用于超微结构分析和抗体染色的涡虫卵巢解剖
2021年9月10日
该协议介绍了解剖淡水涡虫 Schmidtea mediterranea 卵巢的步骤。解剖的卵巢与抗体免疫染色和超微结构分析与透射电子显微镜兼容，以研究卵母细胞和体细胞的细胞生物学，提供以前无法获得的成像深度和质量。
该方法的目标是解剖涡虫 Schmidtea mediterranea 的卵巢，用于用 TEM 或抗体染色对卵母细胞生物学进行细胞和亚细胞分析。该协议使用简短的固定步骤来促进涡虫卵巢的定位和解剖，这将提供以前无法获得的成像深度和质量。对于以前从未使用过这种技术的人来说，最大的困难是在固定后定位卵巢。
在实验之前熟悉有性涡虫的解剖结构会有所帮助。通过每周两次用有机肝膏喂养性涡虫以达到性成熟来准备实验。在培养皿中，用 5%N-乙酰-L-半胱氨酸或 NAC 处理性成熟蠕虫，在室温下放置 5 分钟。
用 10 毫升新鲜制备的 4% 多聚甲醛代替 NAC，并在室温下将蠕虫固定 1 小时，偶尔摇晃。在添加 4% 多聚甲醛后 10 分钟开始解剖，因为蠕虫正在被固定。观察上皮色素沉着以定位腹侧神经索，腹侧神经索显示为两条色素沉着较浅的线，从头前神经节向尾部延伸。
通过观察色素沉着来定位推定的卵巢并验证它们的位置。使用两把手术刀，在卵巢的后部和后部进行切割，以完全去除前部和后部蠕虫碎片。用一把刀固定蠕虫，用另一把刀进行解剖。
清洁用于切割的刀。要分离两个卵巢，切开卵巢碎片的中线，然后将碎片腹侧向下翻转。使用两对 5-SA 型尖镊子剥下背组织，露出肠道。
用镊子的尖端或软刷轻轻去除位于腹侧组织上方的肠道分支，以露出卵巢。去除周围组织以取出卵巢。取出卵巢，将其转移到 1.5 毫升试管中，用 1 毫升 PBS 洗涤。
背侧和腹侧色素沉着模式用于定位卵巢的位置。逐步修剪掉多余的组织。一旦卵巢暴露出来，周围的组织就会被修剪掉。
含有多种体细胞类型的卵巢用于超微结构分析和免疫荧光染色。解剖的卵巢允许对卵母细胞的细胞和亚细胞解剖结构进行高质量成像。该程序应允许进行 RNA 干扰实验以检查卵母细胞生物学的分子调控。
这项技术导致在扁虫卵母细胞中发现了一种新现象，即核膜分解成包裹核蛋白的囊泡，而不是保持完整，即封闭性有丝分裂，或分裂成碎片，又名开放性有丝分裂。
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Overview
This protocol details the dissection of ovaries in the freshwater planarian Schmidtea mediterranea, aimed at enabling cellular and subcellular analysis of oocyte biology. The method enhances imaging quality and depth through techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining.
Key Study Components
Research Area
- Cell biology
- Oocyte analysis
- Planarian biology
Background
- The anatomy of sexual planarians is crucial for effective dissection.
- Feeding planarians with organic liver paste promotes sexual maturity.
- Ovaries are located based on epithelial pigmentation patterns.
Methods Used
- Surgical dissection methods
- Freshwater planarian Schmidtea mediterranea
- Transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining
Main Results
- Efficient localization and dissection of ovaries from sexual planarians.
- High-quality imaging of cellular structures and somatic cell types.
- Method supports RNA interference experiments to study molecular regulations.
Conclusions
- This study provides a novel technique for reproductive cell analysis in planarians.
- It advances understanding of oocyte biology and supports future genetic studies.
