Name: 数字液滴PCR检测转基因按蚊种群中的Indels突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学习使用数字液滴PCR技术检测转基因按蚊中的Indels突变，该方法可快速定量分析NHEJ修复事件。本方案为基因编辑生物的遗传变异研究提供了高通量、可靠的检测手段。

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资金由加州大学欧文分校疟疾倡议项目提供。AAJ 是加州大学欧文分校的唐纳德·布伦教授。

1. DNA 提取
<ol>
	<li>按每份样品500 µL NLS和120 µL EDTA的比例配制EDTA/细胞核裂解缓冲液（EDTA/NLS）。若需处理多个样品，按比例放大体积。将混合液置于冰上预冷。 
	注意：根据体积不同，溶液在冰上冷却2-5分钟后会变浑浊。</li>
	<li>将蚊虫样品置于含有600 µL预冷EDTA/NLS的1.5 mL微量离心管中，使用机械匀浆器匀浆10-15秒，并充分混匀。</li>
	<li>向离心管中加入17.5 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，并充分混匀。</li>
	<li>在55 °C下孵育过夜。或者，在55 °C下以振荡方式孵育3小时，每隔1小时涡旋混匀一次。</li>
	<li>向室温样品中加入200 µL蛋白质沉淀溶液，并剧烈涡旋20秒。</li>
	<li>将样品置于冰上冷却5分钟。</li>
	<li>以15,890 RCF离心4分钟，使蛋白质沉淀。</li>
	<li>小心吸取上清液（含DNA），转移至另一洁净的1.5 mL微量离心管中，该管内已加入600 µL异丙醇。</li>
	<li>通过反复倒置离心管5-10次轻柔混匀溶液，然后以15,890 RCF离心1分钟。小心倾去上清液，注意保留DNA沉淀。</li>
	<li>加入600 µL室温70%乙醇。通过轻轻倒置离心管清洗DNA沉淀。</li>
	<li>以15,890 RCF离心1分钟，使用玻璃移液器吸头小心吸除上清液。</li>
	<li>将离心管倒置于洁净的吸水纸上，室温空气干燥沉淀10-15分钟。</li>
	<li>用PCR级水重悬DNA。单个蚊虫样品使用20 µL，10只混合蚊虫样品使用100 µL。 
	&#8203;注意：使用市售试剂盒（见材料表）提取蚊虫样品DNA的方法，系根据制造商提供的“从组织培养细胞和动物组织中分离基因组DNA”方案进行调整。</li>
</ol>
2. 数字滴定PCR反应与液滴生成准备
<ol>
	<li>使用荧光计定量DNA。 
	注意：对于脱扣检测（drop-off assay），建议每反应使用3,000–30,000个单倍体基因组拷贝的范围。该方法设计用于检测非同源末端连接（NHEJ）事件，采用HEX标记探针结合靶向切割位点的野生型（WT）序列；若靶位点发生缺失或插入，则探针无法退火（脱扣），从而指示存在NHEJ变异。</li>
	<li>根据提取物中DNA的浓度和单倍体基因组质量计算拷贝数。具体方法为：将提取DNA的浓度乘以所用体积，得到总DNA质量，再除以单倍体基因组质量。确保加入的体积在1–10 µL之间。如必要，进行稀释以达到推荐的单倍体基因组拷贝数范围。 
	注意：据估计，每只成年按蚊（Anopheles gambiae）的单倍体基因组质量约为0.27 pg10。</li>
	<li>设计引物和探针。设计上下游寡核苷酸引物，使其引物熔解温度（Tm）在55–60 °C之间，并分别位于gRNA靶位点的5'端和3'端两侧，扩增产物长度为150–400 bp。
	<ol>
		<li>NHEJ检测用HEX（六氯荧光素）标记探针：设计一条长约15–20 bp、与靶位点互补的寡核苷酸，在其5'端添加HEX荧光标记，3'端添加BHQ1（黑洞淬灭剂1）。水解探针的Tm应比引物Tm高3–10 °C。</li>
		<li>参考野生型（WT）检测用FAM（6-羧基荧光素）标记探针：设计一条长约15–20 bp、与远离靶位点（约25 bp）的保守基因组区域互补的寡核苷酸，在其5'端添加FAM荧光标记，3'端添加BHQ1。水解探针的Tm应比引物Tm高3–10 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. PCR 反应体系的准备
<ol>
	<li>配制25 µL ddPCR样本混合液，包含以下组分：探针用ddPCR超级混合液（不含UTP）：12.5 µL，正向和反向引物（10 µM）：各1 µL，HEX/FAM探针（10 µM）：各0.625 µL，DNA：1–5 µL（3,750–37,500个单倍体基因组拷贝），加水至总体积25 µL。</li>
	<li>通过涡旋振荡或反复吹打（上下移液20次）充分混匀反应体系。 
	注意：若反应体系位于96孔板中，建议通过将全部液体反复吹打20次进行混匀，避免涡旋产生气泡。</li>
	<li>短暂离心样品，使混合液沉降至管底或孔底。 
