Name: 密度梯度超速离心研究哺乳动物细胞内吞循环 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: 学习使用蔗糖密度梯度超速离心法从哺乳动物细胞中分离回收内体，以研究内吞循环途径中的蛋白质运输机制。该方法操作简便，适用于组织和细胞样本，有助于深入理解细胞内蛋白质动态。

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本工作获得了香港研究资助局、香港中文大学直接资助计划、联合书院捐赠基金以及TUYF慈善信托基金的资助。本文中的图示改编自我们此前于2020年10月发表在《FASEB杂志》上的研究论文&#34;神经元衔接蛋白FE65通过协调ARF6和ELMO1增强ARF6-Rac1信号通路介导的神经突生长&#34;。

1. 哺乳动物细胞培养与转染
<ol>
	<li>在100 mm培养皿中接种2 × 106个细胞。每次转染使用四个培养皿。 
	注意：不同细胞系所需的细胞数量可能有所不同。在进行分离步骤之前，可能需要进行优化。</li>
	<li>次日，根据生产商说明书，使用Lipofectamine对细胞进行转染。</li>
</ol>
2. 细胞收获
<ol>
	<li>转染后48小时弃去培养基。</li>
	<li>用预冷的PBS（10 mM磷酸钠，2.68 mM氯化钾，140 mM氯化钠）洗涤细胞两次。</li>
	<li>每皿加入1 mL预冷的PBS+（含0.5×蛋白酶抑制剂混合物和0.5×磷酸酶抑制剂混合物的PBS）。</li>
	<li>用细胞刮收集细胞，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>使用水平转子在400 × g 条件下离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>弃去上清液，用5 mL匀浆缓冲液（HB；250 mM蔗糖，3 mM咪唑（pH 7.4），1 mM EDTA，添加0.03 mM环己酰亚胺、1×蛋白酶抑制剂混合物和1×磷酸酶抑制剂混合物）轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在1,300 × g 条件下离心10分钟，收集细胞。</li>
	<li>用1 mL HB重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用Dounce匀浆器匀浆细胞，进行15–20次研磨。 
	注意：也可采用其他匀浆方法，例如通过注射器反复推注样品。可通过相差显微镜观察匀浆液来评估匀浆效率。</li>
	<li>将匀浆液转移至2 mL离心管中。 
	注意：取50 µL匀浆液与12.5 µL 5×上样缓冲液混合，标记为总裂解液。</li>
	<li>向匀浆液中加入0.7 mL HB。</li>
	<li>在4 °C条件下，以2,000 × g 离心10分钟。 
	注意：沉淀物包含细胞核和未破碎的细胞。</li>
	<li>收集1.5 mL上清液，并重复步骤2.12一次。</li>
	<li>收集1.4 mL上清液，标记为去核上清液（PNS）。</li>
</ol>
3. 密度梯度柱的制备
<ol>
	<li>将 1.2 mL PNS 转移至超速离心管中。</li>
	<li>向样品中加入 1 mL 62% 蔗糖溶液（2.351 M 蔗糖，3 mM 咪唑，pH 7.4），通过轻柔移液充分混匀。 
	注意：所得溶液为 40.6% 蔗糖溶液。</li>
	<li>小心地将 3.3 mL 35% 蔗糖溶液（1.177 M 蔗糖，3 mM 咪唑，pH 7.4）加至 62% 蔗糖溶液上方。</li>
	<li>再小心地将 2.2 mL 25% 蔗糖溶液（0.806 M 蔗糖，3 mM 咪唑，pH 7.4）加至 35% 蔗糖溶液上方。 
	注意：在室温下，62%、40.6%、35% 和 25% 蔗糖溶液的折射率分别为 1.44、1.40、1.39 和 1.37。可通过折射仪检测蔗糖溶液的折射率&#160;，以确保实验的精确性和一致性。</li>
	<li>用 HB 缓冲液加满超速离心管。 
	&#8203;注意：将制备好的密度梯度柱暂时储存在 4 °C 下。</li>
</ol>
4. 含再循环内体组分的分离与回收
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 210,000 × g 离心柱体 3 小时。</li>
	<li>从梯度顶部开始小心收集 12 个组分（每个 1 mL）。 
	注意：回收型内体应位于 35% 与 25% 蔗糖溶液之间的界面处。收集的组分可迅速在液氮中冷冻，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>用 1 mL 稀释缓冲液（pH 7.4 的 3 mM 咪唑，1 mM EDTA）稀释所有组分。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将稀释后的样品以 100,000 × g 离心 1 小时。</li>
	<li>吸除上清液，并加入 50 µL 1× 样品缓冲液以收集各组分。</li>
	<li>通过蛋白质印迹法分析各组分中的蛋白质含量。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

