数字液滴PCR检测转基因按蚊种群中的Indels突变

该协议为NHEJ分析提供了高通量和可靠的组成，可以确定基因编辑蚊子种群中Indel突变的患病率和相对数量。与下一代或Sanger测序相比，ddPCR具有更快的结果周转时间，从而可以快速，完整地分析遗传变异以田间进行转基因生物。这种方法应普遍适用于所有实验系统。

演示该程序的将是来自Yang实验室的工作人员研究助理Thai Pham。首先，通过加入ddPCR超级混合物，正反引物，HEX或FAM探针，DNA和水以文本中描述的比例制备25微升的数字液滴PCR或ddPCR样品混合物。然后通过涡旋彻底混合反应。

使用50微升多通道移液器，将20微升的ddPCR样品混合物加载到墨盒的中间行中。然后使用200微升多通道移液器将70微升的油装入底排，而不会在整个移液过程中产生气泡。放置垫圈，仅接触边缘，避开中心凹陷区域，然后将板牢固地放在液滴发生器中，并合上盖子以开始运行。

要将浸入式混合物从墨盒的顶行转移到96孔板中，请使用多通道移液器，并以30至45度的角度滴下40微升液体样品3至5秒钟。然后以45度角缓慢地将混合物排出到孔中超过三秒钟，使其从侧面下降，然后转到移液器的第二个停止点以完全排出液体。使用铝箔热封，在180摄氏度下密封板五秒钟。

将密封的板放入热循环器中，并通过将初始变性设置为95摄氏度10分钟来设置NHEJ滴落指南的PCR条件。然后，设置40个周期，从94摄氏度持续30秒即可变性，将55摄氏度从一分钟设置为退火，并将60摄氏度设置为两分钟延长。40 个周期后，将保持温度设置为 98 摄氏度 10 分钟，最后保持在 4 摄氏度。

对所有步骤使用每秒两摄氏度的斜坡速率。退火温度会根据所使用的探头或底漆而变化。将板牢固地放在液滴读取器中，并在左上角标记了A1。

打开程序并通过指定FAM作为每个孔的未知参考通道来设置板。然后，更改每个示例的名称。在保存模板的同时，将液滴读数实验作为直接定量运行。

为软件分析指定正确的实验参数，即样品信息、超级混音、靶标名称、靶标类型、信号通道一、通道二。然后，将液滴计数的阈值设置为高于10， 000以获得可靠的结果。接下来，检查液滴选项卡中每个孔的液滴计数，确保所有孔都高于10， 000。

最后，检查一维幅度，以便有效地将信号与负极分离。在印版编辑器中，突出显示整个印版，并将实验类型设置为放弃。将 WT 目标设置为参考，为 FAM 指定通道 1，为 HEX 指定通道 2。

将 NHEJ 目标设置为未知，将通道 1 指定为 FAM，将通道 2 指定为无。在"2D 振幅"选项卡中，使用图形工具为每个样本设置聚类阈值。尾部通常与 NHEJ 测定的 WT 簇相关联。

在比率选项卡下，单击图表右上角的齿轮图标，然后选择分数丰度以绘制与NHEJ事件百分比相对应的点。15种不同的10只蚊子的抽取样品，每种样品含有不同的NHEJ等位基因，使用滴定测定法进行分析和鉴定，结果显示所有15个样品均含有100%Indel等位基因。在另一项实验中，用该ddPCR方案检查了11个野生型蚊子和NHEJ蚊子的抽取样本，这些样本具有不同的NHEJ百分比。

结果表明，鉴定的百分比与扩增子分析技术的Indel检测相对接近。缓慢移液以避免气泡，并让所有乳化液滴滴落到孔壁上。