Name: 检测蛋白质低洼构象状态的高压NMR实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 学习高压核磁共振实验技术，用于分析蛋白质构象变化与折叠路径。该方法通过检测峰强度和化学位移变化，揭示蛋白质高能构象状态的结构稳定性与动态特性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了Roy J. Carver慈善信托基金对Julien Roche的资助。我们感谢J. D. Levengood和B. S. Tolbert慷慨提供RRM2样品。

注意：此处所述方案需要 (i) 一台高压泵及配套高压腔，配备额定压力为 2.5 kbar 的铝增韧氧化锆管18，(ii) 软件 SPARKY19 用于NMR谱图分析，以及(iii) 曲线拟合软件。
1. 样品制备、高压池的组装及实验设置。
<ol>
	<li>缓冲液的选择：使用阴离子和阳离子缓冲液的等量混合物，例如磷酸盐和Tris20,21。 
	注意：阴离子缓冲液（如磷酸盐和MES）的pKa值与显著的反应体积相关（即酸与其解离产物的偏摩尔体积之差）。因此，这类缓冲液的pH值会因压力变化而显著改变（约0.25–0.5 pH单位/kbar）。</li>
	<li>确保所需样品体积与标准3 mm直径核磁共振（NMR）管的体积相近（约300 μL）。</li>
	<li>使用玻璃移液管将15N标记的样品加入氧化锆管中。确保样品沉降至管底。加入200 μL矿物油以防止样品与传递液体（例如水）混合，然后用传递液体填充管的剩余部分。</li>
	<li>在氧化锆管顶部安装一次性O型圈，并将管子滑入底座（图1A、B）。随后，将管子连接至高压系留管线，并先用手将底座拧紧至样品池。然后施加14.7 Nm的扭矩，以防止在较低压力下发生泄漏（图1C、D）。</li>
	<li>为检查压力样品池组件的完整性，使用样品池支撑架和 containment vessel 在谱仪外部将管加压至300 bar。保持15分钟，然后将压力重置为1 bar，并使用洁净无绒擦拭纸检查是否泄漏。</li>
	<li>将未加压的管子小心引导系留管线，插入谱仪中。将管子推入谱仪直至到达样品定位位置（图1E）。</li>
	<li>常规进行1H和15N通道的锁场、匀场、匹配与调谐。 
	注意：适用于高压氧化锆管的匀场参数与标准NMR管有很大不同，建议保存优化后的匀场参数以供将来使用。</li>
	<li>设置1H-15N-HSQC或TROSY-HSQC实验，并在常压条件下（1 bar）记录参考谱图。</li>
</ol>
2. 记录高压核磁共振实验
<ol>
	<li>以500 bar为增量，逐步将压力从1 bar升高至2.5 kbar，以测试蛋白质的整体稳定性。默认将压力泵的速度设置为约18 bar/s。若蛋白质精确的折叠/去折叠速率未知，则每次增加500 bar后，让样品平衡15–20分钟。在2.5 kbar条件下记录一张谱图。</li>
	<li>以500 bar为步长，逐步将压力降低回1 bar，以检验压力扰动的可逆性。在常压条件下再记录一张谱图，并将其化学位移和峰强度与先前在相同条件下记录的参考谱图进行比较。 
	注意：若加压实验后天然状态的交叉峰强度更高，可能表明在常压下溶液中存在的微小聚集体在高压下解离并正确地重新折叠。相反，若峰强度降低或化学位移发生显著变化，则提示蛋白质在高压条件下可能发生不可逆的错误折叠。</li>
	<li>从1 bar到2.5 kbar，每隔500 bar记录一组2D实验谱图。建议在折叠/去折叠转变的拐点附近增加额外的实验点，以提高拟合精度。</li>
</ol>
3. 分析峰强度变化
<ol>
	<li>处理所有谱图，并将主链化学位移归属从1 bar的参考谱图转移到500 bar记录的谱图，然后从500 bar转移到1 kbar，依此类推。 
	注意：由于压力会引起1H和15N化学位移的非均匀漂移，切勿直接将主链归属从一个谱图复制到下一个谱图，必须手动调整。</li>
	<li>在Sparky菜单中，点击Peak &gt; Peak List (lt)。在Peak List窗口中，点击Options，并选择同时显示Frequencies (ppm)和Data Height的选项。保存每个谱图得到的列表。</li>
	<li>在曲线拟合软件中，复制交叉峰的身份标识和峰强度值，以压力值（单位为bar）作为X轴变量，强度作为Y轴变量。</li>
	<li>如果观察到完全或接近完全（>80%）的去折叠过程，则使用简单的两态模型拟合各个峰强度曲线，分别提取去折叠过程中的自由能变化和体积变化： 
	<img alt="蛋白质折叠平衡公式 \(I = \frac{I_F}{1+e^{-\frac{\Delta G_U^0 + \Delta V_U(p-p_0)}{RT}}}\)。" src="/files/ftp_upload/62701/62701eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">                                     方程 1 
	其中，“I”表示在给定压力p下某个交叉峰的观测强度，IF表示同一交叉峰在完全折叠状态下的强度。R为气体常数，T为绝对温度，ΔGU0为去折叠态与折叠态在常压p0（1 bar）下的标准吉布斯自由能差，ΔVu为去折叠过程中的体积变化。当压力p的单位为bar、温度T的单位为开尔文（K）时，R = 1.987 cal/K，ΔGU0的单位为cal/mol，ΔVU的单位为cal/mol/bar。将拟合得到的ΔVU值乘以41.84即可转换为mL/mol。对于球状蛋白，ΔVU的典型范围为-50至-150 mL/mol22。此处所有参数均针对去折叠反应表达，但可轻松转换为折叠反应参数（ΔGU0 = -ΔGF0，ΔVU = -ΔVF）。</li>
</ol>
4. 分析化学位移变化
<ol>
	<li>在软件中按顺序排列各列，使压力点作为变量，将从 Sparky 列表中提取的 1H 化学位移作为 Y 轴。</li>
	<li>将 1H 化学位移的压力依赖性拟合到一个简单的二次方程： 
	δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2                    Eq. 2 
	其中，δ(p) 表示在给定压力 p 下某个交叉峰测得的 1H 化学位移，δ0(p0) 表示在 1 bar 下记录的参考谱图中同一交叉峰的 1H 化学位移。B1 和 B2 分别表示一阶和二阶参数，单位为 ppm/bar 和 ppm/bar2。</li>
</ol>

