Name: 一锅纯无细胞系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习使用OnePot方法快速制备PURE无细胞蛋白表达系统，该方法将传统数周的制备时间缩短至三天，显著降低实验成本与劳动强度。此技术为合成生物学研究提供了高效便捷的蛋白表达平台。

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本工作得到了欧洲研究理事会欧洲联盟“地平线2020”研究与创新计划资助（编号723106）、瑞士国家科学基金会资助（编号182019）以及洛桑联邦理工学院（EPFL）的支持。

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本文所述方案介绍了一种简单、省时且经济的方法，用于制备一种多功能的PURE表达系统20 根据标准组成15通过结合使用本方案与提供的每日时间表（表1），所有组分可在1周内完成制备，产量足以进行多达五百次10 µL的PURE反应。由于本方案中使用的蛋白质由高拷贝质粒过表达，且对宿主毒性较低 E. coli，所有所需蛋白均观察到良好的表达水平（图1这使得通过简单调整接种菌株的比例，即可方便地调节共培养体系中的菌株组成，进而调节蛋白质组成。20除了核糖体蛋白外，EF-Tu 的浓度也被证明对表达产量具有重要意义6相比之下，其他蛋白质组分浓度的变化对PURE系统的稳健性影响相对较小7,24因此，通过调整EF-Tu相对于其他所有组分的接种比例，可获得与标准PURE体系相似的组分构成，从而实现产量相近的PURE系统20 可以实现。在制备蛋白质溶液时，关键是要确保所有菌株在诱导后能够良好生长并过表达所编码的蛋白质（图1).
核糖体功能对PURE系统的整体性能至关重要24在本实验方案中，展示了两种不同的核糖体溶液制备方法，即无标签核糖体纯化和带His标签核糖体纯化。无标签核糖体纯化基于疏水相互作用层析，随后通过蔗糖垫进行离心，该方法需要使用FPLC纯化系统和超速离心机。15相比之下，利用带His标签核糖体的方法18 重力流亲和层析纯化无需专用设备，可在大多数实验室中进行。因此，后一种方法具有操作简便和易于获取的优势。然而，我们观察到在 OnePot PURE 体系中使用带 His 标签的核糖体时，其合成产量显著低于无标签的版本（图3根据应用类型，这种较低的产量可能是可以接受的。
能量溶液提供驱动反应所需的低分子量组分和tRNA 体外 TX-TL 反应。本方案提供了一种典型能量溶液的配制方法，可根据用户需求轻松调整。与 tRNA、NTP 和磷酸肌酸一起，Mg 的丰度和浓度2+ 离子对PURE系统的整体性能至关重要8，因为它们是转录和翻译过程中的关键辅因子。在某些情况下，通过滴定离子浓度可显著提升整体PURE系统的性能。DNA完整性对PURE系统的性能至关重要。因此，需对启动子区域、核糖体结合位点及目的基因进行测序验证，并确保有足够的DNA浓度（&#60;2 nM）将有助于在建立PURE反应时排查可能出现的问题。
PURE 系统是一种最简的转录-翻译偶联系统，因此特定应用可能需要额外的调整25。这些调整可能包括引入不同的RNA聚合酶9,26、分子伴侣13，以及EF-P或ArfA等蛋白质因子8。尽管这些蛋白质的表达菌株可被包含在共培养体系中，但将其单独添加至制备好的系统中可能更有利于精确控制所需蛋白的表达水平。此外，囊泡的加入对于膜蛋白的合成至关重要10,11。相较于还原性环境，氧化性环境以及二硫键异构酶有助于正确形成二硫键，这对于分泌蛋白等的正确折叠尤为重要12。
必须确保任何添加的组分不会干扰反应。在设置反应或添加其他组分时，需注意以下最重要的因素。应避免使用不相容的缓冲液，或干扰离子浓度。尽可能避免使用含有甘油、高浓度钾离子、镁离子、钙离子、渗透调节剂、焦磷酸盐、抗生素或EDTA的溶液。例如，在DNA纯化过程中，用纯水替代洗脱缓冲液可能更有利，因为EDTA是此类缓冲液中常见的添加剂。当向反应体系中加入额外的带负电荷分子（如NTP或dNTP）时，需相应调整镁离子浓度8，因为这些带负电荷的分子可作为螯合剂，与带正电荷的离子结合。反应体系宜维持中性pH值。因此，所有组分均应使用相应pH值的缓冲液进行配制；这一点对于NTP等强酸性或强碱性分子尤为重要。最后，温度和体积是反应的关键参数。为获得较高的产率，建议采用约37 °C的反应温度，因为低于34 °C的温度将显著降低产率27。
需要注意的是，在制备OnePot PURE系统之前，应考虑目标应用及其相关要求，例如体积、纯度、修饰的难易程度，以及组分的包含或省略。对于许多应用而言，该系统将是极佳的选择，但某些应用可能需要更高的产量、可调节性及其他OnePot系统无法提供的因素。无论何种情况，本文介绍的方案都将有助于任何自制系统的制备，因为此处已总结了此类制备过程中的所有关键步骤。
OnePot 系统的主要优势之一是其与市售 PURExpress 系统的兼容性，这使得可以通过将 PURExpress 系统的各个组分依次替换为 OnePot 对应组分，来分别测试所有组分的功能性和完整性。OnePot PURE 系统具有可调节性强、制备简便快速且成本低等优点，将使无细胞转录-翻译系统在全球范围内被更多实验室所采用，并推动这一强大平台在无细胞合成生物学中的更广泛应用。

