用于研究哺乳动物细胞内吞再循环的密度梯度超速离心法

本方案有助于从转染的哺乳动物细胞中分离含有循环内体的组分，从而促进通过内吞运输途径对蛋白质转运进行研究。该技术操作简便，适用于组织和细胞样本。本实验操作将由劳博士实验室的博士研究生翟雨琪小姐进行演示。

首先，在100毫米培养皿中接种2×10⁶个细胞。次日，根据制造商说明书，使用Lipofectamine对细胞进行转染。收集细胞时，转染48小时后弃去培养基，并用预冷的PBS洗涤细胞两次。

然后向每块培养皿中加入1毫升预冷的PBS，其中添加有0.5X蛋白酶抑制剂混合物和0.5X磷酸酶抑制剂混合物。接着，使用细胞刮刀收集细胞，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。使用水平转子离心机对细胞进行离心。

弃去上清液，将细胞沉淀用五毫升匀浆缓冲液轻轻重悬。通过离心再次收集细胞，然后将细胞沉淀用一毫升匀浆缓冲液重悬。使用Dounce匀浆器，以15至20次冲程匀浆细胞。

然后将匀浆液转移至一个2毫升的离心管中。向匀浆液中加入700微升匀浆缓冲液。随后离心稀释后的匀浆液，并收集1.5毫升上清液。

将收集的上清液再次离心，然后收集1.4毫升上清液，并标记为去核上清液。为制备密度梯度柱，将1.2毫升去核上清液转移至超速离心管中。然后向样品中加入1毫升62%蔗糖溶液，通过轻柔吹打充分混匀。

接下来，小心地将 3.3 毫升 35% 蔗糖溶液加在样品上方，然后在 35% 蔗糖溶液上层加入 2.2 毫升 25% 蔗糖溶液。最后，用匀浆缓冲液将超速离心管加满至顶部。对密度梯度柱进行离心，并从梯度顶部开始，小心收集 12 个 1 毫升的组分。

接下来，用一毫升稀释缓冲液稀释所有组分，并对稀释后的样品进行离心。离心后，吸除上清液，并加入50微升1X上样缓冲液以收集各组分。在第七组分中检测到循环内体标志物Rab11。

还检测了其他亚细胞标志物，包括 beta COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab 7 和 Lamp1。在第七组分中也检测到 EEA1 的阳性信号。此处展示了第七组分及去核上清液中 GAPDH、Cox IV 和 Rab11 的测定条带强度。

在用 ELMO1、ELMO1 ARF6Q67L 或 ELMO1 ARF6Q67L FE65 转染 HEC293 细胞后，ELMO1 在细胞内的分布未因 ARF6Q67L 和 FE65 的过表达而发生改变。比较不同转染条件下第七组分中的 ELMO1 水平，发现共转染 ARF6Q67L 后其水平升高；当同时共表达 ARF6Q67L 和 FE65 时，ELMO1 水平进一步增加。

相反，敲除 FE65 会减弱 ARF6 介导的 Elmo1 在第七组分中的富集。所获得的组分可用于后续分析，例如通过蛋白质印迹检测该组分中蛋白质水平的变化。