<ol><li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probing+invisible%2C+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+An+application+to+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li>
<li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li>
<li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMG+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li>
<li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+exchange+saturation+transfer+%28CEST%29%3A+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins%27+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li>
<li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li>
<li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561(2017).</li>
<li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).</li>
<li>Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li>
<li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li>
<li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li>
<li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure%3A+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li>
<li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li>
<li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state%3A+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-contained+high-pressure+cell%2C+apparatus%2C+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).</li>
<li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoddard%2C+TD+%22Sparky+3%22">Sparky 3</a>. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).</li>
<li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li>
<li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solution+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li>
<li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li>
<li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li>
<li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics%2C+folding+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li>
</ol>

所有作者均已阅读并同意发表该论文。他们声明不存在利益冲突。

这&#160;本研究详细描述了一种用于探究蛋白质在压力扰动下结构与热力学响应的实验方案。在此对RRM2进行的高压实验表明，其体积变化ΔV存在显著差异。U 数值，表明非完全协同性解折叠，可在相对较小的单结构域蛋白中观察到。对这一现象的分析呈现出类似的结果。 1H化学位移在压力下的变化。需要注意的是，Kalbitzer 及其同事已证明，可通过分析非线性与线性系数（B）之间的比值，对化学位移变化进行更深入的分析2/B1) 与压缩率变化量和体积变化量之比（Δβ/ΔV）23这些结果凸显了高静水压能够根据局部热力学稳定性和去折叠相关的体积变化，破坏蛋白质的单个结构基序和亚结构域。因此，记录一组简单的压力滴定实验即可提供有关蛋白质折叠机制和亚结构域架构的宝贵信息。
整个压力系统（泵和控制器）相对紧凑，可安装在标准的实验推车上，便于接近波谱仪（图1）。所有脉冲序列均可在加压条件下直接使用，无需修改，包括三...

长期以来，人们认识到蛋白质及蛋白质复合物的高能、低布居构象态在许多生物通路中发挥着关键作用1,2,3。得益于基于 Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4、化学交换饱和转移（CEST）5以及暗态交换饱和转移（DEST）6等脉冲序列的实验，溶液核磁共振（NMR）波谱技术已成为表征瞬态构象态的首选方法7。结合这些实验，还可引入温度、pH 或化学变性剂等扰动手段，以提高高能构象亚态的相对布居数。类似地，也可通过施加高静水压来扰动蛋白质的平衡。根据相应构象变化所伴随的体积变化大小，增加数百至数千巴的压力可显著稳定某一高能态，甚至导致蛋白质完全去折叠8,9,10。蛋白质 NMR 谱在静水压作用下通常表现出两类变化：（i）化学位移变化和（ii）峰强度变化。化学位移变化反映了蛋白质表面-水界面的变化和/或蛋白质结构在快速时间尺度（相对于 NMR 时间尺度）上的局部压缩11。若交叉峰表现出显著的非线性化学位移压力依赖性，则可能提示存在高能构象态12,13。另一方面，峰强度的变化则指向慢时间尺度上的重大构象转变，例如折叠/去折叠态布居数的变化。通过测量特定蛋白质不同残基在去折叠过程中体积变化的显著差异，可检测到折叠中间态或高能态的存在14,15,16,17。根据我们的经验，即使是通常被归类为两态折叠的小型蛋白质，其对压力的响应也表现出非均匀性，这为了解其局部折叠稳定性提供了有用信息。本文以异质性细胞核核糖核蛋白 A1（hnRNPA1）的孤立 RNA 识别基序 2（RRM2）为模型蛋白，介绍了一种获取和分析酰胺峰强度及1H 化学位移压力依赖性的实验方案。

