基于2D和3D人诱导多能干细胞的模型，用于剖析新皮质发育过程中原发性纤毛受累

我们在这里详细介绍的手术的总体目标是剖析新皮质发育过程中原发性纤毛的受累。原代纤毛已被证明对新皮质发育的许多步骤至关重要，包括祖细胞扩增，命运决定以及神经元迁移和成熟。为了进一步剖析新皮质发育过程中的细胞受累，我们利用新兴的2D和3D iPS基于细胞的新皮质发育模型来设置相关工具。

换句话说，神经玫瑰花和背前脑类器官。基于3D iPS细胞的模型始于胚状体形成。所述胚状体的粘附，允许产生2D神经玫瑰花结构，而这种EB的自由漂浮培养允许产生背前脑类器官。

我们建立的产生脑类器官的方案是基于先前发表的使用呕吐方法的方案，通过使用激活素节点和BMP途径的抑制剂，添加预模式因子来特异性地产生背前脑类器官，也称为双重SMAD抑制。为了利用类器官的3D组织，我们建立了一种简单快速的方法，允许以高分辨率对整个类器官进行全免疫标记，清除和照明采集。为了关注原发性纤毛的生物发生和功能，我们在用振动切片机切割的自由漂浮切片上应用了免疫组织化学。

在免疫染色和清除切片后，我们使用共振扫描共聚焦显微镜获取图像。从含有大的常规菌落的iPS细胞培养物开始，表现出小于10%的分化并且不超过80%的符合性。使用针头手动解剖每个iPS细胞集落，允许在水平和垂直方向上精确地捕获每个菌落，以创建棋盘图案，将每个菌落分成相等的簇。

使用细胞刮刀分离菌落，并将其转移到超低附着力培养板上。让它们在培养箱中漂浮过夜，以便它们可以形成胚胎状体。第二天，将培养基翻转，注意不要吸出胚胎体，并将它们转移到聚-L-鸟氨酸层粘连蛋白包被的培养皿中，直到形成神经玫瑰花。

这大约需要12到14天。每日刷新诱导，中等，并在显微镜下检查神经玫瑰花结构的形成。从这一步开始，神经玫瑰花可以被扩增、分化和处理以进行免疫染色分析或解离，以获得分离的神经干和祖细胞培养物。

首先，从iPS培养物开始，这些培养物含有表现出小于10%分化的大常规菌落，并且几乎在单层上通过一次。在第0天，让iPS细胞在含有低浓度fJ2和高浓度ROCK抑制剂的EB培养基中形成胚胎体，这是hiiPS细胞存活所必需的，以避免在不更换培养基的情况下干扰EB形成培养箱板三天。在第三天，EB的测量值应约为400微米，并显示规则的边界。

如果过去的标准对于大多数EB来说很丰富，那么用含有双SMAD抑制剂的诱导培养基改变培养基，当然可以使对位DB增亮6到7，这表明神经托玛利松弛。它们将其他数据库转化为总因子减少的基底膜指标。从这一步中，始终使用无菌剪刀来获得肽的开口，以避免对类器官的损害。

首先将约15个类器官转移到临床管中。让EB沉降并除去50微升诱导培养基二，并将类器官转移到含有100微升基质的微敏管中，并通过上下移液匀浆。将混合物铺展到中性连接板孔的中心。

最后，太空EB使它们不会相互接触，以避免它们融合。让物质在培养箱中凝固45分钟，向每个孔中加入两个诱导培养基，并在培养箱中孵育。每隔一天刷新两次感应培养基。

在第17天，通过用5ml移液器上下移液10次来手动解离基底膜基质。在搅拌下将类器官板在翻译培养基中孵育，以改善营养吸收。重要的是，使用不同的培养箱进行固定培养和在轨道振荡器上培养，以避免任何对贴壁iPS细胞生长有害的振动。

固定后，通透性，阻断和孵育一抗和二抗需要10天，包括洗涤步骤。我们偏爱的清算方法依赖于乙二醇衍生物TDE。为了获得最佳清除效果，在TDE溶液中插管类器官，每次逐渐增加浓度24小时。

对于类器官包埋，使用由一毫升注射器制成的定制主成型系统，使用手术刀切断尖端。建议使用低熔点琼脂糖，因为它的熔化温度仅为约60摄氏度。在60%TDE溶液中制备4%低熔点琼脂糖，并在水基前类器官嵌入中冷却约37摄氏度。

使用柱塞放入注射器中600微升的凝胶溶液，然后定位样品并用400微升凝胶溶液填充注射器。让凝胶聚合，最后，样品理想地安装在凝胶内，并且可以在发光室内轻松推出，以将类器官定位在物镜前方。发光荧光显微镜是这种透明类器官的首次成像的理想选择。

我们减少了照片成像并权衡了亚蜂窝分辨率。在这里，我们使用20倍物镜浸入样品室中加入的80%TDE溶液中，以便根据我们的清除方法的折射率进行精确调整。最大的样品订单设计为容纳一毫升注射器，该注射器可以从顶部插入柱塞，柱塞可以在样品订单安装后操作，以将类器官定位在物镜前面。

获得整个类器官大约需要5到10分钟。对于自由漂浮部分的免疫染色，收集并在四人部分在四摄氏度下过夜固定您的类器官。将类器官嵌入4%低熔点琼脂糖中，并使用振动切片机获得在PBS溶液中转移的150微米的六个切片，使用画笔避免损坏它们。

