1之间含有16个氨基酸残基的连接序列，以促进Cdr1的纯化及去垢剂筛选。

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

ABC转运蛋白的生化与生物物理表征的成功在很大程度上取决于异源表达系统的选择。过...

小规模质膜分离方案结合mGFPHis双标签，为在真核模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表征膜蛋白提供了一种经济、快速、可靠且简便的方法。该技术最大的优势在于能够快速、简便地确定膜蛋白的表达水平、ATP酶活性以及最适合其纯化的去垢剂。该技术具有很高的用户友好性。但需要牢记的一个重要要点是，应在 OD 600 为 2 时收获细胞，这可确保线粒体污染最低，并获得尽可能高的 ATP 酶活性。首先，在 30 摄氏度、200 转/分钟的条件下，将单个酵母菌落预培养于 10 毫升 YPD 培养基中 7 至 8 小时。然后取 10 毫升预培养物接种于 40 毫升新鲜 YPD 培养基中。然后将细胞在30摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养，直至细胞密度达到OD 600为1至3。次日，通过在4摄氏度、4,200 ×g条件下离心5分钟，收集40个光密度单位（ODU）的对数期细胞。用40毫升冰冻的无菌双蒸水重悬并洗涤细胞。用1毫升预冷的冰水重复洗涤，并在每次洗涤步骤之间进行离心。将沉淀重悬于1毫升预冷的无菌冰水中，然后将细胞悬液转移至预先在冰上预冷的1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以3,300 ×g离心3分钟收集细胞。吸弃上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升新鲜添加了1毫摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF）的匀浆缓冲液中。将细胞悬液于-80摄氏度保存，直至后续使用。在冰上解冻细胞约一小时。然后向500微升细胞悬液中加入冰冷的直径为0.5毫米的二氧化硅珠，使总体积达到1毫升。为了破碎细胞，将细胞悬液在最大振荡强度下涡旋震荡1分钟，重复6个循环，每个循环之间在冰上冷却3分钟。涡旋处理后，用加热的手术刀片在管底打一个细小的孔，通过低速离心10秒，将破碎的细胞匀浆收集到另一个预冷的1.5毫升微量离心管中。将收集的细胞匀浆在4°C条件下以5,156 × g离心5分钟，以去除细胞碎片。取450 µL上清液转移至预冷的1.5 mL微量离心管中，加入1 mL预冷的匀浆缓冲液（含1 mM新鲜PMSF）。为分离血浆膜，将细胞悬液在4°C条件下以17,968 × g离心1小时。弃去上清液，加入100 µL新配制的含有1 mM PMSF的匀浆缓冲液。然后用100 µL移液枪头轻轻搅拌，使质膜沉淀松散，并通过反复吹打重悬沉淀。使用与含有还原剂和去污剂的缓冲液相容的蛋白检测试剂盒，测定质膜制备物的蛋白浓度。将质膜储存在负80摄氏度，或置于冰上以立即使用。在组装好的凝胶装置中加入四到五毫升分离胶，加至距顶部两厘米处。小心地在上层覆盖一到两毫升0.1% SDS，并在室温下静置60分钟，使聚丙烯酰胺凝胶充分凝固。一小时后，从已聚合的分离胶上移除0.1% SDS层，并用双蒸水冲洗凝胶以去除残留的SDS。将浓缩胶混合液倒入分离胶上。将梳子插入浓缩胶中，并除去梳子周围的气泡。然后在室温下静置 60 分钟，使浓缩胶凝固。取出梳子，用水冲洗胶孔。将凝胶放入电泳槽中，并用运行缓冲液将电泳槽加满至顶部。取5至10微升质膜样品，与等体积的2倍蛋白上样缓冲液混合，立即将样品混合物加入凝胶的各个加样孔中，并浸没于电泳缓冲液中。在单独的加样孔中加入分子量范围为10至245千道尔顿的蛋白质分子量标记物，以便对各个蛋白质条带的大小进行估算。以200伏电压进行凝胶电泳，直至蓝色上样染料迁移至凝胶底部。使用凝胶成像系统检测凝胶中的原位GFP荧光。荧光成像后，在室温下将凝胶加入10至20毫升蛋白质凝胶固定液中，轻轻振荡15分钟以固定蛋白质。随后用10毫升双蒸水漂洗两次，每次10分钟，然后将凝胶置于10毫升胶体考马斯亮蓝染色液中，在室温下轻轻振荡染色1小时，以显示蛋白质条带。为了更清晰地观察蛋白质条带，在使用凝胶成像系统记录图像之前，用20毫升双蒸水脱色一次或两次，每次一小时。使用阳性对照质粒PS2对酿酒酵母A D Delta Delta进行转化，获得了较高的转化频率。阴性对照未获得Eurocell Prototron转化子。在将转化后的AD Delta Delta细胞接种于CSM缺失尿嘧啶（URA）平板并培养三天后，获得了约50个URA营养型CDR1-mGFPHis转化子。无法在YPG琼脂平板上生长的小菌落（petite）转化子被剔除。采用凝胶内荧光法对不同浓度的CDR1-mGFPHis样品进行定量分析。mGFP 荧光强度在整个浓度范围内呈线性关系，且背景荧光极低。通过改变细胞密度发现，裂解 40 ODU 的细胞可获得质量最高且 CDR1 ATPase 活性最高的质膜。然而，质膜的产量随细胞密度的增加而相应增加。通过SDS-PAGE检测了31种具有不同性质的去垢剂对AD Delta Delta、CDR1-mGHPHis细胞粗制质膜中CDR1-mGHPHis蛋白的增溶能力。其中，β-和α-DDM以及Fos-choline 13是增溶CDR1-mGHPHis效果最好的去垢剂。然而，Fos-choline 13会导致CDR1-mGHPHis发生部分水解。使用1%去垢剂溶解的粗制质膜蛋白，通过Superose 6 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱进行分离。麦芽糖苷和LMNG提取的蛋白洗脱图谱显示，大部分CDR1-mGHPHis以形状良好的高斯峰在15.5毫升处洗脱；而用含葡萄糖的去垢剂溶解的CDR1-mGHPHis则表现为聚集态或宽幅聚集峰。DDM条件下的较高峰表明，大量由DDM溶解的CDR1-mGHPHis可能已发生变性。在FSCC色谱图中，两性离子型Fos-胆碱和两种非离子型去垢剂中，仅Digitonin的色谱图与DDM相似。Fos-胆碱13呈现对称且尖锐的峰形，但其洗脱体积显著低于DDM。优化的双重标签还提高了纯化产率，并有助于确定膜蛋白的定位、转运及热稳定性。异源表达技术还可用于高通量药物筛选，以及对多种其他膜蛋白的详细表征。

