组织中蛋白质与RNA表达的空间分析：优化虚拟显微切割的一种方法

本方案有助于指导空间组学技术中感兴趣区域的选择，从而实现对组织或细胞群体的更有针对性的表征。与手动方案相比，蛋白质组学检测中采用自动化感兴趣区域选择流程具有更高的稳健性和可重复性；而在转录组学检测中使用50微米的感兴趣区域可实现对特定细胞群体的分析。首先编程自动染色仪以施加荧光可视化抗体。

在自动染色机软件中，单击主页按钮并选择“程序”。然后单击“创建/编辑程序”，选择 RUO Discovery Universal 作为操作流程。单击“第一序列”，然后选择“脱蜡”，接着选择 Depar v2。

对于中等温度，选择 72 摄氏度，然后点击预处理并选择细胞调理和 CC1 储液槽。对于极高温度，选择 100 摄氏度，然后点击 CC1 八分钟，持续点击直至选中 CC1 64 分钟。点击抑制剂，然后选择 DISCOVERY 抑制剂，孵育时间选择八分钟。

然后点击“抗体”，接着选择“高温抗体孵育”。对于低温条件，选择 37 摄氏度。对于抗体，从分配器标签中选择 ANTIBODY 6。

对于延长孵育时间，选择 32 分钟。点击多聚体 HRP，然后选择多聚体 HRP 封闭剂。接着在抗体封闭步骤中，选择 Gt Ig 封闭剂。

孵育时间选择4分钟。接下来，在多聚体HRP试剂处选择OMap Anti-Rb HRP，孵育时间选择16分钟。然后点击Cy5，长孵育时间选择0小时8分钟。

单击“双序列”并选择抗体变性。然后选择抗体变性CC2-1，对于“非常高温度”，选择100摄氏度。确保孵育时间为8分钟。

接下来，单击 DS 抑制剂并选择中和。单击 DS 抗体，对于极低温度，选择 37 摄氏度。然后在抗体中，从分配器标签中选择 ANTIBODY 3。

对于“Plus孵育时间”，选择32分钟。点击DS Multimer HRP，选择DS Multimer HRP封闭剂。然后在“抗体封闭”步骤中选择Gt Ig Block，孵育时间选择4分钟。

接下来，在多聚体 HRP 试剂中选择 OMap anti-Ms HRP，并将孵育时间设为 16 分钟。然后点击 DS Rhodamine 6G，将长时间孵育时间设为 0 小时 8 分钟。点击三重染色，选择 TS 抗体变性，然后选择抗体变性 CC2-2，将极高温度设为 100 摄氏度。

确保孵育时间为八分钟。接下来，点击TS抑制剂并选择TS中和。点击TS抗体，并为极低温度选择37摄氏度。

然后在抗体步骤中，从分配器标签中选择抗体7（ANTIBODY 7），孵育时间选择32分钟。点击TS Multimer HRP，选择TS Multimer HRP阻断剂。接着在抗体阻断步骤中选择Gt Ig Block，孵育时间为4分钟。

接下来在多聚体 HRP 试剂中选择 OMap Anti-Rb HRP，并在孵育时间中选择 16 分钟。然后点击 TS FAM，在长孵育时间中选择 0 小时 8 分钟。点击保存，并为该实验方案添加标题。

选择一个方案编号，添加注释，然后点击“激活”，接着点击“保存”。将供应商提供的福尔马林固定石蜡包埋的人体组织切片放入设定为 70 摄氏度的烘箱中烘烤 20 至 60 分钟。在切片烘烤的同时，通过在自动染色机软件中点击“创建标签”来打印标签。

接下来，点击“实验方案”，选择方案编号，然后点击“关闭/打印”。在载玻片标签上填写相关信息，然后点击“打印”。从烘箱中取出载玻片，使其冷却至室温。

将先前打印的实验方案标签贴至相应的载玻片上。根据抗体标签编号，向可重复填充的抗体分配器中加入相应的抗体。用指定的稀释液稀释每种抗体，并对可重复填充的抗体分配器进行预灌注。

收集封闭、检测和扩增用的预装试剂分配器，并将其放置在仪器试剂托盘上。将载玻片装入载玻片抽屉中，点击“运行”，然后点击“是”。通过查看自动染色机软件上的运行时长，确认运行已开始。

第二天，通过观察载物片抽屉槽上的绿色闪烁灯确认运行已完成。然后将载物片从仪器上取下，用1×反应缓冲液彻底冲洗载物片，直至完全去除盖玻片液体溶液。将SYTO 13替换为5,000 纳摩尔的SYTO 64，以实现荧光染料的整合。

将SYTO 64用1x TBS稀释，在湿盒中孵育15分钟。对DISCOVERY Fam使用FITC，并将曝光时间设为200毫秒。对DISCOVERY Rhodamine 6G使用Cy3，并将曝光时间设为200毫秒。

使用Texas Red检测SYTO 64，并将曝光时间设置为50毫秒。指定SYTO 64为对焦通道，最后使用Cy5检测DISCOVERY Cy5。将曝光时间设置为200毫秒，并保存更改。

将福尔马林固定、石蜡包埋的细胞沉淀切片置于70摄氏度的烘箱中烘烤20至60分钟。在空间分析平台上扫描载玻片，并选择50微米和300微米的尺寸。自动化可视化方案的设计中包含了留一法对照，以确认相邻通道之间无信号串扰。

空间蛋白质组学检测中包含的所有标志物的log 2热图显示，手动泛细胞角蛋白CD 45方案（黑色）与自动化3重检测方案（灰色）相比，Spearman R值为0.88。在检测中使用的31种抗体中，有23种抗体的Spearman R值大于或等于0.5。空间转录组学检测中所选靶标的log 2热图显示，手动泛细胞角蛋白CD 45方案（黑色）与自动化3重检测方案（灰色）在这些数值上存在差异。

与全细胞角蛋白CD45手动可视化方法相比，3重自动可视化方法的测序数据值较低，这一点也反映在较低的Spearman R值（0.15）上。此外，在使用3重自动可视化方法时观察到动态范围的降低。在空间转录组学方法中，通过选择直径为50微米和300微米的圆形感兴趣区域来检测小尺寸感兴趣区域；在归一化后，不同细胞系中选定靶标的RNA计数在两种不同尺寸的感兴趣区域内具有可比性。

研究人员可通过更换标记物来调整本自动化可视化面板方案，从而开发出精确定义感兴趣区域（ROI）的检测面板，以回答其空间蛋白质组学问题。