转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

脑血管系统是由穿支动脉、毛细血管和上行静脉组成的复杂网络。这些血管被壁细胞包裹，例如表达α-平滑肌肌动蛋白的包绕型周细胞，这类周细胞位于穿支动脉前四级分支之内。我们使用Acta2-RCaMP 1.07转基因小鼠，通过基因编码的钙离子指示剂RCaMP的表达，来可视化这些细胞中的钙瞬变。

钙在这些细胞的收缩和血流控制中起着重要作用。毛细血管周细胞位于血管网络更远的下游，可在其他转基因模型中标记。然而，本方法主要关注包绕型周细胞。

我们的小鼠已通过手术植入慢性颅窗，以便对脑血管系统进行成像观察。本文概述了必要的准备工作、尾静脉注射操作，以及在麻醉动物中获取周细胞钙信号数据和血流信息所需的双光子成像与分析方法。进行尾静脉插管注射需要以下物品：胰岛素注射器、一段15厘米长的PE10导管、30号针头、纱布、生理盐水、镊子、绿色荧光素葡聚糖染料、钳子和剪刀。

我们还准备了一支含有氯胺酮-赛拉嗪麻醉剂的针头，将在成像前注射，因为对于血流测量而言，其效果优于异氟烷。使用镊子，从针座处折下一支30号针头。小心地将该针头插入连接至充满生理盐水注射器的PE10导管末端。

这是用于注射的导管。使用异氟烷麻醉小鼠，并涂抹I-Lube凝胶。将手套剪开后装入温水，套在小鼠尾部以扩张侧尾静脉。

用乙醇清洁尾部后，将针头插入静脉，通过导管轻轻注入生理盐水，以确认针头位置正确。将导管上的注射器更换为装有荧光素葡聚糖染料的注射器。缓慢注射染料，确保无气泡进入导管。

将右旋糖酐注射器更换为生理盐水注射器，并冲洗管路直至管中无染料残留。拔出针头，用纱布按压。注射氯胺酮-赛拉嗪麻醉剂以进行成像。

将小鼠头部固定在加热垫上，使用牙科涂抹棒清洁颅窗。在颅窗上涂抹超声耦合剂，并通过双光子显微镜物镜进行聚焦。进行双光子成像时，我们采用配备可调谐钛宝石激光器用于荧光激发、以及光电倍增管用于发射光检测的显微镜系统。

在显微镜软件中，将波长设置为 990 纳米，以同时激发 RCaMP 和荧光素标记的葡聚糖。接下来，通过调节普克尔盒电压和 PMT 检测器灵敏度来设定激光功率。使用这些参数进行高分辨率实时扫描，可观察到表达 RCaMP 的血管壁细胞以及荧光标记的血液血浆。

建议获取深度堆栈图像，以准确定位血管网络中的周细胞。当聚焦于靠近PO血管的组织表面时，将此位置设为零点并作为Z轴序列堆栈的顶部，然后将焦距向下移动至组织中所需深度，并将此位置设为堆栈的底部。随着显微镜在堆栈中逐层深入，必须相应增加激光功率。

在图像处理软件中打开Zed系列，将两个通道合并为彩色图像，并浏览图像序列以定位周细胞和感兴趣的血管。选择包含周细胞的感兴趣区域，并保存其位置信息，以便在后续成像过程中重新定位这些区域。为采集和追踪周细胞钙信号事件，需将采集帧率提高至每秒10帧以上。

将成像时间设置为60秒，并使用唯一的文件名更新保存路径。对血管进行光学放大，以补偿较低的分辨率并更清晰地观察周细胞。采集T系列图像。

为了测量血管直径和红细胞流速，选择线扫描模式以启动显微镜的一维扫描。首先设置扫描持续时间（单位为毫秒）。然后绘制一条横穿目标血管并沿血管走向平行移动的直线。

这将在左侧生成血管直径的延时图像，在右侧生成红细胞流经血管的轨迹图。有关本方案中使用的所有程序和软件包的完整列表，请参见材料表。首先在图像处理软件中手动选择感兴趣区域。

加载T系列文件，对图像序列进行平均处理，并生成彩色图像。选择多边形工具，勾勒出可见的包被型周细胞结构，如胞体和突起。为每个感兴趣区域命名唯一标识符，并将其保存为一个压缩文件夹，以便后续在编程软件中加载使用。