<table><tbody><tr><td>布鲁克核磁共振细胞 2.5 Kbar</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>NMRCELL-B</td><td></td></tr><tr><td>Sparky3</td><td>加利福尼亚大学旧金山分校，加利福尼亚州</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Xtreme-60 注射泵</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>XTREME-60</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测蛋白质低能构象态的高压核磁共振实验

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

高压是一种众所周知的扰动方法，可用于以可逆方式使球状蛋白质去稳定化并解离蛋白质复合物。静水压会驱动热力学平衡向摩尔体积较小的状态移动。因此，增加压力提供了精细调控球状蛋白质稳定性和蛋白质复合物寡聚化平衡的机会。高压核磁共振（NMR）实验结合了压力扰动对稳定性的精细调控能力以及溶液NMR波谱所提供的位点分辨能力，从而能够详细表征控制球状蛋白质稳定性、折叠机制及寡聚化机制的各种因素。本文介绍了一种通过在1 bar至2.5 kbar压力范围内记录的一系列二维1H-15N实验，来探测蛋白质局部折叠稳定性的实验方案。本方案以hnRNPA1蛋白的RRM2结构域的实验数据为例，展示了此类实验的采集与分析步骤。

本文所述方案用于研究hnRNPA1的第二个RNA识别基序RRM2（残基95-106）在压力下的变化，该结构域在2.5 kbar范围内几乎完全解折叠（>90%）。在1 bar、500 bar、750 bar、1 kbar、1.5 kbar、2 kbar和2.5 kbar下采集了1H-15N谱图（图2）。由于在2.5 kbar时，所有天然交叉峰均未超出噪声水平，因此在该压力下将所有对应残基的强度值设为0（图3A）。共对45条独立的压力-强度曲线按照公式1（Eq. 1）进行拟合，以获得与解折叠反应相关的标准吉布斯自由能变化（ΔGU0）和体积变化（ΔVU）（图3A）。计算得到的ΔVU值范围为-41至-88 mL/mol，ΔGU0值范围为1.8–3.3 kcal/mol。当将这些结果映射到结构域结...

我们详细描述了组装高压核磁共振（NMR）样品池、设置并记录高压NMR实验，以及最终分析压力下谱峰强度和化学位移变化所需的操作步骤。这些实验可为蛋白质的折叠途径及其结构稳定性提供重要的信息。