	&#8203;注意：确保反应体系处于室温条件下再进行液滴生成。每张芯片（每张芯片含8个孔）需额外为未使用孔准备1份ddPCR混合液。</li>
</ol>
4. 液滴生成
<ol>
	<li>使用50 µL多通道移液器，将20 µL的ddPCR样品混合液加入到芯片的中间排（图1A，顶部）。</li>
	<li>将70 µL油相加入到底部排，向未使用的孔中加入20 µL的1x ddPCR超混合液。 
	注意：避免产生气泡。</li>
	<li>放置垫圈时仅接触边缘，避开中心凹陷区域（图1B）。</li>
	<li>将板牢固地放入液滴生成仪中，并关闭盖子以启动运行。</li>
	<li>使用多通道移液器，将40 µL乳化混合液从芯片的上排（图1A，底部）转移至96孔板中。
	<ol>
		<li>以45–30°角吸取液体样品3–5秒。然后以45°角缓慢将混合液沿孔壁排出超过3秒，使其沿壁滴下。可将移液器压至第二档（完全排空），以确保全部液体排出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用铝箔热封膜，在180 °C下密封板片5秒。</li>
</ol>
5. PCR
<ol>
	<li>将密封的反应板放入热循环仪中（图1C），若遵循NHEJ Drop-Off操作指南，则设置以下推荐的PCR反应条件：
	<ol>
		<li>95 °C 初始变性 10 分钟。</li>
		<li>设置 40 个循环：94 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 1 分钟，60 °C 延伸 2 分钟。</li>
		<li>在 98 °C 保持 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 保持。 
		&#8203;注意：针对特定引物和探针组合的退火温度可通过温度梯度优化。所有步骤的升温/降温速率均设置为 2 °C/s。PCR反应条件应根据具体的实验设计和配置进行相应调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 液滴读取
<ol>
	<li>将反应板牢固地放入液滴读取仪中，确保A-1孔位于左上角（该角为光滑圆角，其余三个角为直角）（图1D）。</li>
	<li>在程序中设置反应板：指定FAM为已知参考通道，HEX为未知通道（图2A）。</li>
	<li>运行液滴读取实验，选择直接定量模式。运行结束后，将实验类型更改为Drop-Off（DOF）以进行数据分析（图2A）。</li>
</ol>
7. 分析
<ol>
	<li>设定正确的实验参数（图2A）：样品信息、SuperMix、靶标名称（WT 或 NHEJ）、靶标类型（Ref 或 Unknown）、信号通道1（HEX 或 FAM）、信号通道2（HEX 或 FAM），并手动设置液滴计数阈值（建议高于 10,000 以获得可靠结果）。软件将根据设定的参数执行大部分分析。</li>
	<li>在 液滴 选项卡中检查液滴数量；确保所有样品均高于 10,000（图2B）。</li>
	<li>检查 1D 振幅，以实现与阴性信号的有效分离。</li>
	<li>在 板编辑器 中，选中整块板，并将 实验类型 设置为 Drop off。</li>
	<li>将 WT 靶标设为 参考，并指定通道一为 FAM，通道二为 HEX。</li>
	<li>将 NHEJ 靶标设为未知，指定通道一为 FAM，通道二为空。</li>
	<li>在 2D 振幅选项卡中，使用图形工具为每个样品设置 聚类阈值。注意与 WT 聚类相关的拖尾现象；这在 NHEJ 检测中属于正常情况（图3A）。 
	注意：在 比率 选项卡下，点击图表右上角的 齿轮图标，选择 相对丰度。此时图表将绘制出对应 NHEJ 事件百分比的点（图3B）。</li>
</ol>

<ol><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li>
<li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive%3A+time+for+public+debate%3A+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553(2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902(2019).</li>
<li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650(2018).</li>
<li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002(2014).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li>
<li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li>
</ol>

