Name: 在细胞堆中生产腺相关病毒载体，用于大型动物模型的临床前研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 了解利用贴壁HEK293细胞培养室高效生产高滴度、高纯度AAV病毒载体的方法。该技术适用于大型动物模型的临床前基因治疗研究，可获得超过1×10¹³载体基因组/毫升的稳定产量。

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Amira D. Rghei、Brenna A. Y. Stevens、Sylvia P. Thomas 和 Jacob G. E. Yates 获得了安大略兽医学院学生津贴以及安大略省研究生奖学金。Amira D. Rghei 获得了 Mitacs Accelerate 学生奖学金。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（#66009）以及由自然 sciences 和工程研究委员会（NSERC）合作的协同健康研究项目资助（#433339）支持，资助对象为 SKW。

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
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<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020).</li>
<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020).</li>
<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
<li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus%3A+chemical+and+physical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li>
<li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li>
<li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy%3A+challenges+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li>
<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
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<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
<li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>dsDNA copy number calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html</a> (2021).</li>
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<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
<li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+4+%28AAV4%29+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton 是一项美国专利 US10806802B2 中 AAV6.2FF 衣壳的发明人。

本文所述的重组腺相关病毒（rAAV）载体的制备方法，使用了大多数分子生物学研究实验室和实验设施中常见的材料、试剂和设备。本方法可使读者自行制备出高质量的体外（in vitro）和体内（in vivo）应用级别的rAAV。尤其与涉及氯化铯纯化的繁琐方法相比，该rAAV制备方案效率更高，且无需使用超速离心。在转染HEK293细胞后，仅需5个工作日即可获得纯化的AAV，可供直接使用。
在重组腺相关病毒（rAAV）的生产与纯化过程中，许多步骤都会影响载体的纯度和最终滴度。第一步也是最关键的一步是HEK293细胞的健康状态，这直接影响载体的滴度。相较于其他细胞类型或系统（如HEK293T细胞），使用HEK293细胞具有优势，因为HEK293细胞对培养板塑料涂层的黏附能力更强，能够形成稳定的细胞网络，有利于持续的细胞生长。建议定期检测细胞是否存在支原体污染，并避免将HEK293细胞传代超过约40代，或在细胞倍增时间明显延长时继续传代，否则会导致AAV产量降低。此外，转染前应确认细胞融合度约为80%，以确保细胞既不过于稀疏也不过度生长。关于转染组分，强烈推荐使...