无细胞转录-翻译（TX-TL）系统是研究和构建生物系统的有前景平台。由于不再依赖生长、稳态或调控机制等维持生命的过程，该系统提供了简化且可调控的反应条件1。因此，人们预期无细胞系统将有助于生物分子系统的研究，为理性生物设计策略提供测试框架2，并为未来的合成细胞提供底盘3,4。全重组的PURE系统因其明确且最简的组分，以及良好的可调节性和可调性，成为尤为理想的底盘系统5。
自2001年首个功能完整、完全重组的PURE系统建立以来5，研究人员已致力于拓展该系统的应用范围，并优化其组分以提高蛋白产量6,7,8，实现转录调控9、膜蛋白10,11及分泌蛋白的合成12，以及促进蛋白质正确折叠13,14。目前，市面上有三种商业化系统：PUREfrex（GeneFrontier）、PURExpress（NEB）和Magic PURE（Creative Biolabs）。然而，这些系统成本较高，其确切组分属于商业机密而未公开，且可调节性和灵活性有限。
自行制备的PURE系统被证明是最具成本效益且可调节性最强的方案15,16。然而，蛋白质和核糖体组分所需的37个纯化步骤耗时且繁琐。已有多种尝试致力于提高PURE系统制备的效率17,18,19。我们近期证明，可在同一培养体系中共同培养并共纯化PURE系统所需的所有非核糖体蛋白。这种“一步法”（OnePot）方法已被证实具有较高的成本效益和时间效率，将制备时间从数周缩短至3个工作日。该方法所获得的PURE系统在蛋白质生产能力方面可与商业化的PURExpress系统相媲美20。与以往简化PURE系统制备的方法17,18,19不同，在OnePot方法中，所有蛋白仍在不同的菌株中分别表达。这使得用户仅通过省略或添加特定菌株，或调整接种体积，即可灵活调节OnePot PURE系统的组成，从而分别构建缺失特定组分的PURE系统或改变最终蛋白的比例。
本文所述方案提供了构建OnePot PURE系统的详细方法，此前已有相关描述20，但以三(2-羧乙基)膦（TCEP）替代了β-巯基乙醇。此外，本文描述了两种核糖体纯化方法：一种是基于Shimizu等15报道的传统的无标签核糖体纯化方法，利用疏水相互作用和蔗糖垫进行纯化；另一种是基于Wang等18和Ederth等21的方法但经过显著改进的Ni-NTA核糖体纯化方法。后一种方法进一步简化了PURE系统的制备过程，且仅需常规实验室设备，因而可被更多实验室采用。
本实验方案总结了一种多功能的PURE无细胞转录-翻译（TX-TL）系统的制备方法，提供了一个简单、可调控且成本效益高的无细胞平台，可在一周内使用常规实验室设备完成制备。除了介绍标准的PURE组分外，我们还指出了系统可进行调整的具体方式与位置，重点强调了实验方案中的关键步骤，以确保系统的正常功能。