作者无披露信息。

数字液滴PCR是一种高效的方法，用于检测基于Cas/gRNA基因驱动系统中由NHEJ事件产生的插入缺失（indel）等位基因，并可对个体或群体中这些等位基因的频率进行定量。为获得可靠结果，该实验方案中的某些步骤需特别注意。首先，基因组DNA提取必须谨慎操作，以确保DNA的质量高且数量充足。良好的提取效果有助于准确测定每反应中的单倍体基因组拷贝数。根据我们的经验，使用市售试剂盒（见材料表）可 consistently 获得高质量的DNA提取结果。然而，单只蚊子的DNA提取尤为困难，因为DNA沉淀难以观察，若操作不慎，容易随上清液被吸走。其次，引物和探针的设计必须严谨。在开展ddPCR实验之前，应先通过常规PCR扩增并利用凝胶电泳观察产物，确认所设计的引物仅产生单一PCR产物。参考FAM探针也应设计为与高度保守序列互补，以确保在遗传多样性丰富的群体中能够准确检测野生型（WT）等位基因。每个独特实验所用的引物/探针组合可能需要不同的PCR仪热循环条件，建议使用温度梯度优化这些条件。
其他用于鉴定插入缺失（indel）的方法包括Sanger测序和高通量测序（NGS）。Sanger测序存在局限性，因其检测下限较高，且发现新变异的能力较弱。此外，Sanger测序劳动强度大，通量较低。与Sanger测序相比，NGS在灵敏度、变异发现能力和通量方面均无上述限制。NGS的另一优势在于其能够检测多种类型的突变，从单核苷酸多态性（SNPs）到基因组重排均可识别。然而，在检测Cas9/gRNA相关插入缺失的应用中，NGS成本较高且耗时较长，因为该应用场景通常仅涉及一个目标区域，而NGS更适用于大规模的全基因组分析。与前述方法相比，数字滴定PCR（ddPCR）具有高通量和快速周转的优点。若实验室内部具备ddPCR所需的试剂和仪器，可在1至2天内处理96个样本，因此特别适用于对大量Cas9/gRNA修饰生物体进行快速分析。
尽管数字滴定PCR（ddPCR）具有诸多优势，但也存在一些局限性。首先，ddPCR设备在独立实验室环境中并不常见。大型研究机构可能提供共用的ddPCR设备，但这限制了在机构外部便捷地进行数据生成与分析。其次，与其它方法不同，ddPCR无法提供所鉴定出的插入缺失（indel）突变的具体唯一序列信息。数字滴定PCR能够测定群体中插入缺失突变的频率，但若缺乏序列信息，则无法判断这些插入缺失更可能维持还是破坏目标基因的功能。ddPCR方法最适合用于Cas9/gRNA介导的基因驱动生物在野外释放试验后对野生群体的分析，因为它能够高效、近乎实时地确定转基因向本地群体中的引入频率以及群体内插入缺失的产生情况。由于ddPCR具有较快的检测周转时间，若本地可获得所需材料，则在野外试验区域每周进行采样并分析群体状况是可行的。尽管在偏远地区的实验室购置、进口和安装ddPCR设备的初期成本较高，但考虑到其在严格评估驱动系统作用下野生群体动态变化方面的优势，这一投入是值得的。

