用于检测蛋白质低能构象态的高压核磁共振实验

高压是改变蛋白质构象样本相对分布的首选方法。该方法在分离和表征高能构象态方面极为有效。与其他扰动方法（如pH或温度）相比，压力扰动易于施加且完全可逆。

它也是一种局部扰动，主要影响含有玻璃空腔或空隙体积的区域。首先，使用玻璃移液管将氮-15标记的样品引入氧化锆管中，并确保样品沉降至管底。为防止样品与传输液体混合，先在样品上方覆盖200 µL矿物油，然后将传输液体加满至管的其余部分。

将一次性使用的 O 型圈放在氧化锆管顶部，然后将该管滑入底座中。接着将管子连接到高压拖曳管线上，并用手将底座拧紧至反应池上。随后施加 14.7 牛·米的扭矩，以防止在较低压力下发生泄漏。

为检查压力池组件的完整性，使用池体支撑架和 containment vessel 在光谱仪外部将样品管加压至 300 bar。保持 15 分钟后，将压力重置为 1 bar，并使用洁净无绒的擦拭纸检查是否存在泄漏。通过小心引导系留线，将未加压的样品管插入光谱仪中。

将试管推入光谱仪，直至到达样品放置位置。锁定、匀场、匹配并调节氢和氮通道，并保存优化后的匀场参数以供后续使用。设置横向弛豫优化的异核单量子相干谱实验，并在常压条件下进行参考实验的采集。

从1 bar到2.5 kbar，每隔500 bar记录一组二维实验。如果已知精确的折叠或去折叠速率，则每次增加500 bar后，让样品平衡15至20分钟。当折叠或去折叠转变的拐点到达时，记录额外的实验以提高拟合的精确度。

本实验方案用于研究RRM2（异质性细胞核核糖核蛋白A1的第二个RNA识别基序）对压力的依赖性。在1 bar、1.5 kilobar、2 kilobar和2.5 kilobar条件下，采集了经横向弛豫优化的异核单量子相干谱（TROSY-HSQC）谱图。在2.5 kilobar压力下，RRM2几乎完全解折叠。根据此处所示方程，对各个压力下的信号强度曲线进行拟合，以获得解折叠反应对应的标准吉布斯自由能变化及体积变化。

当映射到结构域结构上时，体积变化幅度最大的残基位于结构域的结构核心内部，而体积变化幅度最小的残基则主要分布在β链之间的连接环以及β链与C端螺旋之间的连接区域。为了探究折叠态集合体的可压缩性程度和构象异质性，分析了质子化氢的化学位移。通过所示方程拟合了质子化氢化学位移随压力变化的各个曲线，以提取位点特异性的线性和非线性系数。

具有最大非线性系数的残基主要位于结构域的结构核心区域，而具有最小非线性系数的残基则大多位于连接不同结构模体的环状区域中。正确设置试管的压力至关重要，以防止发生泄漏。如果发生泄漏，可能需要移除探头以清除任何矿物油残留。