small-scale-plasma-membrane-preparation-for-analysis-candida-albicans

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于分析 念珠菌 Cdr1-mGFPHis分析的小尺度等离子膜制备

我们介绍一种使用96孔微孔板形成Candida...

一种基于96孔微孔板的真菌生物膜形成监测及抗真菌药物敏感性检测方法 白色念珠菌 生物膜

我们开发了一种高密度微阵列平台，该平台由名为CaBChip的白色念珠菌（C.

Candida albicans 生物膜芯片（CaBChip）用于高通量抗真菌药物筛选

我们描述了利用活细胞视频显微镜观察巨噬细胞吞噬Candida...

活细胞视频显微镜观察真菌病原体的吞噬作用

本方案描述了使用可定制的自动化微流控装置来观察生物膜形成的实验方法 Candida albicans...

生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

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使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

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使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

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澄清与成像 白色念珠菌 生物膜

本研究中采用肠道匀浆提取物和免疫荧光染色的离体检测方法，代表了一种检测胃肠道内白色念珠菌Candida albicans菌丝形态发生的 novel...

一种用于研究的离体实验方法 白色念珠菌 胃肠道中的菌丝形态发生

本方案描述了一种在人类真菌病原体Candida...

全基因组范围转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&amp;RUN方法与数据分析流程

本方案提供了利用地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）作为模式系统研究真菌感染过程中宿主-病原体相互作用的优化且详细的指南。该方法在先前使用人类真菌病原体感染涡虫的实验流程基础上进行了改进。...

一种优化的实验方案 Candida albicans 感染在 Schmidtea mediterranea 研究真菌致病机制与宿主防御

学习小规模质膜分离技术用于分析酿酒酵母中ABC转运蛋白Cdr1的表达与ATP酶活性。该方法经济快速，利用mGFPHis双标签实现膜蛋白的高效表征，为膜蛋白研究提供可靠工具。

用于分析的小规模质膜制备白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

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