上述方案概述了通过超速离心法从培养细胞中分离回收型内体的实验步骤。该方法的可靠性已在最新发表的研究22中得到验证，证明可成功将回收型内体与其他细胞器（如高尔基体和线粒体）分离开来（图1）。为获得良好的分离效果，需特别注意若干关键步骤。在配制蔗糖溶液时，建议使用折光仪检测各溶液的折光率。室温下，62%、35% 和 25% 蔗糖溶液的折光率分别为 1.44、1.39 和 1.37。同时，应避免在密度梯度中产生气泡，因为柱中的气泡可能破坏梯度的连续性。在匀浆过程中应避免使用去垢剂，因其会破坏细胞器膜结构，导致膜结合细胞器中的蛋白质释放，从而引起严重污染。此外，所有匀浆工具在使用前均应预先冷却，以防止匀浆过程中蛋白质降解。梯度液配制完成后应尽快使用。尽管配制好的梯度液可在 4 °C 下短期保存（1–2 小时），但长时间存放可能因扩散作用而影响密度梯度的稳定性。
蔗糖是一种广泛使用的梯度介质，因其易于获得。事实上，还有许多其他替代物，包括Percoll和Ficoll-400<sup c...

内体运输是一种重要的生理过程，涉及多种生物学事件1，例如信号受体、离子通道和黏附分子的转运。定位于质膜的蛋白质通过内吞作用被内化2。内化的蛋白质随后由早期内体进行分选3。其中一部分蛋白质被靶向至溶酶体进行降解4。然而，大量蛋白质则通过快速再循环和慢速再循环过程被回收至细胞表面。在快速再循环过程中，蛋白质离开早期内体后直接返回质膜；而在慢速再循环过程中，蛋白质首先被分选至内吞再循环区室，然后再被转运回质膜。多种货物蛋白，例如网格蛋白、逆行体复合物（retromer complex）、回收体复合物（retriever complex）、Wiskott-Aldrich综合征蛋白以及SCAR同源物（WASH）复合物，均参与此类膜再循环过程4,5,6,7,8,9。内吞作用与再循环事件之间的平衡对细胞存活至关重要，并影响多种细胞活动10，例如细胞黏附、细胞迁移、细胞极性和信号转导。
ARF6 是一种小GTP酶，已被报道为内吞运输的调控因子7,11,12。值得注意的是，多个研究团队已阐明ARF6在内吞再循环过程中的重要作用13,14,15,16,17。本研究旨在探讨ARF6介导的神经突生长与内吞再循环之间的关系。先前的研究表明，ARF6通过作用于ELMO1-细胞分裂周期蛋白1（DOCK180）复合物，位于Rac1活性的上游18。然而，ARF6如何启动ELMO1-DOCK180介导的Rac1信号通路仍不清楚。本研究采用密度梯度超速离心法，以探究ARF6介导的内吞再循环在此过程中的作用。通过该方法，从细胞裂解液中分离出含有再循环内体的组分19。该组分随后进行蛋白质印迹分析以检测其蛋白含量。免疫印迹结果显示，在存在FE65（一种脑组织富集的衔接蛋白）的情况下，活性ARF6显著增加了再循环内体组分中ELMO1的水平。以下实验方案包括以下步骤：（1）转染哺乳动物细胞；（2）制备样品和密度梯度柱；（3）获取含有再循环内体的组分。