利用腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗在过去三十年中取得了巨大进展1,2。在多种遗传性疾病中已显示出疗效改善，包括先天性失明、血友病以及肌肉骨骼系统和中枢神经系统疾病，这使AAV基因治疗成为临床研究的前沿领域3,4。2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准了Glybera，这是一种表达脂蛋白脂肪酶（LPL）的AAV1载体，用于治疗LPL缺乏症，使其成为欧洲或美国首个获得上市许可的基因治疗产品5。此后，又有两种AAV基因疗法——Luxturna6和Zolgensma7——获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，预计未来5年内该市场将迅速扩展，到2025年可能有10至20种基因疗法获批上市8。现有的临床数据表明，AAV基因治疗是一种安全、耐受性良好且有效的治疗方式，使其成为最有前景的病毒载体之一；目前在ClinicalTrials.gov注册的涉及AAV的临床试验已超过244项。随着对AAV载体临床应用的兴趣日益增加，迫切需要建立稳健且可放大的生产方法，以推动AAV疗法在大型动物模型中的评估，这是转化研究流程中的关键步骤9。
对于AAV载体的生产，两个主要要素是AAV基因组和衣壳。野生型（wt）-AAV的基因组为单链DNA，长度约为4.7 kb10。wt-AAV基因组两端含有反向末端重复序列（ITRs），对包装过程至关重要，中间包含rep和cap基因11。在AAV载体生产中，rep和cap基因（对基因组复制、病毒衣壳组装以及基因组包封进病毒衣壳必不可少）会从病毒基因组中被移除，并以反式提供12。将这些基因从病毒基因组中删除，可为治疗性转基因及其所有必要的调控元件（包括启动子和polyA信号）腾出空间。ITRs保留在载体基因组中，以确保基因组的正确复制和病毒包封13,14。为了提高转基因表达的动力学特性，可将AAV载体基因组设计为自互补型，从而避免AAV基因组复制过程中单链DNA向双链DNA的转换，但其编码容量会降低至约2.4 kb15。
除了 AAV 基因组设计之外，衣壳血清型的选择决定了 AAV 载体在体内的组织和细胞嗜性in vivo2。除了组织嗜性外，不同的 AAV 血清型还表现出不同的基因表达动力学16。例如，Zincarelli 等人17&#160;将不同的 AAV 血清型分类为低表达血清型（AAV2、3、4、5）、中等表达血清型（AAV1、6、8）和高表达血清型（AAV7 和 9）。他们还将 AAV 血清型分为慢起效表达型（AAV2、3、4、5）和快起效表达型（AAV1、6、7、8 和 9）。这些不同的嗜性及基因表达动力学差异源于衣壳蛋白中的氨基酸变异、衣壳蛋白的构象以及与宿主细胞受体/共受体的相互作用18。某些 AAV 衣壳还具有额外的有利特性，例如在血管内给药后能够穿越血脑屏障（AAV9），或在长寿命的肌肉细胞中持续存在以实现持久的外源基因表达（AAV6、6.2FF、8 和 9）19,20。
本文旨在详细介绍一种经济高效的方法，用于生产高纯度、高滴度、适用于临床前大型动物模型研究的重组腺相关病毒（AAV）载体。该方法通过将双质粒转染至生长于细胞叠层中的贴壁人胚肾（HEK）293细胞来实现AAV的生产。此外，本研究还描述了一种肝素硫酸亲和层析纯化方案，适用于含有肝素结合结构域的AAV血清型，包括AAV2、3、6、6.2FF、13和DJ21,22。
目前有多种包装系统可用于生产腺相关病毒（AAV）载体。其中，双质粒共转染系统具有一定的实际优势，该系统将Rep和Cap基因以及腺病毒辅助基因（E1A、E1B55K、E2A、E4orf6和VA RNA）整合于同一个质粒（pHelper）中，相较于常用的三质粒（三重）转染方法，可降低质粒生产的成本23,24。携带目的基因表达盒的AAV基因组质粒（pTransgene）必须由ITR序列作为侧翼，且其长度不得超过约4.7 kb。由于转染过程中可能存在的细胞毒性效应，目的基因本身可能影响载体的滴度和纯度。本文描述了载体纯度的评估方法。采用该方法生产的载体滴度可达每毫升1 × 1013 vg，已在小鼠、仓鼠和绵羊动物模型中进行了评估。
表1：所需溶液的组成。本方案中各种溶液所需组分的必要信息，包括百分比和体积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table 1- 62727_R2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-丁醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A399-4</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>10层小室细胞培养堆</td><td>康宁</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>1升PETG瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96孔带裙边板</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>粘性板封膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0700</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>血液与组织清洁试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>用于方案第4.6节中的DNA纯化</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>15 cm 培养皿</td></tr><tr><td>培养锥形管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339650</td><td>15 mL 一次性离心管</td></tr><tr><td>培养锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>50 mL 离心管</td></tr><tr><td>含1000 mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Cytiva生命科学</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL 蛋白质印迹底物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>将乙醇（95% vol）稀释至20%用于第3.7.4节，稀释至70%用于第6.1.1.1节</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>含镁的HBSS&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>不含镁的HBSS&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293细胞</td><td>美国组织培养收藏中心</td><td>CRL-1573</td><td>收到细胞后，按制造商所述方法进行解冻和培养&amp;rsquo;s方案。