一锅纯无细胞系统

这种用于重组无细胞蛋白表达系统的方案，通常称为PURE系统，利用细胞培养和细胞纯化来简化所需的蛋白质纯化。这大大减少了时间和劳动力需求。OnePot方法已被证明不仅具有成本效益，而且具有时间效率。

它将准备时间从几周缩短到三个工作日。这使得全球更多的实验室可以使用PURE无细胞平台，并有助于实现这个真正强大的合成无细胞生物学平台。在开始之前，请确保所有菌株都能很好地表达其各自的蛋白质。

首先，按照文本手稿中所述，使用两毫升的Sepharos树脂为OnePot蛋白纯化准备色谱柱，然后用硫酸镍对色谱柱进行充电。通过将20毫升LB培养基与20微升氨苄西林混合来制备发酵剂培养物。将300微升培养基加入无菌96深孔板的35孔中。

用各自的菌株接种它们中的每一个，除了伸长系数热不稳定或EFTU，并用透气膜密封板。对于EFTU培养物，在带有卡扣帽的14毫升培养管中接种3毫升含有LB培养基的氨苄西林。大约三毫升的EFTU培养物足以用于一个OnePot表达培养物。

在37摄氏度下孵育，同时在夜间以每分钟260转的速度振荡。第二天，将500毫升LB培养基和500微升氨苄西林转移到无菌挡板烧瓶中。用1， 675微升EFTU培养物和55微升深孔板培养物接种OnePot PURE培养物。

在37摄氏度下以每分钟260转的振荡孵育培养物两小时，或直到培养物的光密度达到0.2至0.3。用500微升0.1毫摩尔IPTG诱导培养物，并额外生长3小时。通过在4摄氏度和3，220倍G下离心10分钟收获细胞，并将细胞沉淀储存在零下80摄氏度直至进一步使用。

在第三天，测量纯化所需的缓冲液量，并按照文本中的指示将TCEP添加到所有缓冲液中。将剩余的不含TCEP的缓冲液储存在4摄氏度，以备将来纯化。用30毫升缓冲液A平衡带电的色谱柱，在25毫升缓冲液A通过后，从底部关闭色谱柱。

解冻细胞并使用血清学移液管将细胞沉淀重悬于7.5毫升缓冲液A中，使用130瓦探针裂解细胞。如果超声处理成功，溶液将变暗。确保将细胞保持在冰上，并将探针放置得足够深，不要接触管子。

通过在4摄氏度下以21，130倍G离心20分钟来除去细胞碎片，并将裂解物保持在冰上。将上清液加入平衡柱中。从顶部关闭柱子，确保没有泄漏。

使用管旋转器在四摄氏度的旋转下将色谱柱孵育三小时。从色谱柱中洗脱未结合的组分，并用25毫升缓冲液A洗涤，用25毫升25毫摩尔咪唑缓冲液洗涤色谱柱。用5毫升450毫摩尔咪唑缓冲液洗脱蛋白质，并始终将洗脱的蛋白质保持在冰上。

用25毫升HT缓冲液稀释洗脱液，并将混合物保持在冰上。向15毫升离心过滤器中加入15毫升，浓缩至1.5毫升的体积。将剩余的15毫升与浓缩溶液一起加入过滤器中，再次浓缩至1.5毫升。

向浓缩样品中加入10毫升HT缓冲液，并浓缩至1毫升。回收浓缩样品并加入等量的储备缓冲液B，并在零下80摄氏度下储存直至进一步使用。在缓冲区交换期间，还原文本中指定的列。

在第四天，使用布拉德福德测定法测量蛋白质浓度。用0.5毫升三千道尔顿截止离心过滤器将样品浓缩至每毫升20毫克。使用 SDS 验证 OnePot PURE 蛋白质成分页面。

用7.5微升水与10微升两个X Laemmli缓冲液混合稀释2.5微升样品，然后将5微升和2.5微升样品上样在凝胶上。按照文本中的指定运行 SDS 页。在电子表格中使用2至10纳摩尔的DNA进行反应，在相应的黄色细胞中填写DNA的浓度和长度。

以微升为单位填充所需的总反应体积。从冰箱中取出所需的试剂，并在冰上解冻。然后，将计算出的水，DNA和能量溶液的量移液到PCR管的一侧或384孔板上孔的一角。

将计算出的蛋白质和核糖体溶液量移液到PCR管的另一侧或384孔板的另一角。旋转约30秒以合并反应组分。为了防止读板器实验过程中的蒸发，加入35微升液体蜡，并用透明密封剂密封板。

在37摄氏度下孵育至少三个小时。对于读板器上的读数，每两分钟测量一次所需波长的荧光强度。此处显示了随后用于OnePot蛋白制备的所有单个菌株中的成功超表达。

通过SDS页面分析了最终OnePot PURE蛋白溶液的整体组成。值得注意的是，正如预期的那样，与其他蛋白质相比，EFTU以更高的浓度存在。通过监测eGFP荧光随时间的变化来分析OnePot蛋白溶液与His标记或未标记核糖体的合成产量。

在SDS页面凝胶上分析使用绿名单tRNA体外标记系统或Kumasi染色标记的三种不同蛋白质的表达水平。对于功能性 PURE 系统，所有菌株都能很好地表达各自的蛋白质是绝对关键的。该技术有助于将PURE系统实施到生物系统工程中，从而能够开发新的遗传网络，分子诊断，治疗和教育试剂盒。