<table><tbody><tr><td>1 mL 开口厚壁聚丙烯管，11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13.2 mL 认证无菌开口薄壁超透明管，14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x 上样缓冲液</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850S</td><td>用于检测 COX IV 的兔单克隆抗体。</td></tr><tr><td>放线菌酮（Cycloheximide）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器，7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 抗体 (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>用于检测 ELMO1 的小鼠单克隆抗体。</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 抗体 (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>用于检测 FE65 的山羊多克隆抗体。</td></tr><tr><td>胎牛血清，研究级</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 单克隆抗体 (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>用于检测 GAPDH 的小鼠单克隆抗体。</td></tr><tr><td>ImageLab 软件</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>条带强度测定</td></tr><tr><td>咪唑（Imidazole）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗&amp;beta;-COP 抗体</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>用于检测 &amp;beta;-COP 的小鼠单克隆抗体。</td></tr><tr><td>Myc 标签 (9B11) 小鼠单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2276S</td><td>用于检测 Myc 标签蛋白的小鼠单克隆抗体。</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA，二钠盐，二水合物</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL 台式超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>RAB11A 特异性多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>用于检测 Rab11 的兔多克隆抗体。</td></tr><tr><td>蔗糖（Sucrose）</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 摆动桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究哺乳动物细胞内吞再循环的密度梯度超速离心法

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

内体运输是一种调控多种生物学事件的重要细胞过程。蛋白质从质膜被内吞后，转运至早期内体。这些被内吞的蛋白质可进一步转运至溶酶体进行降解，或被循环回收至质膜。一个高效的内吞循环通路对于平衡内吞过程中膜成分的移除至关重要。已有多种蛋白质被报道参与调控该通路，其中包括ADP核糖基化因子6（ARF6）。密度梯度超速离心是一种经典的细胞组分分离方法。离心后，细胞器会沉降到其等密度界面处。收集所得的组分可用于后续多种下游实验。本文所述是一种利用密度梯度超速离心法从转染的哺乳动物细胞中分离含回收内体组分的实验方案。分离得到的组分通过标准Western印迹法分析其蛋白质组成。采用该方法，我们发现吞噬及细胞运动相关蛋白1（ELMO1）——一种Ras相关C3肉毒毒素底物1（Rac1）鸟嘌呤核苷酸交换因子——定位于质膜的过程依赖于ARF6介导的内吞循环通路。

将未转染的HEK293细胞通过密度梯度超速离心进行分级后，从梯度顶部开始共收集12个组分。收集的组分以1:1的比例用稀释缓冲液稀释，并进行第二轮离心。随后对样品进行蛋白质印迹分析以检测其蛋白成分。如图1所示，循环内体标志物Rab11在第7组分中被检测到20。同时检测了其他亚细胞标志物，包括β-COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab7和Lamp1。在第7组分中也检测到EEA1的阳性信号。使用ImageLab软件（Bio-Rad）测量第7组分和PNS中GAPDH、COX IV和Rab11的条带强度，并计算第7组分与PNS中各标志物的强度比值，以柱状图形式表示，误差棒代表±标准差（SD）。
先前的研究表明，ARF6 和 ELMO1 可与 FE65 相互作用，促进 Rac1 介导的神经突生长21,22。由于 ARF6 是内吞循环的调控因子，而 ELMO1 ...