基因驱动技术在控制具有医学和农业重要性的昆虫种群方面具有巨大潜力1,2,3,4,5。例如，基于CRISPR Cas核酸酶和向导RNA（gRNA）的基因驱动系统可用于改造传播疾病的蚊媒种群，通过引入对疟原虫具有抗性的性状，从而减少疾病传播并降低发病率1,4,5。该基因驱动系统可在减数分裂前的生殖细胞中将自身及关联性状从一条同源染色体复制到另一条，从而确保大多数后代继承该驱动元件，进而在野外实现持久且可持续的种群改造。然而，基于Cas/gRNA的方法存在一个缺点：通过非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制可能产生插入和缺失（indel）突变，导致出现对驱动系统具有抗性的等位基因；当这些抗性等位基因在种群中积累至足够高的频率时，便可能阻止基因驱动系统的进一步扩散1,2,3,4。本实验方案详细描述了一种高通量且可靠的方法，可用于在基于Cas/gRNA的基因驱动过程中，检测种群水平和个体水平上indel突变的发生频率及其相对含量。
新一代测序（NGS）技术提供了无与伦比的测序分辨率。然而，NGS相关的成本和技术要求限制了其作为常规检测手段的应用，也阻碍了其作为高通量方法用于插入缺失（indel）分析的推广6,7,8。传统的PCR定量方法长期以来被用作基因组插入缺失分析的标准评估手段；然而，这些方法耗时耗力，获取数据所需时间较长，且具有较高的变异性。数字微滴PCR（ddPCR）在某些应用中已被证明比Sanger测序更灵敏，并在其他一些情况下比NGS具有更低的检测限6,7,8,9。此外，与Sanger测序或NGS相比，ddPCR在样本集分析上的成本更低，结果周转时间也更短9。利用双探针系统，Drop-Off检测法通过检测gRNA引导的Cas9切割位点处野生型（WT）序列的缺失来识别NHEJ等位基因。在该检测中，使用一对特异性引物扩增包含Cas/gRNA系统预测切割位点的短扩增子&#160;。其中一条荧光探针设计为结合扩增子中的保守区域，另一条荧光探针则识别切割位点的野生型序列。当存在NHEJ等位基因时，后者将无法与扩增子结合。
数字PCR（ddPCR）的应用使得研究人员能够设计引物以靶向缺失、单碱基对差异和插入序列，从而实现对蚊群分析中的非同源末端连接（NHEJ）进行谱型分析9。鉴于这些优势特性，我们建立了一套用于在蚊子中高通量检测由Cas/gRNA介导的基因驱动系统所产生的插入缺失（indel）的ddPCR实验方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>DNA 提取试剂（例如 Wizard Genomic DNA 纯化试剂盒）</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（pH 8.0）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（符合 ACS 认证）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A416-500</td><td></td></tr><tr><td>细胞核裂解液（NLS）（Wizard Genomic DNA 纯化试剂盒）</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>PCR 级水</td><td></td><td></td><td>可使用任何经认证的 PCR 级水</td></tr><tr><td>蛋白质沉淀溶液（Wizard Genomic DNA 纯化试剂盒）</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K 20 mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96 孔板</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>Droplet Generator DG8 微流控芯片及垫圈</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>用于探针的微滴生成油</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>荧光探针（例如 FAM/HEX 探针）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>探针根据实验而定，可从任何经认证的供应商处购买。</td></tr><tr><td>正向与反向寡核苷酸引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>引物根据实验而定，可从任何经认证的供应商处购买。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 梯度热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td>可使用其他具备梯度功能和深孔模块的热循环仪</td></tr></tbody></table>

利用数字液滴pcr检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

蚊子基因组学和基因工程技术的最新进展促使人们需要快速且高效的高通量方法来检测靶向DNA序列变异。具体而言，检测由CRISPR向导RNA（gRNA）/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）在基因编辑位点产生的插入和缺失（indel）对于评估诱变的准确性以及非预期改变的发生频率至关重要。本文介绍了一种适用于高通量NHEJ分析的微滴数字PCR（ddPCR）实验方案。尽管该方法无法提供识别单个序列变异的数据，但它能够对群体内的序列变异程度进行定量估算。此外，在具备适当资源的情况下，与下一代测序或桑格测序相比，该方案更易于在野外现场实验室环境中实施。ddPCR的结果周转时间也短于上述两种方法，从而可在转基因生物的野外试验期间对野生种群的遗传变异进行更快速、更全面的分析。

