用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

该腺相关病毒（AAV）载体生产方案成本效益高，可获得高纯度、高滴度的研究级AAV，适用于临床前大型动物模型研究。本技术采用贴壁培养的HEK293细胞，在细胞培养腔室中进行，操作省时且干预较少，从而减少对细胞的干扰。该方案可显著促进基因治疗领域中的病毒载体生产，也可用于其他能够结合肝素硫酸盐的AAV血清型的制备。

首先，当培养的 HEK293 细胞达到 80% 汇合度时进行收集。吸除培养基后，用三毫升 PBS 轻轻洗涤细胞培养板。然后吸除 PBS，并加入三毫升胰蛋白酶。

将培养板在37摄氏度下孵育两分钟。孵育结束后，加入7毫升完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶，并将上清液收集至50毫升锥形管中。轻轻倒置试管，确保细胞均匀分布。

为确定细胞密度，将10微升细胞样品与10微升台盼蓝混合，将混合液加入细胞计数板中，在细胞计数仪中进行分析。将细胞悬液与一升预热的完全DMEM培养基混合以观察培养腔室。

轻轻旋转培养 chamber 以均匀分布细胞。将 chamber 置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育。除细胞培养 chamber 外，还需在 15 厘米培养皿中以每平方厘米 10 的 4 次方个细胞的密度培养细胞，作为汇合度的参考。

孵育65小时后，当细胞融合度达到80%至90%时，缓慢将聚乙烯亚胺-DNA与DMEM的混合物加入细胞培养室的加样口。在37°C、5% CO₂条件下继续孵育72小时之前，需将液体均匀分布至所有行。孵育结束后，剧烈振摇细胞培养室以使细胞脱落，直至培养基呈现浑浊状态，然后将其倒入四个或五个500毫升离心管中。

在4摄氏度下，以18,000 × g离心30分钟，使细胞沉淀。将澄清的上清液倒入一个1升的PETG瓶中，并在500毫升离心管中用50毫升授权缓冲液重悬细胞沉淀。将离心管在37摄氏度下孵育60分钟。

孵育后，将离心管在18,000 × g条件下离心30分钟，并将上清液转移至同一个一升的PETG瓶中。于-80 °C保存。在4 °C条件下过夜解冻粗裂解液。

解冻后，使用0.22微米滤器过滤。在纯化步骤开始前，立即向每根正在使用的肝素-Sepharose柱加入4毫升滤器预处理缓冲液，以钝化离心浓缩器。将管路放入蠕动泵中。

依次运行溶液和培养基。将五毫升肝素-Sepharose柱连接到管路上，通过柱子泵入25毫升Bazell DMEM，以进行层析准备。然后以每秒一至两滴的流速，将0.2微摩尔的过滤后粗裂解液上样至柱中。

依次用含镁和钙的 HBSS 缓冲液配制的 300 毫摩尔氯化钠溶液各 5 毫升洗涤层析柱五次，并将五次洗脱液分别标记为 E1 至 E5。准备就绪后，将含有预处理缓冲液的离心浓缩管在 900 × g 条件下离心 2 分钟，弃去滤过液。再用 4 毫升含镁和钙的 HBSS 缓冲液洗涤离心浓缩管滤膜，在 1000 × g 条件下离心 2 分钟。

然后将洗脱液 E2 加入离心浓缩管中，在 1000 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去滤过液。同样将洗脱液 E3 加入离心浓缩管中离心，直至浓缩后的病毒体积约为 1 毫升。

使用P200滤芯吸头从离心浓缩装置中移除浓缩后的病毒，并将其收集到无菌的1.5毫升离心管中。收集病毒后，用200微升含镁和钙的HBSS冲洗离心浓缩装置。剧烈吹打30秒，以充分洗脱黏附在膜上的任何病毒，并将洗脱液收集至同一支1.5毫升离心管中。

充分混匀试管。在4°C保存前，用20%乙醇洗涤并饱和化层析柱。将泵管保存在1 mol/L氢氧化钠溶液中。

通过肌肉注射后28天，比较了AAV6.2FF衣壳在小鼠、仓鼠和羔羊中的转导效率。给予小鼠每公斤体重5×10¹²个病毒基因组的AAV6.2FF人源IgG，其血清中人IgG表达水平在171至237微克/毫升之间。给予仓鼠每公斤体重2×10¹³个病毒基因组的AAV6.2FF人源IgG，其人IgG表达水平显著高于小鼠。

尽管大型动物模型能够在血浆中表达平均35 µg/mL的人源IgG水平。大型动物模型可用于确定AAV转基因在体内的表达情况，并评估这些转基因是否对目标疾病或障碍具有治疗效果。该研究展示了AAV6.2FF在骨骼肌中强大的转导能力，这是一种新型的AAV6血清型载体，同时也表明AAV病毒载体在体内具有较低的免疫原性。