<table><tbody><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR International</td><td>525-0309</td><td></td></tr><tr><td>384孔黑色检测板</td><td>康宁</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN® TGX™ 预制蛋白凝胶</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR International</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>96孔聚丙烯深孔板</td><td>Nunc</td><td>260252</td><td></td></tr><tr><td>乙酸，99.8 %</td><td>阿克罗斯</td><td>222140010</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta purifier</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>无标签核糖体的纯化</td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa</td><td>默克密理博</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td><td>默克密理博</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09718-250G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>康达实验室</td><td>6801</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 荧光蛋白标准品</td><td>ThermoFisher</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy&amp;nbsp;封膜</td><td>Diversified Biotech</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯离心管</td><td>贝克曼</td><td>355631</td><td>无标签核糖体的纯化</td></tr><tr><td>Chill-out 液体蜡</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>CHO1411</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-25（带盖）</td><td>Zymo</td><td>ZYM-D4034-200TS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SantaCruz Biotech</td><td>sc-29089B</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 层析柱</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609-250G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind 微量离心管</td><td>VWR International / Eppendorf</td><td>525-0133</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 带挡板锥形瓶，4 片挡板，硼硅酸盐玻璃</td><td>Scilabware</td><td>9141173</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTect Green Lys 体外翻译标记系统</td><td>普洛麦格</td><td>L5001</td><td>可选</td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1541</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Butyl HP 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28411005</td><td>无标签核糖体的纯化</td></tr><tr><td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0921-07</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21149.03</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 缓冲液 (2x)，上样缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-1VL</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>AppliChem</td><td>A0954</td><td></td></tr><tr><td>乙酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Honeywell Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镍</td><td>Alfa Aesar</td><td>15414469</td><td></td></tr><tr><td>NTP</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶（2 U/μL）&amp;micro;L</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒</td><td>NEB</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress&amp;nbsp;&amp;Delta;&amp;nbsp;核糖体试剂盒</td><td>NEB</td><td>E3313S</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 1x 染料试剂</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>快速流动式无菌一次性真空滤器单元</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>564-0020</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA 溶液</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td></td></tr><tr><td>SealPlate&amp;nbsp;薄膜</td><td>Excel Scientific</td><td>Z369659-100EA</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6203</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547-10X1mL</td><td></td></tr><tr><td>厚壁聚碳酸酯管</td><td>贝克曼</td><td>355631</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>罗氏</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 Optima L-80</td><td>贝克曼</td><td></td><td>无标签核糖体的纯化</td></tr><tr><td>Whatman GD/X 注射器滤器</td><td>GE Whatman</td><td>WHA68722504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

onepot pure 无细胞体系

OnePot PURE Cell-Free System

定义明确的PURE（使用重组元件进行蛋白质合成）转录-翻译系统为无细胞合成生物学提供了一个极具吸引力的平台。然而，市售系统的成本较高，且可调节性有限。相比之下，自制系统可根据用户需求进行定制。但自制系统的制备过程耗时且繁琐，因其需要核糖体以及36种中等规模的蛋白质纯化步骤。通过共培养和共纯化来简化蛋白质纯化流程，可显著减少所需的时间和劳动投入。本文介绍了一种简便、可调节、高效且成本低廉的方法，仅需标准实验室设备即可在1周内完成PURE系统所有组分的制备。此外，OnePot PURE系统的性能与市售系统相当。由于其操作简便且成本低廉，OnePot PURE制备方法将使更多实验室能够获得PURE系统。

