Name: 秀丽隐杆线虫运动障碍评估 肌萎缩性侧索硬化症模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习使用径向运动实验和游泳实验评估秀丽隐杆线虫运动障碍的方法，用于肌萎缩性侧索硬化症模型研究。这些定量检测技术可帮助研究人员区分不同品系的运动表型差异。

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感谢审稿人提出的有益评论和建议。感谢Aleen Saxton、Brandon Henderson和Jade Stair提供的出色技术协助。感谢Brian Kraemer和Rebecca Kow在建立这些检测方法过程中提供的帮助。本研究工作得到了美国退伍军人事务部（VA）Puget Sound医疗保健系统资源和设施的支持。本研究由美国退伍军人事务部（U.S. Department of Veterans Affairs, VA）生物医学实验室研究与发展服务局资助[优秀研究奖项目#I01BX004044，授予N.F.L.]

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作者声明无任何利益冲突。

径向运动： 
该实验的分辨率可通过调整时间变量轻松控制。延长实验时间有助于观察表型严重个体之间的差异，从而识别细微差别。然而，由于该实验测量的是位移，若实验时间过长，运动能力正常的线虫（如 N2）会移动至培养皿边缘，其觅食行为将导致回溯运动，从而人为地降低行进距离的测量值。时间过长可能导致不同品系间的差异消失，尤其是运动表型较轻微的个体之间，因为线虫会均匀分散在整个培养皿上。缩短时间变量可防止活动性较强的线虫到达培养皿边缘。该方法并不记录每条线虫的总移动距离，而是将每条线虫的移动距离压缩为从培养皿中心出发的直线距离。因此，与记录单个线虫总轨迹长度的方法相比，其内在稳健性较低。然而，径向运动实验对研究人员的技术要求极低，所用试剂相对便宜且在大多数线虫实验室中均易获得，并且具有足够的灵敏度以产生显著且可重复的结果。对于倾向于使用自动视频追踪的实验室，已有多种方法被建立用于追踪和分析爬行运动12，或者本文中游泳实验所用的软件参数也可进行调整，以实现对爬行行为的检测与分析。
该实验通常设置三个独立的重复组，每组包含30至40条线虫。每个重复组被平均分配到两个不同的100 mm或150 mm培养皿中，每皿放置15至20条线虫。若每皿线虫数量超过推荐值，可能导致评分效率降低。总评分数量达到90条以上时，足以有效检出轻度、中度或重度运动能力损伤的显著性差异。在对不同品系进行评分时，保持时间点的一致性对于实验的准确性与可重复性至关重要。通常情况下，30分钟已足以区分中度至重度表型差异，例如表达人类突变型TDP-43的转基因品系与野生型线虫之间的差异（图4）。若需延长观察时间，建议将培养皿尺寸从100 mm增加至150 mm。环境因素（如温度和湿度）可能影响本实验结果，实验通常在室温条件下进行，因此在不同重复组之间比较时，必须始终设置野生型（N2）对照组。此外，该实验还可用于检测某些在液体中无法正常游泳（即“抽打”运动）品系的运动能力，因而可作为游泳实验的有益补充。
游泳实验： 
利用成像与采集系统对线虫游泳行为进行自动追踪与分析，可获得严谨且无偏倚的数据。然而，在实验初始设置过程中，有多个因素需要在不同样本间保持一致。这些因素包括：线虫在开始记录前在液体中适应的时间、环境条件（即温度、湿度）以及恒定的光照和录像设置。在记录平台上，有若干设计有助于减少不同培养皿之间的变异。这些设计包括：集成的轨道式摄像头和明场载物台，可确保不同培养皿间的视频记录一致性；围绕载物台的遮蔽装置，可防止反射、眩光和记录过程中的空气流动；以及一套功能强大的软件包，能够可靠地识别线虫，并允许在视频后期处理中对手动校正轨迹。