通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

树突状细胞（DC）是连接先天免疫系统与适应性免疫系统的关键免疫细胞。尽管树突状细胞具有异质性，该方法有助于我们了解哪些基因（包括转录因子）可能调控树突状细胞的发育。该技术提供了一种简单快速的方法，可在体外鉴定调控树突状细胞从其前体细胞发育的基因。

首先，将永生化的造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）维持在完全RPMI 1640培养基中，培养基中添加100 纳克/毫升 FLT3配体和1 微摩尔 β-雌二醇。进行慢病毒转导时，将iHSPCs以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入含FLT3配体、β-雌二醇和polybrene的1 毫升完全培养基。随后，向每孔加入携带短发夹RNA的慢病毒，感染复数（MOI）为100。

接下来，在37°C条件下以1100 × g离心90分钟，然后将感染的细胞在37°C下孵育过夜。次日，通过离心将细胞收集至15 mL离心管中以去除聚凝胺，随后更换为含有FLT3配体和β-雌二醇的新鲜完全培养基。再培养24小时后，向培养基中加入6 µg/mL嘌呤霉素以筛选感染的细胞。

每三天更换一次筛选培养基，持续培养细胞至少一周，以扩增稳定转导的iHSPCs。在添加FLT3配体和β-雌二醇的完全培养基中，建立并维持LacZ、Tcf4和Id2稳定敲低的iHSPCs。为启动体外分化，将未分化的iHSPCs收集至15毫升离心管中，通过离心形成细胞沉淀。

离心后，弃去上清液，并用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于仅含有 FLT3 配体的完全培养基中，然后以每毫升 2 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 12 孔板中。三天后，加入 1 毫升含有 FLT3 配体的新鲜完全培养基。

再经过两天后，通过流式细胞术分析分化后的细胞。进行流式细胞术分析时，先在培养板中将细胞轻轻吹打 2 至 3 次，然后收集细胞至 1.5 毫升离心管中。离心后弃去上清液，再将细胞重悬于 50 微升 fax 缓冲液中。

接下来，加入50 µL由32杂交瘤上清液提供的抗CD16抗体，冰上孵育5至10分钟。然后，将荧光染料偶联抗体直接加入细胞中，避光冰上孵育15分钟。孵育结束后，用1 mL fax缓冲液洗涤细胞，并对样本进行离心。

离心后，将细胞重悬于100 µL fax缓冲液中，并通过流式细胞术分析样品。在iHSPC中通过短发夹RNA介导的LacZ、Tcf4和Id2敲低后，RTQ-PCR对敲低效率的验证显示，Tcf4敲低的iHSPC中Tcf4的表达量较LacZ敲低的iHSPC降低。Id2敲低的iHSPC中Id2的表达也观察到类似结果。

在培养LacZ敲低的iHSPCs五天后，代表树突状细胞群体的CD11c阳性细胞频率约为95%。然而，敲低Tcf4或Id2会轻微减少CD11c阳性树突状细胞的生成。进一步分析来自LacZ敲低iHSPCs的CD11c阳性树突状细胞发现，其中70%为经典树突状细胞，22%为浆细胞样树突状细胞。与LacZ敲低对照组相比，Tcf4敲低的iHSPCs生成的浆细胞样树突状细胞比例显著降低。

相比之下，Id2基因敲低的iHSPC产生的传统树突状细胞比例显著低于LacZ基因敲低的对照组，但产生浆细胞样树突状细胞的比例更高。旋转感染可提高携带shRNA的慢病毒对iHSPC的转导效率。该技术有助于研究转录因子的作用，并促进对细胞因子信号转导或代谢相关基因在树突状细胞发育过程中功能的探讨。