当细胞经过最少传代且生长状态良好时，将其分装冻存于液氮中以备后续使用。始终使用传代次数低于30的细胞。一旦培养细胞的传代次数超过30次，建议从冻存的细胞分装管中重新开始培养。</td></tr><tr><td>HEK293 宿主细胞蛋白 ELISA 试剂盒</td><td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td>遵循制造商说明&amp;rsquo;s 指令</td></tr><tr><td>肝素硫酸柱</td><td>Cytiva生命科学</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>大容量离心管支撑垫</td><td>康宁</td><td>CLS431124</td><td>使用大容量离心管时必须使用支撑垫，除非离心机转子已配备合适的V型底垫</td></tr><tr><td>大容量离心管</td><td>康宁</td><td>CLS431123-6EA</td><td>500 mL 离心管</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL 微量离心管，使用前灭菌</td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Cytiva生命科学</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-月桂酰基肌氨酸钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>注意：佩戴手套</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM，低血清培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>PBS（10倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>70011044</td><td>稀释至1倍浓度后用于细胞</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Cytiva生命科学</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>pHelper 质粒</td><td>从头设计或从质粒文库获取</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>移液盆</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-681-502</td><td>购买无菌移液管盆</td></tr><tr><td>聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>9002-93-1</td><td>注意：佩戴手套</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>遵循制造商说明&amp;rsquo;s 说明，配制 1 L 溶液。0.22&amp;mu;m 滤膜过滤并于 4 ℃ 保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>聚丙烯半裙边PCR板</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯 20（Tween 20）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP337-100</td><td>注意：佩戴手套</td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>Cytiva生命科学</td><td>10600023</td><td>使用镊子操作。佩戴手套。</td></tr><tr><td>一抗</td><td>祖细胞</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>蛋白阶梯</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>pTrangene 质粒</td><td>从头设计或从质粒文库获取</td><td>NA</td><td>基因组中必须含有 SV40 polyA，才能与第 5.0 节中的 AAV 滴定相兼容</td></tr><tr><td>泵管</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>优化E1-E5各组分中病毒的管路长度及收集</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase 10 反应缓冲液</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>在4.0节方案中以10倍浓度使用</td></tr><tr><td>RQ1 无RNase的DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>样品稀释液</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>需单独购买，用于HEK293宿主细胞蛋白ELISA试剂盒</td></tr><tr><td>二抗，HRP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Oxoid</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28312</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 polyA 引物探针</td><td>IDT</td><td></td><td>使用表 X 中的序列，向 IDT 下单进行合成</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15524010</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>超滤器</td><td>默克生命科学</td><td>UFC810024</td><td>必须使用 Ultra-4 离心 10K 装置，因其具有 10000 分子量截断值</td></tr><tr><td>用于细胞裂解的通用核酸酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>通用型qPCR预混液</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>注意：在层流罩下操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>警告：&amp;nbsp;请参阅材料表，了解危险化学品使用的相关指南。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