该实验方法的应用见 Carballar-Lejarazú 等人9。数字滴定 PCR（ddPCR）Drop-off 检测利用两种荧光探针来区分野生型（WT）和插入/缺失（indel）序列：FAM 探针结合扩增子内的保守序列，而 HEX 探针则靶向目标位点的野生型序列（图 4A）。当存在插入/缺失突变时，HEX 探针无法结合。代表性结果可参见 Carballar-Lejarazú 等人9的图 2、表 1 和表 2。使用本方案，ddPCR 已被证实能够检测多种由 CRISPR-Cas9 诱导的非同源末端连接（NHEJ）事件，并对个体或混合样本中的 NHEJ 频率进行定量。15 个不同的混合样本（每个样本含 10 只蚊子）包含多种 NHEJ 等位基因（见 Carballar-Lejarazú 等人9的表 2），采用本研究提供的 ddPCR 方案和参数进行分析。表 19 的结果显示，所有 15 个样本均携带 100% 的插入/缺失等位基因，该结果由 Drop-off 检测确认（图 4B）。在另一项实验中，使用本 ddPCR 方案检测了 11 个混合样本，这些样本包含野生型蚊子以及具有不同 NHEJ 比例（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 和 100%）的 NHEJ 蚊子，结果（图 2；Carballar-Lejarazú 等人9）显示，该方法测定的百分比与扩增子分析法检测插入/缺失（Indel Detection by Amplicon Analysis）这一对照技术的结果相近（图 4C）。
<img alt="数字微滴PCR实验装置：微滴生成仪、PCR扩增仪、微滴读取仪，用于DNA定量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验装置与操作流程。（A）微滴生成用微孔板的制备。（上图）样品加入微孔板中间行，油相加入底部行。（下图）微滴生成后，顶部行充满乳化微滴。（B）已装入样品并盖好密封垫圈的微孔板置于微滴生成仪中。（C）96孔板经铝箔封膜后放入PCR仪中。（D）96孔板置于微滴读取仪中，金属盖板已锁紧以固定微孔板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于基因表达实验中定量分析的PCR板编辑器和液滴计数图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：液滴读取。（A）液滴读取的软件界面。橙色框表示含有样品的孔，灰色框为空孔。实验参数在右侧的编辑工具面板中设置。通过点击相应的样品框可对每个样品进行编辑。在实验类型中选择Drop Off（DOF）。在样品信息中，填写样品的名称、类型以及SuperMix。在检测信息中选择Basic Drop-Off。对于WT样品，在靶标名称中选择WT，在靶标类型中选择Ref，在信号通道1和通道2中分别选择FAM和HEX。对于NHEJ样品，在靶标名称中填写相应的名称，在靶标类型中选择Unknown，在信号通道1中选择FAM，信号通道2保持为None。（B）多个样品的液滴计数结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示插入缺失分布和百分比变异分析的二维图及比率/丰度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：脱扣（Drop-Off）检测分析。（A）野生型（WT）和非同源末端连接（NHEJ）等位基因的液滴计数聚类二维图。在“二维振幅”选项卡中，默认情况下所有液滴均未分类。本图中，颜色为手动分配以作区分。橙色点簇为野生型等位基因的计数，由FAM探针与参考序列及HEX探针与靶位点序列的结合获得。蓝色点代表液滴的信号值，这些液滴中FAM探针结合于参考序列，但HEX探针在靶位点序列处无结合（即HEX信号脱扣）。灰色点为无FAM或HEX结合的空液滴。（B）NHEJ事件的比率/丰度图。在比率选项卡下，选择分数丰度，可生成对应NHEJ事件百分比的图表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR-Cas9 基因编辑过程示意图（含 ddPCR 引物）；插入缺失结果表格与图示对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：利用ddPCR进行转基因中非同源末端连接鉴定与定量的Drop-Off检测应用 Anopheles stephensi 行，AsMCRkh1。 (A) 微滴数字PCR（ddPCR）双探针系统Drop-Off法检测靶向DNA位点突变的示意图。使用正向和反向引物扩增长度为150–400 bp的扩增子。FAM标记的探针设计用于结合扩增子中的保守序列，而HEX标记的探针对应结合野生型（WT）gRNA靶向位点。B利用ddPCR检测多种类型的插入缺失突变。采用ddPCR液滴减少（Drop-Off）检测方法，对15组各含10只AsMCRkh1蚊子的样本池进行了分析，这些样本包含插入、缺失和替换等多种类型的插入缺失突变。突变详情及序列信息见Carballar的表2和表S3。 等.9. (C使用ddPCR及扩增子分析法检测插入缺失（Indel）技术，对不同比例（10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9 和 0:10）的AsMCRkh1与野生型（WT）蚊虫混合样品中的非同源末端连接（NHEJ）进行定量分析9图片改编自 Carballar-Lejarazú 等人。 生物技术. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物/探针</td>
			<td>序列 (5’ » 3’)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 正向引物</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 反向引物</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR HEX 探针 (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR FAM 探针 (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HEX: 六氯荧光素, FAM: 6-羧基荧光素, BHQ: 黑洞淬灭剂</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：引物与探针序列。