在本实验方案中，对盛有线虫的35 mm培养皿进行1分钟的视频录制，随后使用该软件包进行处理。处理完成后，通过手动校正轨迹，确保线虫行为被准确记录，避免追踪错误的干扰。通过转体次数和轨迹持续时间数据，计算每分钟转体次数作为最终的检测指标。为确保可重复性，数据需来自至少3次独立的重复实验，每次实验评分40–50只动物，最终合计动物总数达到120–150只。该样本量足以区分实验组与对照组线虫在游泳行为上的微小差异。某些线虫的运动功能缺陷过于严重，无法通过游泳实验有效检测。例如，若将线虫置于液体介质中时其身体蜷缩，而非表现出预期的抽打样运动，则该实验无法准确记录其运动行为，此时可采用其他运动检测方法，如径向运动实验，以更有效地评估此类运动缺陷。本方案所用为 commercially available imaging system（参见材料表了解详细信息），但其他线虫追踪系统也可能提供类似功能，其中部分系统为开源系统12。已有文献报道了对线虫抽打行为进行人工评分的方法13。尽管自动分析可为每条线虫提供多种行为参数，但以每分钟身体弯曲次数（即每分钟抽打次数）作为检测指标，可在不同实验间提供一致的结果，并与传统的人工目测评分高度吻合。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致残性的与衰老相关的神经退行性疾病，主要影响运动神经元。该病的特征是大脑和脊髓中的运动神经元丧失以及进行性运动功能障碍，导致严重的功能残疾和过早死亡，通常在确诊后3-5年内发生。1至少38个基因的突变可导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）；然而，大多数ALS患者的主要病理特征是在神经元和胶质细胞中出现泛素化修饰的TDP-43蛋白包涵体2,3,4已开发出多种动物模型，用于研究导致或促进肌萎缩侧索硬化（ALS）的潜在机制 体内 （综述见于5). 在 秀丽隐杆线虫， 这些模型包括ALS致病基因同源物的遗传性功能缺失突变，或人类ALS基因的转基因表达。在ALS建模中具有多种优势 秀丽隐杆线虫. 秀丽隐杆线虫 是一种易于操作的简单动物，具有分化的神经系统、特征明确的行为范式，以及与人类高度保守的遗传同源性6,7. 目前有许多工具可用于处理 秀丽隐杆线虫，包括强大的基因组编辑能力， 体内 神经退行性变的荧光报告系统、RNAi筛选范式、可操作的遗传学方法，以及成熟的行为学与表型检测手段。 秀丽隐杆线虫 ALS 模型再现了人类疾病的部分特征，包括不溶性蛋白的积聚、神经退行性变以及早亡8,9此外，许多情况下存在运动功能障碍，表现为爬行和游泳行为均出现异常。 秀丽隐杆线虫 ALS 模型
本实验方案描述了两种用于表征C. elegans运动表型的方法：径向运动实验用于评估线虫在固体表面的爬行行为，以及利用WormLab自动化追踪与分析系统对液体中游泳（抽搐）行为进行评估。这些灵敏的运动功能缺陷表征方法可实现对表型严重程度的比较，并为检测运动表型的抑制或增强提供工具。径向运动实验可量化不同线虫群体在固体表面进行正弦波状爬行运动能力的差异。该实验利用C. elegans自然的无刺激探索行为，将线虫放置于培养皿中的单一位置，并在设定时间段后标记其最终位置10。另一种方法为液体中游泳（抽搐）实验，通过统计单个线虫在固定时间内的体部弯曲次数来评估运动能力。人工肉眼计数体部弯曲耗时较长，且不同实验操作者之间通常存在较大变异性。采用计算机辅助的自动化追踪与分析可显著减少此类变异性。除了用于表征肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型的基础运动功能障碍外，径向运动和游泳实验均可检测遗传或小分子干预所引起的特定运动表型的改变。这些方法适用于研究ALS&#160;模型以及任何表现出运动能力异常的C. elegans品系。

