肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

本方案包含两种用于定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动能力的实验方法。这些方法可用于评估运动表型，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型所表现出的表型。径向运动实验是一种经济且简便的方法，用于检测线虫在固体表面的爬行行为。

游泳实验采用基于计算机的追踪技术，以无偏检测线虫在液体中的抽搐运动。这些方法可用于定量分析秀丽隐杆线虫（C.elegans）运动能力的差异。尽管我们研究的是肌萎缩侧索硬化症（ALS），但这些方法也可用于任何运动能力发生改变的品系。

将NGM检测平板倒置，并在底部标记待检测的秀丽隐杆线虫（C. elegans）品系的标识符。用记号笔在倒置的平板中心画一个小点。

使用解剖显微镜操作时，将线虫转移至检测平板的中央，并设置30分钟的计时器。盖上平板盖子，然后将其放置一旁。

继续转移线虫，直到所有品系都置于指定的检测平板上。30分钟后，开始对第一个平板进行评分：打开皿盖，将平板倒置于体视显微镜下。调节显微镜焦距，直至通过螺旋输送器可清晰观察到所有线虫。

使用与中心点不同颜色的记号笔，在每条蠕虫所在位置点上一个小点。检查培养皿边缘，因为有些蠕虫可能会移动到边缘处。同时，计数并记录未从中心点移动的蠕虫数量。

使用直尺测量每条蠕虫从中心点到最终位置标记的距离，并记录该距离。第一条蠕虫的位置用短划线标记。通过顺时针旋转培养皿，依次记录每个点的长度数据。

打开相关软件以设置并录制视频。点击视频录制图标。按下调光旋钮并顺时针旋转以调节光线。

在视频采集窗口中，单击设置选项卡，将视频模式调整为 2456x2052_Mono8，帧率设为 14，输出为单色。曝光时间为 0.00300 秒，增益设为 1 dB。

伽马值调至1，旋转至180度。返回捕获选项卡，选择录制文件夹，并在文件前缀文本框中输入名称以指定文件名。

设置其他捕获参数，如缓冲区为 128 帧，持续时间为一分钟。将已点亮的检测板放置在设备载物台上，并在视频捕获界面中将其居中，然后移除盖子。使用微量移液器将约 50 条线虫用 1 ml M9 缓冲液洗涤至检测板上。

轻轻晃动培养板，使线虫聚集到中央，或使用微量移液器加入几滴 M9 缓冲液以分散线虫。设置计时器 60 秒，使线虫适应游泳状态。调节光源旋钮，使视野尽可能明亮但不发生过曝。

通过转动相机镜头主体上的对焦环，同时观察显示屏，手动调整相机对焦。60 秒后按下录制按钮，从工作流程菜单中选择第一个按钮“导入图像序列”，找到视频并双击打开。从工作流程菜单中选择“设置序列信息”，在新弹出的菜单窗口中检查命名方案，添加备注，并验证元数据。

选择“调整图像”，将打开一个名为“图像调整”的新弹出菜单。通过将背景平滑度设为10，高斯平滑度设为5，填补孔洞设为2，小对象滤波器设为0，并跳过积分导数分割来调整图像处理参数。调节阈值水平，使动物区域完全被绿色填充，但仍与背景清晰区分。

然后点击“应用”。从工作流程菜单中选择“检测与追踪”，选择三到七条线虫，然后点击检测选项卡中的“检测线虫”按钮。切换到追踪选项卡，在追踪参数中勾选“使用回溯追踪”，并取消勾选“追踪图像边缘的线虫”。

将最大追踪假定设为5。将追踪模式设为游泳。进入高级设置部分，将线虫可接触边界的帧数设为50。

框架内线虫可重叠至500个。位置公差为0.50，形状公差为0.50。

保存这些设置，并通过将其保存为配置，将设置应用于实验中的所有视频。转到左上角图标菜单中的配置管理器，然后点击“保存”图标。为该配置命名并添加描述。

然后点击“Okay”。在工作流程菜单中，点击“Save Project”（保存项目）。通过进入工作流程菜单并点击“Batch”（批量处理）图标来追踪视频。在该批量处理菜单的文件选择部分，点击“Add”（添加）按钮。浏览并选择所有需要处理的项目文件。

然后单击“打开”，点击“开始”按钮，并注意第一个文件上的绿色进度指示器。等待所有文件完成处理。当所有文件的读取完成后，关闭软件。

选择“分析数据”，导航至轨迹摘要页面，然后使用右下角的“导出”按钮，以可读的电子表格格式导出数据。利用“转数”和“轨迹持续时间”数据，通过电子表格函数计算每条轨迹每分钟的转数。

采用径向运动测定法测量了五种不同品系的发育阶段L4幼虫在未刺激条件下的分散情况，并以每分钟移动的微米数表示。数据以柱状图形式展示，使不同品系间的相对差异更加清晰。

图中绘制的每条蠕虫的最终位移，有助于更直观地展示群体内的变异情况。在液体中，以摆动或波动频率表示的游泳速率，采用无偏倚的计算机辅助评分与分析方法进行测量，并以每分钟摆动次数的形式绘制成图。

柱状图数据使不同品系之间的相对差异更易于观察。每个被评分的单条线虫的数据均在图中绘制，从而更直观地展示群体内的变异情况。在径向运动测定实验中，轻度TDP-43品系与野生型N2品系之间无显著差异。

然而，在游泳实验中，无论是弱型还是强型TDP-43菌株，不仅与野生型N2存在显著差异，彼此之间也具有明显不同。ALS突变型TDP-43菌株在径向运动中表现出严重的爬行障碍，且在液体中无法进行甩动运动。表达tau蛋白的菌株在径向运动中也存在严重障碍，但在游泳实验中仍能进行甩动运动。

使用这些方法时需要考虑的最重要方面是在重复样本之间保持一致的对照条件。这能确保运动能力的差异是由表型差异引起，而非环境条件所致。这些方法可全面评估两种主要的秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动模式。

随访方法可包括额外的行为学表征、生物化学分析，或对肌肉或神经元功能的检测。