本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。

利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

蚊虫基因组学和基因工程技术的最新进展催生了对快速高效检测靶向DNA方法的需求……

本方案为非同源末端连接（NHEJ）分析提供了一种高通量且可靠的检测方法，可用于确定基因编辑蚊群中插入缺失（Indel）突变的发生频率及相对数量。与下一代测序或桑格测序相比，数字滴定PCR（ddPCR）具有更快的结果周转时间，从而能够对转基因生物的遗传变异进行快速而全面的分析。该方法应可普遍适用于所有实验系统。演示该实验步骤的是来自杨氏实验室的研究助理Thai Pham。首先，按照文中所述比例，加入数字滴定PCR（ddPCR）超混合液、正向与反向引物、HEX或FAM探针、DNA和水，配制25微升的数字滴定PCR（ddPCR）样品混合液。然后通过涡旋充分混匀反应体系。使用50微升多通道移液器，将20微升ddPCR样品混合液加入芯片的中间排孔中。然后使用200微升多通道移液器，向底部排孔加入70微升油相，注意在整个移液过程中避免产生气泡。放置垫圈时仅触碰边缘，避免接触中心凹陷区域，随后将芯片牢固地放入液滴生成仪中，并关闭盖子以启动运行。使用多通道移液器将试剂盒顶行中的浸润混合液转移至96孔板中，以30至45度的角度缓慢滴加40微升液体样本，持续3至5秒。然后以45度角缓慢排液超过3秒，使液体沿孔壁流下，再将移液器按至第二档彻底排出液体。使用铝箔热封膜在180摄氏度条件下密封板材5秒。将密封的反应板放入热循环仪中，并按照NHEJ片段脱落的指导原则设置PCR反应条件：首先在95 °C下进行初始变性10分钟；然后进行40个循环，每个循环包括94 °C变性30秒，55 °C退火1分钟，以及60 °C延伸2分钟；40个循环结束后，在98 °C下保持10分钟，最后在4 °C下保存。所有步骤的升降温速率为每秒2摄氏度。退火温度将根据所使用的探针或引物而变化。将反应板牢固地放入液滴读取仪中，确保A1孔位于左上角。打开程序，通过将FAM设定为已知参考通道，HEX设定为每个孔的未知通道，来设置反应板。然后，更改每个样本的名称。运行液滴读取实验，进行直接定量，同时保存模板。为软件分析设定正确的实验参数，包括样本信息、超级混合液、目标名称、目标类型、信号通道一和通道二。然后，将液滴计数的阈值设置为高于10,000，以获得可靠结果。接下来，在液滴标签页中检查每个孔的液滴数量，确保所有孔的液滴数均高于10,000。最后，检查一维幅度以有效分离阳性信号与阴性信号。在板编辑器中，选中整块板，将实验类型设置为“drop off”。将野生型（WT）靶标设为参考，指定FAM为第一通道，HEX为第二通道。将NHEJ靶标设为未知，指定通道一用于FAM，通道二不使用。在二维振幅选项卡中，使用图形工具为每个样本设置聚类阈值。在NHEJ检测中，尾部通常与野生型（WT）聚类相关联。在“比例”标签页下，点击图表右上角的齿轮图标，选择“fractional abundance”以绘制对应NHEJ事件百分比的点。对15个独立提取的样本（每个样本包含10只蚊子）进行分析，这些样本中含有多种NHEJ等位基因，通过“drop off”检测方法进行鉴定，结果显示所有15个样本均携带100%的Indel等位基因。在另一项实验中，使用本ddPCR方案检测了11个独立提取的样本，其中包括野生型蚊子以及含有不同NHEJ百分比的NHEJ蚊子。结果显示，所鉴定出的百分比与通过扩增子分析技术检测到的插入缺失（Indel）结果相近。移液时应缓慢操作以避免产生气泡，并使所有乳化的液滴沿孔壁流下。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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通过锁核酸修饰的寡核苷酸在蚊子细胞中进行靶基因转染和诱变

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我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略来开发非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了rAaeDV载体的构建、包装和定量分析以及幼虫感染的完整实验流程。...

利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

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基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex...

使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

本文报告的方案展示了在实验室封闭的小型笼具试验中评估用于病媒控制的基因工程蚊子性能的三种替代方法。每种方案均根据蚊子品系所携带的特定修饰（基因驱动或非基因驱动）以及所测量参数的类型进行定制。...

小型笼具中对基因工程按蚊的实验室试验

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes...

利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术通过胚胎显微注射对蚊子A.

利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

学习使用数字液滴PCR技术检测转基因按蚊中的Indels突变，该方法可快速定量分析NHEJ修复事件。本方案为基因编辑生物的遗传变异研究提供了高通量、可靠的检测手段。

利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

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