<table><tbody><tr><td>C. elegans</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>-</td><td>可根据需要获取菌株，N2 是一种有用的对照菌株</td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>用于制作线虫挑针的玻璃吸管——一手持玻璃吸管，另一手持约1&quot;长的铂丝（用镊子夹住），在火焰上加热连接。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一次性培养皿，35×10 mm</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>WormLab 成像系统的检测用培养皿</td></tr><tr><td>一次性培养皿，60×15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-090</td><td>线虫保种用培养皿</td></tr><tr><td>一次性培养皿，100×15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>标准径向运动检测培养皿</td></tr><tr><td>一次性培养皿，150×15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>长时间径向运动检测培养皿</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>用于线虫培养及设置径向运动检测</td></tr><tr><td>细头标记笔</td><td>VWR</td><td>52877-810</td><td>径向运动检测至少需要两种颜色，需使用细头以确保精确度</td></tr><tr><td>平板扫描仪</td><td>Amazon</td><td>Epson Perfection V850</td><td>径向运动检测可选设备。本方案假设分辨率为300 dpi，大多数扫描仪均可满足要求</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>-</td><td>NIH 提供的可选免费软件 — https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>M9 缓冲液</td><td>VWR</td><td>IC113037012</td><td>用于游泳检测的介质。可自行配制，参见 WormBook：C. elegans 的维持</td></tr><tr><td>NGM（线虫生长培养基）</td><td>VWR</td><td>76347-412</td><td>用于培养 C. elegans 的培养基。可自行配制，参见 WormBook：C. elegans 的维持</td></tr><tr><td>OP50&amp;nbsp;细菌</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>OP50</td><td>C. elegans 的主要食物来源</td></tr><tr><td>p1000 移液器</td><td>VWR</td><td>76207-552</td><td>移液器，用于游泳检测</td></tr><tr><td>p1000 吸头</td><td>VWR</td><td>83007-384</td><td>移液器吸头，用于游泳检测</td></tr><tr><td>铂丝，直径 0.2032 mm</td><td>VWR</td><td>BT136585-5M</td><td>细规格铂丝，用于制作线虫挑针——一手持玻璃吸管，另一手持约1&quot;长的铂丝（用镊子夹住），在火焰上加热连接。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>直尺</td><td>VWR</td><td>56510-001</td><td>用于评分径向运动检测结果</td></tr><tr><td>WormLab 成像系统</td><td>MBF Bioscience</td><td>WormLab</td><td>该成像系统包括 WormLab 硬件（明场载物台、相机和外壳）和 WormLab 软件。https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td></tr></tbody></table>

肌萎缩侧索硬化症的 c. elegans 模型中运动功能障碍的评估

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）以运动神经元进行性丧失为特征，伴随肌肉无力和运动功能障碍，并随时间推移而加重。尽管在明确部分患者ALS的遗传驱动因素方面已取得显著进展，但大多数病例的病因仍不明确。此外，运动神经元功能障碍和退变的潜在机制尚未被充分阐明；因此，迫切需要建立并表征具有代表性的疾病模型以研究这些过程。 秀丽隐杆线虫 能够根据周围环境的物理限制调整其运动方式，在实验室环境中主要研究两种运动模式——在固体表面爬行和在液体中游动。这两种模式体现了感觉、运动神经元与肌肉之间的复杂相互作用。 秀丽隐杆线虫 肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型可能在这两种运动模式中表现出一种或两种功能受损。本方案描述了两种用于评估运动能力的敏感检测方法 秀丽隐杆线虫：一种优化的径向运动检测方法，用于测量在固体表面的爬行，以及一种自动追踪和分析液体中游泳（抽搐）行为的方法。除了可用于表征肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型的基础运动功能障碍外，这些检测方法还能检测遗传或小分子干预对表型的抑制或增强作用。因此，这些方法在ALS研究中具有重要应用价值&#160;模型及任何 秀丽隐杆线虫 运动性发生改变的菌株