上述方案旨在帮助任何实验室建立PURE无细胞转录-翻译（TX-TL）系统。该方案详细描述了PURE系统的三个独立组分的制备过程：OnePot蛋白、核糖体和能量溶液。优化工作流程的详细每日时间安排见表1。该工作流程针对带His标签核糖体的纯化进行了优化；若进行无标签核糖体纯化，各步骤所需时间可能略有不同。一次制备所得的PURE系统组分足以进行至少五百次10 µL反应。此外，制备好的溶液在-80 °C下可稳定保存一年以上，并能耐受多次冻融循环。
所有菌株的充分过表达水平对于最终蛋白质溶液的功能至关重要。图1展示了后续用于OnePot蛋白质制备的全部36个独立菌株中均实现了成功的过表达。过表达蛋白条带强度的差异很可能源于上样体积在SDS-PAGE凝胶中的偏差。预期的蛋白质大小汇总于表2中。GlyRS和PheRS由两个不同分子量的亚基组成；其余34种蛋白质均由单个亚基构成。本实验方案简洁高效的关键在于共培养与共纯化步骤（图2）。通过提高EF-Tu菌株相对于其他所有表达菌株的比例，制备了OnePot蛋白质溶液。最终蛋白质的整体组成通过SDS-PAGE进行分析（图3A）。从凝胶结果（泳道2、3）可以看出，EF-Tu（43.3 kDa）的浓度明显高于其他蛋白质，与预期一致。尽管凝胶电泳可初步反映蛋白质表达比例，但难以确定每种单个蛋白质是否表达以及其表达水平。因此，强烈建议在共培养前如上所述验证每种菌株中的过表达情况。
的 E. coli 核糖体是由50多个独立的蛋白质亚基组成的复杂分子机器23在260 nm处的无标签核糖体纯化代表性吸收光谱如图所示 图4；第三个峰是核糖体成功洗脱的特征。对于这两种核糖体纯化方法，在SDS-PAGE凝胶上预期的跑胶模式（图3A)18 观察到污染现象。我们在两次纯化过程中均观察到了污染，尽管污染量较小（&lt;10%）。值得注意的是，由于方法不同，无标签核糖体（第5、6泳道）和带His标签的核糖体（第11、12泳道）中存在的污染物也不同。为方便用户参考，还提供了合并体系的SDS-PAGE凝胶结果（第8、9泳道以及第14、15泳道）。
最后，比较了使用不同核糖体变体的制备系统（图3）的性能。体外 eGFP 表达的时间进程显示，两种 PURE 系统均具有功能并可产生荧光 eGFP。然而，将 OnePot 蛋白溶液与 His 标签核糖体结合，并采用滴定优化的核糖体浓度时，其表达水平仅为非标签核糖体版本的三分之一（图3B）。当使用 Green Lys tRNA 体外 标记系统表达并标记三种不同大小的蛋白质时，也观察到类似结果（图3C）。如荧光凝胶所示，两种系统均成功表达了全长产物；但 His 标签核糖体系统的表达水平仅达到约一半。除荧光标记外，在考马斯亮蓝染色凝胶上也可清晰分辨出三种蛋白质的预期条带（图3D）。结果表明，该引入的表达系统可在配备常规设备的实验室中于一周内完成制备，适用于从线性模板上 T7 启动子下游编码的蛋白质的体外表达。
<img alt="SDS-PAGE蛋白质表达检测，用于分析蛋白质条带的凝胶电泳结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：PURE系统所有表达菌株过表达检测的代表性结果。 PURE蛋白的编号和大小总结于表2中。蛋白编号21、24和27用星号标记，以便更清晰地观察。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="OnePot 蛋白质纯化流程图；重悬、超声、孵育、纯化步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：OnePot 蛋白质纯化。 OnePot 蛋白质溶液制备过程中所有步骤的示意图及相应照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDS-PAGE蛋白质分析；eGFP表达；核糖体性能图；无标签核糖体与His标签核糖体对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：使用不同核糖体变体的制备系统的性能表现。 (A) OnePot蛋白溶液（泳道2、3）、无蛋白溶液的无标签核糖体（泳道5、6）和含蛋白溶液的无标签核糖体（泳道8、9）、无蛋白溶液的His标签核糖体（泳道11、12）和含蛋白溶液的His标签核糖体（泳道14、15）的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶。每个样品加载了两种不同的浓度。B) 带有His标签的核糖体与无标签核糖体的eGFP表达比较。荧光强度的 体外 使用无标签核糖体的PURE反应中，随时间监测eGFP的表达1.8 µM，蓝色）和带 His 标签的核糖体（0.62 µM，红色）。线性模板和OnePot蛋白溶液的浓度分别为4 nM和2 mg/mL。图（C）和（D) 显示在OnePot中合成的无标签蛋白的SDS-PAGE凝胶结果1.8 µM，蓝色，泳道 3、4、5）以及 His标签核糖体（0.62 µM，红色，第6、7、8泳道）用GreenLys标记 体外 标记试剂盒（C）并用考马斯亮蓝染色（D），分别表示合成蛋白质的预期条带：eGFP（26.9 kDa）、ArgRS（64.7 kDa）、T7 RNAP（98.9 kDa）。线性模板和OnePot蛋白溶液的浓度分别为4 nM和1.6 mg/mL。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="层析结果；吸光度与体积关系；洗脱峰；蛋白质纯化图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：260 nm 处的吸光度光谱。 无标签核糖体经疏水相互作用纯化过程中 260 nm 处吸光度光谱的代表性结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：制备所有OnePot PURE溶液的每日时间优化方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：PURE蛋白列表 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 1：试剂。 本表格列出了本研究中所用试剂和组分的浓度、体积及其他具体细节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2：缓冲液。 该电子表格列出了用于蛋白质、无标签核糖体和 His-标签核糖体纯化的各种缓冲液的精确组分，以及配制这些缓冲液所用储备液的浓度。此外，该表格还可根据所需缓冲液体积自动计算各组分的用量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表3：氨基酸计算。 该电子表格列出了能量溶液所需的氨基酸及其推荐的储备溶液浓度。根据实际称量的质量，计算每种氨基酸需加入的水量，并计算将各氨基酸溶液加入最终氨基酸混合液中的体积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表4：能量溶液的储备液。 该表格列出了配制能量溶液所需的储备液浓度和体积，并提供了包括储存条件在内的进一步详细信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表5：能量溶液。 该表格列出了能量溶液的组分及其推荐浓度。此外，根据各组分的储备液浓度以及能量溶液的总体积，计算了需加入终溶液的相应体积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表6：PCR。 该表格列出了用于延伸PCR的引物序列和浓度，并标明了针对高保真DNA聚合酶优化的退火温度以及PCR仪的反应程序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 7：PURE 反应。 该电子表格展示了 PURE 反应的一个示例设置，列出了使用无标签核糖体或 His 标签核糖体时各组分的使用浓度和体积。此外，它还计算了蛋白质和核糖体滴定的体积比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