腺相关病毒（AAV）载体是目前临床进展最快的基因治疗载体之一，已有三种AAV基因疗法获批用于人类。AAV新型应用的临床推进涉及从小型动物模型（如小鼠）向大型动物模型（包括犬、绵羊和非人灵长类动物）的过渡。向大型动物施用AAV的一个限制因素是需要大量高滴度的病毒。虽然悬浮细胞培养是一种可放大的AAV载体生产方法，但很少有研究实验室具备相应的设备（例如生物反应器）或掌握此类AAV生产技术。此外，与贴壁培养的HEK293细胞相比，悬浮培养的HEK293细胞产生的AAV滴度通常显著较低。本文介绍了一种利用细胞叠层培养法大量生产高滴度AAV的方法。同时提供了详细的AAV滴度测定方案以及验证载体纯度的方法。最后展示了在绵羊模型中AAV介导的外源基因表达的代表性结果。这一优化的贴壁细胞大规模AAV载体生产方案将有助于分子生物学实验室推进其新型AAV疗法在大型动物模型中的测试。

从小型啮齿类动物模型向大型动物模型转化并最终应用于临床，由于需要大量腺相关病毒（AAV）才能转导更大的动物并实现治疗效果，因此面临重大挑战。为了比较理性设计的AAV6.2FF衣壳的转导效率（此前已证明其在小鼠肌肉细胞中的转导效率比AAV6高出101倍）3，本研究在小鼠、仓鼠和羔羊中均给予了表达人源单克隆抗体（hIgG）的AAV6.2FF。表达AAV6.2FF-hIgG的载体包含CASI启动子4、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）以及SV40 polyA序列。6周龄雌性BALB/c小鼠（n = 4）在40 µL体积中经肌肉注射（IM）给予1 x 1011 vg的AAV6.2FF-hIgG，并在注射AAV后的第0、7、14、21和28天采集血液以监测hIgG水平。4周龄叙利亚仓鼠（2只雌性，2只雄性）在40 µL体积中经肌肉注射给予1 x 1012 vg的AAV6.2FF-hIgG，并每周采血监测hIgG表达。最后，10日龄雄性多塞特羔羊（n = 3）按每公斤体重1 x 1013</su...

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &#62;1 × 1013 拷贝/mL 的病毒基因组，所获载体数量足以满足大型动物实验的需求。