径向运动和游泳实验均可灵敏地检测运动能力障碍（图4 和 图5）。为研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）中TDP-43病理机制，已建立表达野生型或ALS突变型人源TDP-43的C. elegans模型，其在全神经元中表达。这些动物表现出类似ALS的分子与细胞特征，包括运动功能障碍9。重要的是，在径向运动和游泳实验中均发现，表达野生型人源TDP-43的动物表现出中度运动能力障碍，而表达ALS突变型TDP-43的动物则表现出更严重的运动能力障碍。某些突变型或转基因动物在爬行方面的障碍可能比游泳更显著，反之亦然。通过采用两种不同的运动能力检测方法，能够更清晰地揭示不同品系之间的表型差异。
径向运动 
当秀丽隐杆线虫（C. elegans）被放置在接种了细菌的琼脂平板上时，它们会探索周围环境，包括趋向食物源的边界。径向运动实验可利用这种行为作为评估其身体机能的一种指标。通过以受控且可量化的方式分析线虫的运动行为（在固体表面爬行），径向运动实验为评估运动功能障碍及其他与运动相关表型的严重程度提供了一种简单而有效的工具。径向运动实验能够检测中度或重度受损的肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型线虫在运动能力上的差异，并为比较运动表型的调节作用或随年龄变化的运动能力改变提供基线依据（图6）。该策略可用于量化任何与野生型（N2）或对照线虫相比运动能力发生改变的品系的爬行行为。然而，对于无法正常爬行的动物，例如滚动突变体（roller mutants）或瘫痪个体，该方法可能并不适用。通常情况下，野生型线虫在20 °C条件下培养并测试时，其平均位移约为200–300 µm/min。在图4中展示的示例数据比较了以下品系的预期结果：N2、两种表达野生型人源TDP-43且表型较轻的转基因品系[TDP-43(WT-轻度)，CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] 或表型较明显的品系[TDP-43(WT-中度)，CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]、一种表达突变型人源TDP-43且具有严重表型的转基因品系[TDP-43(M337V)，CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]，以及另一种表达与神经退行性疾病相关蛋白——野生型人源tau蛋白的转基因品系[tau(WT)，CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]。通过径向运动实验检测发现，表达野生型TDP-43的两个品系表现出不同程度的运动障碍。TDP-43(WT-低)与N2之间无显著差异，而TDP-43(WT-高)则表现出明显的运动能力差异。TDP-43(M337V)和tau(WT)品系的运动障碍更为严重。
游泳实验 
C. elegans 在液体中浸没时会表现出典型的游泳（抽搐）运动。一旦被浸入液体，线虫即开始以约45°的弯曲角度特征性地将头部和尾部相互靠近，弯曲顶点位于虫体中点。线虫交替向腹侧和背侧方向弯曲。软件所测量的一次“抽搐”定义为虫体从伸直状态弯曲至体角达到20°或更大的过程，不考虑弯曲方向（角度阈值可在后期处理中于分析和绘图窗口内进行调整[工作流程 | 分析数据 | 体型分析 | 弯曲角度 | 中点 | 振幅阈值：#度]）。此处描述的游泳实验采用基于计算机的自动化追踪与分析，以实现对游泳活动的无偏评分。预期野生型（N2）线虫在20 °C条件下培养并记录时，每分钟平均抽搐次数为150–200次。图5中展示的示例数据比较了N2、两种表达野生型人源TDP-43且表型较轻[ TDP-43(WT-轻度)，CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])]或表型较强[ TDP-43(WT-中度)，CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]的转基因品系，以及一种表达另一种与神经退行性疾病相关蛋白——野生型人源tau蛋白的转基因品系[tau(WT)，CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]。表达ALS突变型TDP-43 [TDP-43(M337V)]的转基因品系在液体中不发生抽搐，因此在图中以ND（无数据）表示。该实验能够区分出与图4所示径向运动实验不同的表型。例如，在径向运动实验（图4）中，TDP-43(WT-低)与N2之间无显著差异；但在游泳实验（图5）中，TDP-43(WT-低)和TDP-43(WT-高)均与N2存在显著差异，且彼此之间也有显著差异。此外，尽管TDP-43(M337V)和tau(WT)在径向运动中均表现出严重的爬行障碍（图4），但只有tau(WT)能够产生足够的抽搐动作，从而被软件有效追踪（图5）。TDP-43(M337V)个体无法抽搐，基于软件的分析无法准确检测或追踪这些线虫，因此未收集其相关数据（ND，无数据）。