我们介绍一种使用标准实验室设备快速且经济高效地制备重组型PURE无细胞转录-翻译系统的方法。

OnePot PURE 无细胞体系

定义明确的PURE（使用重组元件的蛋白质合成）转录-翻译系统为无细胞合成生物学提供了一个理想的底盘……

这种重组无细胞蛋白表达系统（通常称为PURE系统）的实验方案利用细胞培养和细胞纯化来简化所需的蛋白纯化步骤，显著减少了时间和劳动投入。OnePot方法被证明不仅具有成本效益，而且时间效率高。它将制备时间从数周缩短至三个工作日，使全球更多实验室能够使用PURE无细胞平台，并有助于推广这一功能强大的合成无细胞生物学平台。在开始之前，请确保所有菌株均能良好地过表达其相应的蛋白质。首先，按照文稿中所述方法，使用 2 毫升 Sepharose 树脂制备 OnePot 蛋白纯化柱，然后用硫酸镍对层析柱进行上样。通过将 20 毫升 LB 培养基与 20 微升氨苄青霉素混合，制备起始培养物。将 300 微升培养基加入无菌 96 深孔板的 35 个孔中。除延长因子热不稳定蛋白（EFTU）外，分别向每个培养物中接种相应的菌株，并用透气膜密封培养板。对于EFTU培养物，取3毫升含氨苄青霉素的LB培养基加入14毫升带卡扣盖的培养管中，并接种EFTU。每3毫升EFTU培养物足以用于一次OnePot表达培养。在37摄氏度、260转/分钟振荡条件下过夜培养。第二天，将500毫升LB培养基和500微升氨苄青霉素加入无菌挡板烧瓶中。用1,675微升EFTU培养物以及深孔板中每种培养物各55微升，接种OnePot PURE培养体系。将培养物在37摄氏度、260转/分钟振荡条件下孵育2小时，或直至培养物的光密度达到0.2至0.3。加入500微升0.1毫摩尔的IPTG诱导培养物，并继续培养额外3小时。在4摄氏度、3,220 × g条件下离心10分钟收集细胞，并将细胞沉淀于-80摄氏度保存，直至后续使用。第三天，测定纯化所需的缓冲液体积，并按照文中说明向所有缓冲液中加入TCEP。将未添加TCEP的剩余缓冲液于4°C保存，用于后续纯化。用30毫升缓冲液A平衡已上样柱子。当25毫升缓冲液A流经柱子后，关闭柱子底部。解冻细胞，用移液管将细胞沉淀重悬于7.5毫升缓冲液A中。使用130瓦的探头进行细胞裂解。若超声成功，溶液会变深。确保将细胞保持在冰上，并将探头插入足够深度，但不要接触管壁。在 4 摄氏度下以 21,130 × g 离心 20 分钟，去除细胞碎片，并将裂解液置于冰上保存。将上清液加入已平衡的层析柱中。从顶部关闭层析柱，并确保无泄漏。将柱子置于4°C下，使用试管旋转仪旋转孵育三小时。从柱子中洗脱未结合组分，并用25毫升缓冲液A洗涤。用25毫升25毫摩尔咪唑缓冲液洗涤柱子。用5毫升450毫摩尔咪唑缓冲液洗脱蛋白质，并始终将洗脱的蛋白质置于冰上保存。用25毫升HT缓冲液稀释洗脱液，并将混合物置于冰上。取15毫升加入15毫升离心过滤管中，浓缩至1.5毫升体积。将剩余的15毫升加入含有浓缩液的滤管中，再次浓缩至1.5毫升。向浓缩样品中加入10毫升HT缓冲液，浓缩至1毫升。回收浓缩样品，加入等体积的储存缓冲液B，于-80摄氏度保存，直至后续使用。在缓冲液置换过程中，按照文中所述方法恢复层析柱。第四天，使用 Bradford 法测定蛋白浓度。使用 0.5 毫升截留分子量为 3 千道尔顿的离心过滤器将样品浓缩至 20 毫克/毫升。通过 SDS-PAGE 验证 OnePot PURE 蛋白的组成。取2.5微升样品，加入7.5微升水和10微升2× Laemmli缓冲液混合液进行稀释，然后分别上样5微升和2.5微升至凝胶中。按照文中所述条件运行SDS-PAGE。在电子表格中对应的黄色单元格内填写DNA的浓度和长度，反应中使用DNA的浓度范围为2至10纳摩尔。填写所需的总体反应体积（单位：微升）。从冷冻柜中取出所需的试剂，并在冰上解冻。然后，将计算好的水量、DNA 和能量溶液加入 PCR 管的一侧或 384 孔板中某一孔的角落处。用移液器将计算好体积的蛋白质和核糖体溶液加入PCR管的另一侧，或384孔板的对角孔中。离心约30秒，使反应组分混合。为防止在酶标仪实验过程中发生蒸发，加入35 µL液体石蜡，并用透明封板膜密封。在 37 摄氏度下孵育至少三小时。使用酶标仪检测时，每两分钟在所需波长下测定一次荧光强度。此处展示了后续用于 OnePot 蛋白制备的所有单个菌株中成功的过表达结果。通过SDS-PAGE分析了最终OnePot PURE蛋白溶液的整体组成。可以明显观察到，与其他蛋白相比，EFTU的浓度更高，这与预期一致。通过监测eGFP荧光随时间的变化，分析了OnePot蛋白溶液与His标签化或非标签化核糖体结合后的蛋白合成产量。通过SDS-PAGE凝胶分析了使用绿色列表tRNA体外标记系统或Kumasi染色法标记的三种不同蛋白质的表达水平。对于一个具有功能的PURE系统而言，所有菌株均能良好表达其相应蛋白质至关重要。该技术促进了PURE系统在生物系统工程中的应用，从而推动新型基因网络、分子诊断、治疗手段及教育套件的开发。

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科研

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生物工程

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