本文旨在介绍一种利用蔗糖密度梯度超速离心法从哺乳动物细胞中制备循环内体的实验方案。

内体运输是一种重要的细胞过程，可调控多种生物学事件。蛋白质从质膜被内吞……

本方案有助于从转染的哺乳动物细胞中分离含有循环内体的组分，从而促进通过内吞运输途径对蛋白质转运进行研究。该技术操作简便，适用于组织和细胞样本。本实验操作将由劳博士实验室的博士研究生翟雨琪小姐进行演示。首先，在100毫米培养皿中接种2×10⁶个细胞。次日，根据制造商说明书，使用Lipofectamine对细胞进行转染。收集细胞时，转染48小时后弃去培养基，并用预冷的PBS洗涤细胞两次。然后向每块培养皿中加入1毫升预冷的PBS，其中添加有0.5X蛋白酶抑制剂混合物和0.5X磷酸酶抑制剂混合物。接着，使用细胞刮刀收集细胞，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。使用水平转子离心机对细胞进行离心。弃去上清液，将细胞沉淀用五毫升匀浆缓冲液轻轻重悬。通过离心再次收集细胞，然后将细胞沉淀用一毫升匀浆缓冲液重悬。使用Dounce匀浆器，以15至20次冲程匀浆细胞。然后将匀浆液转移至一个2毫升的离心管中。向匀浆液中加入700微升匀浆缓冲液。随后离心稀释后的匀浆液，并收集1.5毫升上清液。将收集的上清液再次离心，然后收集1.4毫升上清液，并标记为去核上清液。为制备密度梯度柱，将1.2毫升去核上清液转移至超速离心管中。然后向样品中加入1毫升62%蔗糖溶液，通过轻柔吹打充分混匀。接下来，小心地将 3.3 毫升 35% 蔗糖溶液加在样品上方，然后在 35% 蔗糖溶液上层加入 2.2 毫升 25% 蔗糖溶液。最后，用匀浆缓冲液将超速离心管加满至顶部。对密度梯度柱进行离心，并从梯度顶部开始，小心收集 12 个 1 毫升的组分。接下来，用一毫升稀释缓冲液稀释所有组分，并对稀释后的样品进行离心。离心后，吸除上清液，并加入50微升1X上样缓冲液以收集各组分。在第七组分中检测到循环内体标志物Rab11。还检测了其他亚细胞标志物，包括 beta COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab 7 和 Lamp1。在第七组分中也检测到 EEA1 的阳性信号。此处展示了第七组分及去核上清液中 GAPDH、Cox IV 和 Rab11 的测定条带强度。在用 ELMO1、ELMO1 ARF6Q67L 或 ELMO1 ARF6Q67L FE65 转染 HEC293 细胞后，ELMO1 在细胞内的分布未因 ARF6Q67L 和 FE65 的过表达而发生改变。比较不同转染条件下第七组分中的 ELMO1 水平，发现共转染 ARF6Q67L 后其水平升高；当同时共表达 ARF6Q67L 和 FE65 时，ELMO1 水平进一步增加。相反，敲除 FE65 会减弱 ARF6 介导的 Elmo1 在第七组分中的富集。所获得的组分可用于后续分析，例如通过蛋白质印迹检测该组分中蛋白质水平的变化。

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

密度梯度超速离心研究哺乳动物细胞内吞循环

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

在本视频中，我们介绍一种利用梯度离心法分离单个细胞核的简单高效方案。分离得到的细胞核可用于测序和基因组分析。...

基于梯度离心的细胞核纯化：利用密度梯度离心获取完整细胞核超纯组分的技术

密度梯度离心, 细胞核纯化, 超纯细胞核, 完整细胞核, 分离技术, 细胞组分分离, 生物化学方法, 分子生物学技术

本视频展示了基于密度梯度超速离心的纯化方法，用于分离适合进行表征研究的细胞外囊泡亚群。...

细胞外囊泡亚群的纯化：利用密度梯度超速离心法纯化细胞外囊泡亚群的技术

本文介绍一种无需使用高速离心即可分离U937细胞质膜、细胞质和线粒体的实验方案。该技术可用于纯化亚细胞组分，以便后续分析蛋白质的定位。 通过...

无高速离心条件下U937细胞的细胞组分分离

该分级分离方案可使研究人员从哺乳动物细胞中分离出细胞质、细胞核、线粒体和膜蛋白。后两种亚细胞组分通过等密度梯度离心进一步纯化。...

通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞组分分离

本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）的方法 Mycobacterium smegmatis （耻垢分枝杆菌，Msm）以及如何设计并富集含有mCherry（一种红色荧光报告蛋白）的重组MsmEVs。最后，通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。...

分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。...

一种改进的线粒体接触位点分离方法

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过...

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

本方案描述了采用密度梯度离心法从高盐饮食喂养的盐敏感型大鼠中分离肠道微生物胞外囊泡（EVs）的方法。通过纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜（TEM）、脂多糖（LPS）/BCA检测以及16S...

高盐饮食条件下盐敏感大鼠肠道微生物胞外囊泡的分离与差异表征

本方案描述了高密度脂蛋白小RNA的分离与定量方法。...

高密度脂蛋白的分离用于非编码小RNA定量

学习使用蔗糖密度梯度超速离心法从哺乳动物细胞中分离回收内体，以研究内吞循环途径中的蛋白质运输机制。该方法操作简便，适用于组织和细胞样本，有助于深入理解细胞内蛋白质动态。

用于研究哺乳动物细胞内吞再循环的密度梯度超速离心法

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