<img alt="线虫运动实验步骤：显微镜设置、计时器使用、距离测量、指定琼脂平板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：径向运动分析实验流程。 图中 A-E 展示了径向运动分析的一般步骤。具体如下：（A）制备NGM平板，将OP50菌液接种至平板边缘，并标记中心点；（B）将线虫放置于琼脂平板中心，即中心点所标位置；（C）让线虫自由移动一段设定的时间；（D）将平板翻转，使底部朝上，并用不同于中心点的颜色标记每条线虫的最终位置；（E）通过手动或数字方式测量从中心点到每条线虫最终位置的距离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="培养皿测量过程；图像分析，10毫米标线，用于科学分析的电子表格数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用 ImageJ 进行最终位置的数字化测量。 距中心距离可通过手工或数字化方式测量。要使用 ImageJ 进行数字化测量，(A) 将带有尺子的平板背面进行扫描，确保尺子位于画面中。( B) 使用直线工具绘制一段已知长度。( C) 利用步骤 (B) 中绘制的已知长度设置比例尺 [分析 | 设置比例尺…]。( D) 使用直线工具从中心点向最终位置标记绘制直线，并对每个标记重复此操作。( E) 使用画笔线条标记第一个已测量点，有助于计分（靠近标记“1”处的波浪形黑线）。最终位置标记以黄色编号，以显示计分的方向性。( F) 测量结果将记录在“结果”窗口中。请将结果另存以用于统计分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="材料、WormLab 设置、相机调整过程；用于线虫排列/观察的实验检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：使用软件所需的材料与硬件调整。（A）用于软件辅助游泳检测的材料。（B）软件及所需材料的整体设置，注意此时外壳处于抬升位置。（C）镜头安装支架的高度可进行调节。本图显示了可调节的滑轨以及标记进行游泳检测时推荐高度的胶带指示。在开始录制前，必须调整明场光源和相机焦距。（D）将35 mm检测板放置于载物台上，在板中加入M9中的线虫，并启动1分钟计时器。（E）有时轻轻旋转培养板有助于将线虫移至中心区域——可通过实时捕获屏幕观察其位置；或者，也可使用移液器滴加几滴M9溶液以分离线虫。（F）调节相机镜头上的对焦环，并在屏幕上观察线虫以确定最佳焦距。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示轴突运输速率的柱状图与散点图。TDP-43 与 tau 变体之间的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：径向运动实验可检测爬行速度的差异。 使用上述径向运动实验方法测量发育阶段一致的 L4 幼虫在无刺激条件下的扩散情况，并以每分钟移动的微米数（µm/min）作图表示（A-B）。在（A）和（B）中展示的相同数据体现了两种不同的图形呈现方式。在（A）中，数据以柱状图形式展示，使不同品系间的相对差异更为清晰；在（B）中，每条线虫的最终位移在图中单独标出，从而更直观地反映群体内的变异程度。为评估各品系间的显著性差异，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。**p=0.0022，****p&lt;0.0001，ns=无显著性差异。TDP-43(M337V) 和 tau(WT) 与 N2 相比也具有显著差异，p&lt;0.0001。图（A）中的误差线表示均值的标准误（SEM），图（B）中则表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TDP-43 甩动速率柱状图与散点图，比较 N2、WT-轻度、WT-中度、M337V 和 tau。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：游泳实验可检测液体中甩动行为的差异。 游泳速率（液体中的甩动或波动频率）采用上述无偏计算机辅助评分与分析方法测定，并以每分钟甩动次数（thrashes/min）表示（A-B）。相同数据分别在（A）和（B）中展示。 在（A）中，数据以柱状图形式呈现，便于观察不同品系间的相对差异；在（B）中，每个被评分个体线虫的数据均在图中单独标出，从而更清晰地展示群体内的变异情况。