高压是一种广为人知的扰动方法，可用于可逆地使球状蛋白质失稳并解离蛋白质复合物。

高压是改变蛋白质构象样本相对分布的首选方法。该方法在分离和表征高能构象态方面极为有效。与其他扰动方法（如pH或温度）相比，压力扰动易于施加且完全可逆。它也是一种局部扰动，主要影响含有玻璃空腔或空隙体积的区域。首先，使用玻璃移液管将氮-15标记的样品引入氧化锆管中，并确保样品沉降至管底。为防止样品与传输液体混合，先在样品上方覆盖200 µL矿物油，然后将传输液体加满至管的其余部分。将一次性使用的 O 型圈放在氧化锆管顶部，然后将该管滑入底座中。接着将管子连接到高压拖曳管线上，并用手将底座拧紧至反应池上。随后施加 14.7 牛·米的扭矩，以防止在较低压力下发生泄漏。为检查压力池组件的完整性，使用池体支撑架和 containment vessel 在光谱仪外部将样品管加压至 300 bar。保持 15 分钟后，将压力重置为 1 bar，并使用洁净无绒的擦拭纸检查是否存在泄漏。通过小心引导系留线，将未加压的样品管插入光谱仪中。将试管推入光谱仪，直至到达样品放置位置。锁定、匀场、匹配并调节氢和氮通道，并保存优化后的匀场参数以供后续使用。设置横向弛豫优化的异核单量子相干谱实验，并在常压条件下进行参考实验的采集。从1 bar到2.5 kbar，每隔500 bar记录一组二维实验。如果已知精确的折叠或去折叠速率，则每次增加500 bar后，让样品平衡15至20分钟。当折叠或去折叠转变的拐点到达时，记录额外的实验以提高拟合的精确度。本实验方案用于研究RRM2（异质性细胞核核糖核蛋白A1的第二个RNA识别基序）对压力的依赖性。在1 bar、1.5 kilobar、2 kilobar和2.5 kilobar条件下，采集了经横向弛豫优化的异核单量子相干谱（TROSY-HSQC）谱图。在2.5 kilobar压力下，RRM2几乎完全解折叠。根据此处所示方程，对各个压力下的信号强度曲线进行拟合，以获得解折叠反应对应的标准吉布斯自由能变化及体积变化。当映射到结构域结构上时，体积变化幅度最大的残基位于结构域的结构核心内部，而体积变化幅度最小的残基则主要分布在β链之间的连接环以及β链与C端螺旋之间的连接区域。为了探究折叠态集合体的可压缩性程度和构象异质性，分析了质子化氢的化学位移。通过所示方程拟合了质子化氢化学位移随压力变化的各个曲线，以提取位点特异性的线性和非线性系数。具有最大非线性系数的残基主要位于结构域的结构核心区域，而具有最小非线性系数的残基则大多位于连接不同结构模体的环状区域中。正确设置试管的压力至关重要，以防止发生泄漏。如果发生泄漏，可能需要移除探头以清除任何矿物油残留。

high-pressure-nmr-experiments-for-detecting-protein-low-lying

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

检测蛋白质低洼构象状态的高压NMR实验

本视频介绍了利用核磁共振波谱技术研究15N标记的野生型和突变型envoplakin蛋白与未标记的vimentin蛋白之间相互作用的方法。野生型envoplakin与vimentin成功相互作用会导致核磁共振谱图中谱线显著展宽和信号峰消失；而突变型envoplakin与vimentin之间缺乏相互作用，则在核磁共振谱图中呈现分辨良好的信号峰。...

利用核磁共振研究原子水平的蛋白质-蛋白质相互作用

核磁共振是最重要的光谱学工具之一。本文介绍了一种在高压条件下（目前最高可达10.1...

千兆帕斯卡高压下的高灵敏度核磁共振：一种在极端条件下研究凝聚态物质电子与化学性质的新工具

原子分辨率下的超分子蛋白质组装体结构因其在多种生物现象中发挥的关键作用而具有重要意义。本文介绍了一种利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术（MAS...

利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究

本文详细描述了在实验室中通过溶液核磁共振波谱法获取和分析15N弛豫色散谱的实验方案。...

15N CPMG 驰豫弥散用于研究蛋白质构象动力学的 µs-ms 时间尺度

本文介绍了一种应用顺磁弛豫增强核磁共振波谱法检测内在无序蛋白中弱且瞬时的分子间和分子内相互作用的实验方案。...

利用顺磁弛豫增强技术检测和表征内在无序蛋白的自关联行为

本文介绍了一种实验方案，详细阐述了用于表征溶液中蛋白质-聚糖相互作用的一系列核磁共振（NMR）实验的样品制备、数据采集、处理与分析方法。文中概述了目前常用的基于配体和基于蛋白质的研究方法，这些方法无疑将推动结构糖生物学和分子识别研究领域的发展。...

解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

核磁共振（NMR）波谱法能够以残基特异性的方式表征蛋白质的结构动力学。本文提供了一套实用的实验方案，用于采集对皮秒到纳秒时间尺度敏感的NMR 15N R1 和 R2...

NMR 15N 弛豫实验用于研究蛋白质的皮秒至纳秒级结构动力学

本基于核磁共振（NMR）的实验方案利用氰病毒素-N（cyanovirin-N）与D-甘露糖研究弱蛋白-聚糖相互作用。通过结合配体检测与蛋白检测方法，该方案可定位结合位点、检测变构效应并鉴定碰撞复合物。该方法概述了样品制备与数据分析流程，为聚糖特异性诊断及识别机制提供重要的结构与动态信息。...

探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振技术的进展

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

本方案演示了如何利用去垢剂反差匹配的小角中子散射技术，获得溶液中去垢剂增溶的膜蛋白的低分辨率ab...

小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

学习高压核磁共振实验技术，用于分析蛋白质构象变化与折叠路径。该方法通过检测峰强度和化学位移变化，揭示蛋白质高能构象状态的结构稳定性与动态特性。

用于检测蛋白质低能构象态的高压核磁共振实验

探索更多视频