腺相关病毒（AAV）载体是目前临床进展最快的基因治疗载体之一，已有三种AAV基因疗法获批用于人类。

该腺相关病毒（AAV）载体生产方案成本效益高，可获得高纯度、高滴度的研究级AAV，适用于临床前大型动物模型研究。本技术采用贴壁培养的HEK293细胞，在细胞培养腔室中进行，操作省时且干预较少，从而减少对细胞的干扰。该方案可显著促进基因治疗领域中的病毒载体生产，也可用于其他能够结合肝素硫酸盐的AAV血清型的制备。首先，当培养的 HEK293 细胞达到 80% 汇合度时进行收集。吸除培养基后，用三毫升 PBS 轻轻洗涤细胞培养板。然后吸除 PBS，并加入三毫升胰蛋白酶。将培养板在37摄氏度下孵育两分钟。孵育结束后，加入7毫升完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶，并将上清液收集至50毫升锥形管中。轻轻倒置试管，确保细胞均匀分布。为确定细胞密度，将10微升细胞样品与10微升台盼蓝混合，将混合液加入细胞计数板中，在细胞计数仪中进行分析。将细胞悬液与一升预热的完全DMEM培养基混合以观察培养腔室。轻轻旋转培养 chamber 以均匀分布细胞。将 chamber 置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育。除细胞培养 chamber 外，还需在 15 厘米培养皿中以每平方厘米 10 的 4 次方个细胞的密度培养细胞，作为汇合度的参考。孵育65小时后，当细胞融合度达到80%至90%时，缓慢将聚乙烯亚胺-DNA与DMEM的混合物加入细胞培养室的加样口。在37°C、5% CO₂条件下继续孵育72小时之前，需将液体均匀分布至所有行。孵育结束后，剧烈振摇细胞培养室以使细胞脱落，直至培养基呈现浑浊状态，然后将其倒入四个或五个500毫升离心管中。在4摄氏度下，以18,000 × g离心30分钟，使细胞沉淀。将澄清的上清液倒入一个1升的PETG瓶中，并在500毫升离心管中用50毫升授权缓冲液重悬细胞沉淀。将离心管在37摄氏度下孵育60分钟。孵育后，将离心管在18,000 × g条件下离心30分钟，并将上清液转移至同一个一升的PETG瓶中。于-80 °C保存。在4 °C条件下过夜解冻粗裂解液。解冻后，使用0.22微米滤器过滤。在纯化步骤开始前，立即向每根正在使用的肝素-Sepharose柱加入4毫升滤器预处理缓冲液，以钝化离心浓缩器。将管路放入蠕动泵中。依次运行溶液和培养基。将五毫升肝素-Sepharose柱连接到管路上，通过柱子泵入25毫升Bazell DMEM，以进行层析准备。然后以每秒一至两滴的流速，将0.2微摩尔的过滤后粗裂解液上样至柱中。依次用含镁和钙的 HBSS 缓冲液配制的 300 毫摩尔氯化钠溶液各 5 毫升洗涤层析柱五次，并将五次洗脱液分别标记为 E1 至 E5。准备就绪后，将含有预处理缓冲液的离心浓缩管在 900 × g 条件下离心 2 分钟，弃去滤过液。再用 4 毫升含镁和钙的 HBSS 缓冲液洗涤离心浓缩管滤膜，在 1000 × g 条件下离心 2 分钟。然后将洗脱液 E2 加入离心浓缩管中，在 1000 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去滤过液。同样将洗脱液 E3 加入离心浓缩管中离心，直至浓缩后的病毒体积约为 1 毫升。使用P200滤芯吸头从离心浓缩装置中移除浓缩后的病毒，并将其收集到无菌的1.5毫升离心管中。收集病毒后，用200微升含镁和钙的HBSS冲洗离心浓缩装置。剧烈吹打30秒，以充分洗脱黏附在膜上的任何病毒，并将洗脱液收集至同一支1.5毫升离心管中。充分混匀试管。在4°C保存前，用20%乙醇洗涤并饱和化层析柱。将泵管保存在1 mol/L氢氧化钠溶液中。通过肌肉注射后28天，比较了AAV6.2FF衣壳在小鼠、仓鼠和羔羊中的转导效率。给予小鼠每公斤体重5×10¹²个病毒基因组的AAV6.2FF人源IgG，其血清中人IgG表达水平在171至237微克/毫升之间。给予仓鼠每公斤体重2×10¹³个病毒基因组的AAV6.2FF人源IgG，其人IgG表达水平显著高于小鼠。尽管大型动物模型能够在血浆中表达平均35 µg/mL的人源IgG水平。大型动物模型可用于确定AAV转基因在体内的表达情况，并评估这些转基因是否对目标疾病或障碍具有治疗效果。该研究展示了AAV6.2FF在骨骼肌中强大的转导能力，这是一种新型的AAV6血清型载体，同时也表明AAV病毒载体在体内具有较低的免疫原性。

production-adeno-associated-virus-vectors-cell-stacks-for-preclinical

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在细胞堆中生产腺相关病毒载体，用于大型动物模型的临床前研究

重组腺相关病毒（rAAVs）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。in vivo...

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。...

通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

来源：Ehrke-Schulz, E., 等. 基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产。J. Vis. Exp.

大规模生产高容量腺病毒载体

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

在本研究中，通过使用由输注/抽取注射泵、可拆卸气密注射器及显微注射针组成的注射系统，证明了结膜下注射可作为小鼠眼组织有效的载体递送方法。该注射系统也可适用于其他眼内给药途径。...

小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

通过减少与重现技术，可以估算海洋和淡水系统中病毒的更替速率。这些数据使研究人员能够推断水生系统中由病毒介导的微生物死亡率。...

估算水生系统中的病毒生成速率

本文介绍了用于检测大鼠和小鼠体内或体外寄生虫感染的各种筛查方法。将演示多种诊断检测技术，包括适用于活体动物的检测方法以及动物安乐死后使用的检测方法。文中将包含有助于识别大鼠和小鼠寄生虫的图片。...

实验室大鼠和小鼠体外及体内寄生虫的诊断

了解利用贴壁HEK293细胞培养室高效生产高滴度、高纯度AAV病毒载体的方法。该技术适用于大型动物模型的临床前基因治疗研究，可获得超过1×10¹³载体基因组/毫升的稳定产量。

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

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