为评估各测试品系间的显著性差异，采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。****p&lt;0.0001，ns=无显著性差异。TDP-43(WT-中度) 和 tau(WT) 与 N2 相比也具有显著差异，p&lt;0.0001。（A）中的误差线表示均值标准误（SEM），（B）中则为标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TDP-43突变体与野生型酵母在琼脂平板上的生长对比，遗传分析实验比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62699/62699fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：TDP-43突变体线虫的移动距离短于野生型线虫。 平板展示了同步化L4期N2（野生型）与TDP-43(M337V)（CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])）线虫在室温下无刺激爬行1小时后最终位置的代表性差异，该品系表达具有严重运动功能障碍的突变人源TDP-43蛋白。平板以红点标记中心位置，蓝点标记动物的最终位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/62699fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：使用成像与追踪软件记录游泳行为。（A）追踪工作流程及视频捕获图标的位置。（B）在实时预览模式下显示的视频捕获窗口，其中最重要的部分已标出。当启动录制按钮后，绿色的“实时预览”字样将变为红色的“正在录制”。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：准备和追踪游泳行为。该图展示了一系列截图，以帮助设置用于追踪的视频图像序列。准备视频序列的一般流程是按以下顺序依次打开各个工作流菜单：导入图像序列 | 设置序列信息 | 调整图像 | 检测与追踪 | 保存项目。分析数据窗口仅可在项目文件完成追踪后使用。（A）显示了在追踪工作流中将序列导入软件后打开的.avi（视频）文件。（B）设置序列信息窗口可用于添加备注、设置/更改标尺，并查看视频序列的元数据。更改标尺的操作说明位于此窗口中，当摄像机被升高或降低时应遵循该说明（B）。（C）图像显示了调整图像窗口的设置。（D）截图显示了检测与追踪窗口中的检测选项卡。检测线虫用于训练软件，且必须为每个视频序列单独设置。如有需要，也可在此处设置其他检测参数。（E）为检测与追踪窗口中追踪选项卡的截图，展示了推荐用于追踪游泳行为的设置。这是设置视频序列的最后一步。使用保存项目窗口将序列保存为项目文件。对每个视频序列重复上述步骤。可将设置保存为配置文件，以减少工作量并确保所有序列处理方式一致（图中未显示）。要对项目文件进行批量追踪以用于分析，请进入批量工作流。（F）显示了用于进入批量工作流的图标，（G）显示了批量处理窗口，高亮标出了“添加”和“开始”按钮，并展示了已完成追踪的项目文件的预期显示状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SupFigure2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>
补充图3：游泳行为分析。 项目文件完成追踪后，可通过[文件 | 打开项目]进行打开。如图（A）所示，线虫将以绿色显示。拖动视频进度条可快速检查视频处理是否符合预期，拖动过程中绿色高亮将消失。通过分析数据工作流程项可打开数据分析与绘图窗口。（B）显示了打开位置视图（默认）的数据分析与绘图窗口，所有轨迹均被高亮。数据点下方的图表展示了每条被高亮线虫的记录轨迹。轨迹汇总分析用于计算每分钟转弯次数。（C-D）展示了轨迹汇总报告及导出详情。（E-F）展示了以电子表格形式呈现的轨迹汇总结果，以及如何计算本实验所测定的每分钟转弯次数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62699/Currey2021_JoVEManuscript_SuppFigure3.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了两种灵敏的检测方法，可用于区分肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）的 C. elegans 模型中轻度、中度和重度运动功能障碍，也可广泛适用于运动能力改变的 C. elegans 品系。

肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）的特征是运动神经元进行性丧失，伴随肌肉无力和运动功能障碍。

本方案包含两种用于定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动能力的实验方法。这些方法可用于评估运动表型，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型所表现出的表型。径向运动实验是一种经济且简便的方法，用于检测线虫在固体表面的爬行行为。游泳实验采用基于计算机的追踪技术，以无偏检测线虫在液体中的抽搐运动。这些方法可用于定量分析秀丽隐杆线虫（C.elegans）运动能力的差异。尽管我们研究的是肌萎缩侧索硬化症（ALS），但这些方法也可用于任何运动能力发生改变的品系。将NGM检测平板倒置，并在底部标记待检测的秀丽隐杆线虫（C. elegans）品系的标识符。用记号笔在倒置的平板中心画一个小点。使用解剖显微镜操作时，将线虫转移至检测平板的中央，并设置30分钟的计时器。盖上平板盖子，然后将其放置一旁。继续转移线虫，直到所有品系都置于指定的检测平板上。30分钟后，开始对第一个平板进行评分：打开皿盖，将平板倒置于体视显微镜下。调节显微镜焦距，直至通过螺旋输送器可清晰观察到所有线虫。使用与中心点不同颜色的记号笔，在每条蠕虫所在位置点上一个小点。检查培养皿边缘，因为有些蠕虫可能会移动到边缘处。同时，计数并记录未从中心点移动的蠕虫数量。使用直尺测量每条蠕虫从中心点到最终位置标记的距离，并记录该距离。第一条蠕虫的位置用短划线标记。通过顺时针旋转培养皿，依次记录每个点的长度数据。打开相关软件以设置并录制视频。点击视频录制图标。按下调光旋钮并顺时针旋转以调节光线。在视频采集窗口中，单击设置选项卡，将视频模式调整为 2456x2052_Mono8，帧率设为 14，输出为单色。曝光时间为 0.00300 秒，增益设为 1 dB。伽马值调至1，旋转至180度。返回捕获选项卡，选择录制文件夹，并在文件前缀文本框中输入名称以指定文件名。设置其他捕获参数，如缓冲区为 128 帧，持续时间为一分钟。将已点亮的检测板放置在设备载物台上，并在视频捕获界面中将其居中，然后移除盖子。使用微量移液器将约 50 条线虫用 1 ml M9 缓冲液洗涤至检测板上。轻轻晃动培养板，使线虫聚集到中央，或使用微量移液器加入几滴 M9 缓冲液以分散线虫。设置计时器 60 秒，使线虫适应游泳状态。调节光源旋钮，使视野尽可能明亮但不发生过曝。通过转动相机镜头主体上的对焦环，同时观察显示屏，手动调整相机对焦。60 秒后按下录制按钮，从工作流程菜单中选择第一个按钮“导入图像序列”，找到视频并双击打开。从工作流程菜单中选择“设置序列信息”，在新弹出的菜单窗口中检查命名方案，添加备注，并验证元数据。选择“调整图像”，将打开一个名为“图像调整”的新弹出菜单。通过将背景平滑度设为10，高斯平滑度设为5，填补孔洞设为2，小对象滤波器设为0，并跳过积分导数分割来调整图像处理参数。调节阈值水平，使动物区域完全被绿色填充，但仍与背景清晰区分。然后点击“应用”。从工作流程菜单中选择“检测与追踪”，选择三到七条线虫，然后点击检测选项卡中的“检测线虫”按钮。切换到追踪选项卡，在追踪参数中勾选“使用回溯追踪”，并取消勾选“追踪图像边缘的线虫”。将最大追踪假定设为5。将追踪模式设为游泳。进入高级设置部分，将线虫可接触边界的帧数设为50。框架内线虫可重叠至500个。位置公差为0.50，形状公差为0.50。保存这些设置，并通过将其保存为配置，将设置应用于实验中的所有视频。转到左上角图标菜单中的配置管理器，然后点击“保存”图标。为该配置命名并添加描述。然后点击“Okay”。在工作流程菜单中，点击“Save Project”（保存项目）。通过进入工作流程菜单并点击“Batch”（批量处理）图标来追踪视频。在该批量处理菜单的文件选择部分，点击“Add”（添加）按钮。浏览并选择所有需要处理的项目文件。然后单击“打开”，点击“开始”按钮，并注意第一个文件上的绿色进度指示器。等待所有文件完成处理。当所有文件的读取完成后，关闭软件。选择“分析数据”，导航至轨迹摘要页面，然后使用右下角的“导出”按钮，以可读的电子表格格式导出数据。利用“转数”和“轨迹持续时间”数据，通过电子表格函数计算每条轨迹每分钟的转数。采用径向运动测定法测量了五种不同品系的发育阶段L4幼虫在未刺激条件下的分散情况，并以每分钟移动的微米数表示。数据以柱状图形式展示，使不同品系间的相对差异更加清晰。图中绘制的每条蠕虫的最终位移，有助于更直观地展示群体内的变异情况。在液体中，以摆动或波动频率表示的游泳速率，采用无偏倚的计算机辅助评分与分析方法进行测量，并以每分钟摆动次数的形式绘制成图。柱状图数据使不同品系之间的相对差异更易于观察。每个被评分的单条线虫的数据均在图中绘制，从而更直观地展示群体内的变异情况。在径向运动测定实验中，轻度TDP-43品系与野生型N2品系之间无显著差异。然而，在游泳实验中，无论是弱型还是强型TDP-43菌株，不仅与野生型N2存在显著差异，彼此之间也具有明显不同。ALS突变型TDP-43菌株在径向运动中表现出严重的爬行障碍，且在液体中无法进行甩动运动。表达tau蛋白的菌株在径向运动中也存在严重障碍，但在游泳实验中仍能进行甩动运动。使用这些方法时需要考虑的最重要方面是在重复样本之间保持一致的对照条件。这能确保运动能力的差异是由表型差异引起，而非环境条件所致。这些方法可全面评估两种主要的秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动模式。随访方法可包括额外的行为学表征、生物化学分析，或对肌肉或神经元功能的检测。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