打开编程软件，确保图像处理程序包的文件夹已包含在路径中。将钙成像时间序列导入编程软件，并定义每个通道的内容。本例中，通道一为细胞信号，通道二为血浆。

在编程软件中将数据绘制成动态图像，以方便可视化。为去除荧光素偶联葡聚糖在红色RCaMP通道中产生的绿色荧光串扰，请在图像处理软件中对通道进行解混。首先选择一个仅包含第一种荧光染料（本例中为RCaMP）的区域。

接着选择一个仅包含第二种荧光染料（即血浆中的荧光素）的区域。最后选择一个不含任何一种荧光染料的背景区域。这将生成一个光谱贡献矩阵，并将其应用于每个通道中的每个像素。

它显著改善了RCaMP信号的定位，从而增强对这些结构中钙事件的检测。钙成像数据可通过多种方法在图像处理软件包中进行分析。首先，在未混合的钙成像视频上运行细胞信号分析，并从之前手动选取周细胞的zip文件夹中加载感兴趣区域。

将缩放因子设为1，因为各区域无需调整大小。处理完成后，以不同颜色生成每个ROY区域及归一化钙信号轨迹的图表。如果代码未能检测到单个轨迹中的大部分钙信号事件，可修改优化框中的内置参数，例如将短通滤波数据的阈值降低至基线期（即T系列的前30帧）标准差的三倍。

为了检测和分类信号，需对归一化的钙信号轨迹进行高通滤波和带通滤波，这有助于平滑数据以进行幅度估算，同时判断信号是单峰、多峰还是平台状。将数据输出为 CSV 文件，以便进一步进行统计分析。在未混合的钙成像视频上再次运行细胞信号分析，并选择基于三维（X、Y 和时间）活动性及荧光变化的自动感兴趣区域识别。

绘制过程结果，以不同颜色显示已识别的兴趣区域。如果算法未能检测到在视频中肉眼明显可见的活性氧区域（ROYs），请调整内置参数，例如增大高斯滤波器以增强时间上的数据平滑效果，并将检测ROYs的阈值降低至基线标准差的三倍。将ROYs以视频形式绘制出来，以便进一步可视化。

将数据输出为 CSV 文件以进行进一步的统计分析。将线扫描显影图数据文件导入编程软件，并定义每个通道对应的内容。对线扫描数据运行直径分析功能，该功能将打开一个对话框，用于选择显影图中对应于直径的区域。

在kymograph荧光信号边界外绘制一个与血管直径相对应的矩形框。对该数据类别进行处理，以测量血管直径的半高全宽，并生成图表。接着运行变换分析中的速度计算，在kymograph荧光信号边界内绘制一个矩形框。

处理此类数据以计算红细胞的速度、流量和线密度。将血流结果输出为 CSV 文件，以便进一步分析。通过手动选择细胞结构，可检测这些区域内的钙离子波动，包括在对归一化的钙信号轨迹进行低通和带通滤波后出现的不同类型的信号峰，如单峰和多峰。

此外，通过图像处理算法将随时间变化的荧光强度的活跃像素进行聚类，从而确定感兴趣区域。通过调整时间、阈值和空间参数以涵盖预期的信号大小和形状，该方法可应用于任何动态细胞信号。降低信号识别的阈值可检测到更多的感兴趣区域。

通过分析包被型周细胞附近血管的清晰血流动力学显像图，测量血管直径和红细胞流速。血管直径根据荧光信号半高全宽计算得出。红细胞流速则通过无标记红细胞形成的条纹进行估算，将条纹角度输入Radon变换以计算流速。

质量较差的显微图像（kymograph），如存在荧光饱和、信噪比低或成像视野移动等情况，会导致不可靠的绘图结果，并出现以红色叉号标记的误差点，这些位置的数据无法确定。所获取数据的质量对获得良好结果至关重要，遵循本实验方案中所述步骤可确保获得理想结果。在本视频中，我们概述了利用双光子显微镜联合进行脑包被性周细胞钙成像与血流测量的操作流程。

这些技术可用于研究脑血管网络中壁细胞的生理学特性及其定位问题，也可根据需要进行调整，用于研究脑内或其他器官系统中任何细胞类型的钙瞬变。