在透化和阻断后，用一抗在4摄氏度和搅拌下孵育自由漂浮的切片过夜。在室温和搅拌下用二抗孵育两小时之前，仔细清洗切片。最后，为了获得最佳清除效果，将切片在TDE溶液中孵育，浓度逐渐增加一小时，在60%TDE中孵育30小时，然后在室温下在80%TDE中孵育过夜。

将切片储存在80%TDE和TLAC溶液中，温度为4摄氏度。在细胞室中安装自由浮动切片，努力将样品保持在80%TDE溶液中，并设计用于适应临床显微镜的电动阶段。首先，在腔室中放入一个圆形盖玻片，然后用画笔小心地转移透明保护。

用80%TDE溶液填充腔室，然后添加两个标准盖玻片加上一个第二轮盖玻片和硅密封。最后，拧紧腔室的拧紧环以完美密封系统。夜场以及共振采集都通过一个软件进行处理，该软件可以实现3D利用和对整个免疫染色样品的分析。

这样的软件允许您快速打开我们生成的海量数据，轻松制作快照和动画。它允许以不同的方向移动样品，并且由于不同方向的2D切片器工具，例如X，Y和Y，Zed，我们可以生成图像的2D视图。此外，这种软件可以自动检测中心体和原发纤毛，从而能够量化病理与对照条件下的数量。

它还允许原发纤毛的3D重建，以精确测量位点。我们描述的基于2D iPS细胞的新皮质发育建模的方案允许生成包含新皮质祖细胞和神经元的神经玫瑰花结构，类似于在发育中的新皮质中看到的神经元。可以通过常规免疫染色分析进行详细的验证。

适用的祖细胞应与我们一起进行双重染色以影响敏感性，而中间祖细胞应通过TBI2染色显示，早期骨新皮质神经元应通过CTIP2阳性染色显示。这种神经玫瑰样结构模拟自由基祖细胞的动力学间核迁移，可以通过免疫染色针对磷酸化葡萄球菌素的抗体来可视化，这些抗体会染色运动核和维持有丝分裂纺锤体的TBX2。最后，纤毛发生可以通过免疫染色来分析，抗体针对近纤毛，该抗体会染色原发性纤毛的后体，并且具有某些染色公理的手段。

在这种玫瑰花结构上，从顶端多发性Fabri-Kal祖细胞中提取的原代纤毛并密集地位于每个脑室酸盐区域的中心腔上方，同时它们也从CTIP2阳性神经元中突出。腺酮状玫瑰花的解离允许产生孤立的神经干和祖细胞培养物，这些培养物对于分析原代纤毛的生物发生和功能非常有用。特别是，我们详细介绍了在用推荐的声波药物或渗透素激动剂治疗后测试声波药物途径诱导的程序。

随后的RTPCR SA测试了sonica药物靶基因（如GLI1和PTCH1）的诱导，免疫荧光分析测试了沿着初级纤毛的关键声波药物成分的动力学，这些成分得到了量化，这要归功于开源工具，ilastik和CiliaQ。研究了不同的纤毛参数，包括长度和方向，但此处还显示了GLI2和GPR161的初级纤毛成分的强度，它们分别响应推荐的sonica药物治疗而累积或退出原发性纤毛。我们详细介绍的基于3D iPS细胞的新皮质发育建模的方案允许产生具有背前脑身份的同质性脑类器官，可以通过常规免疫染色分析或女性染色来表征，如图所示，同时对分别染色神经元钙粘蛋白的抗体进行最佳渗透， 在粉红色中，顶端祖细胞在心室区域样区域，在绿色中，以及所有新生的新皮质神经元，位于皮质板样区域。

这是整个免疫染色类器官的第二部电影，抗体再次升高，CTIP2为红色，可能保持粉红色，TPX2为绿色，允许测试新皮质祖细胞的几个特征，例如Fabri-Kal祖细胞的动力学核迁移。有趣的是，在室上带样区域也观察到磷酸化细胞阳性祖细胞，并具有延伸到正表面的独特阳性过程，让人联想到外径向神经胶质祖细胞，并说明了该方法的高分辨率。这是一部免疫染色，自由漂浮部分的电影，由于共振扫描显微镜获得，该显微镜显示检测到的原发纤毛与毛孔素抗体一起染色，该抗体将身体后部染成绿色，ARLT3B抗体将公理染色为粉红色。

原代纤毛从所有神经元干和祖细胞延伸，特别是在表皮祖细胞的表皮表面，但也在前板样区域的新皮质神经元中。最后，2D神经元玫瑰花和分离的干细胞和祖细胞概括了大脑皮层发育的几个方面，并代表了测试睫状体生物发生和功能的互补，有用的工具。我们在这里检测到的方案使我们能够从这种独特的iPS细胞系中成功产生背前脑类器官，从而产生均匀的结果，从而确保该程序的稳健性。

我们为整个类器官或自由漂浮切片的免疫染色、清除和成像而建立的方案简单、快速且具有成本效益。结合这种基于细胞的模型和对iPS细胞的3D成像分析，通过重新编程睫状体扰动细胞或使用CRISPR 9技术特异性编辑纤毛基因来生成，应该允许在理解原发性纤毛在大脑皮层正常和病理发育过程中的贡献方面取得重大进展。