秀丽隐杆线虫运动障碍评估 肌萎缩性侧索硬化症模型

对一种肌萎缩侧索硬化症（ALS）的小鼠模型进行临床和行为学评估。作为配套免疫组织化学分析的前提，本文详细展示了脊髓组织的制备过程。...

用于肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型的临床检测与脊髓取出

本视频展示了通过注射百日咳毒素以及含有模拟髓鞘肽段和佐剂的接种物，在小鼠模型中评估运动功能障碍的过程，随后进行跑台实验以评估运动功能，并评价因免疫激活和脱髓鞘所导致的神经损伤。...

评估实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中的运动功能

本视频演示了使用径向运动实验评估表达野生型或ALS突变型人类TDP-43蛋白的C. elegans中运动功能障碍的方法。让表达不同水平野生型或突变型TDP-43的线虫自由爬行，并通过其在实验平板上从中心点出发所移动的径向距离来测量其运动能力。该实验根据不同C.

使用径向运动检测法评估 C. elegans 模型中的运动功能障碍

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C.

一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

我们提出经过优化的实验方案，可实现 体内...

小鼠后肢肌肉中复合肌肉动作电位（CMAP）的电生理运动单位计数（MUNE）测量

本视频方案描述了一种敏感、可靠且快速的方法，用于评估肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠模型中的神经肌肉功能缺陷。...

一种快速表型神经功能评分系统用于评估ALS的SOD1-G93A小鼠模型中的疾病进展

神经传导测量是评估神经退行性疾病小鼠模型的有用工具，但通常仅用于刺激后肢坐骨神经。本文介绍了一种测量复合肌肉动作电位（CMAP）的技术 体内...

体内电生理记录小鼠运动神经元变性模型前肢复合肌肉动作电位

本研究中，我们展示了基于腹侧平面成像的运动学步态分析方法，用于监测小鼠模型（例如，内吞蛋白突变小鼠品系）随年龄增长出现的运动协调细微变化以及神经退行性病变的进展。...

神经退行性小鼠模型中年龄依赖性运动障碍的步态分析

该技术的目的是从鼠类脊髓中制备高度富集的原代运动神经元（MNs）培养物。为了评估导致运动神经元疾病突变的影响，本文描述了这些分离的运动神经元的获取及其通过磁转染法进行转染的方法。...

建模查理-玛丽-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。...

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

本方案详细描述了一种针对年轻 RAC1/CED-10 突变型 Caenorhabditis elegans...

评估胃肠道蠕动功能 秀丽隐杆线虫 RAC1/CED-10 突变体作为研究早期帕金森病的工具

学习使用径向运动实验和游泳实验评估秀丽隐杆线虫运动障碍的方法，用于肌萎缩性侧索硬化症模型研究。这些定量检测技术可帮助研究人员区分不同品系的运动表型差异。

肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

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