Name: 短发夹RNA介导的基因敲低在造血干和祖细胞系体外发育的树突状细胞发育研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学习利用短发夹RNA介导的基因敲低技术，在永生化造血干和祖细胞系中研究树突状细胞发育机制。该方法通过慢病毒转导建立稳定敲低细胞系，助力识别调控免疫细胞分化的关键转录因子。

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我们感谢陈姿伶博士提供的技术支持。感谢台湾国家RNA干扰核心设施（中央研究院，中国台湾）提供shRNA慢病毒（http://rnai.genmed.sinica.edu.tw）。本研究由台湾科技部（MOST 108-2320-B-002-037-MY3 和 MOST 109-2320-B-002-054-MY3）资助。

慢病毒的操作按照中国台湾大学医学院环境健康与安全部门的规定进行。
1. 永生化造血干细胞和祖细胞系（iHSPCs）的制备
<ol>
	<li>在含有 100 ng/mL FL 和 1 µM β-雌二醇的完全 RPMI 1640 培养基中培养 iHSPC 细胞系。</li>
	<li>每 3 天以 1:10 的比例传代细胞。 
	​注意：通过添加 10% 胎牛血清 (FBS)、5 x 10-5 M β-巯基乙醇和 10 µg/mL 庆大霉素配制完全 RPMI 1640 培养基。重组小鼠 FL 也可从商业途径获得。</li>
</ol>
2. 慢病毒转导
<ol>
	<li>将iHSPCs以1 × 105 个细胞/孔的密度接种于12孔板中，每孔加入含100 ng/mL FL、1 µM β-雌二醇和8 µg/mL polybrene的1 mL完全培养基。 
	注意：polybrene的浓度取决于细胞类型，通常在4–8 µg/mL范围内。</li>
	<li>在每孔中加入携带shRNA的慢病毒，感染复数（MOI）为100。 
	注意：慢病毒载体为带有嘌呤霉素筛选标记的pLKO.1-Puro（图1）。针对LacZ、Tcf4和Id2的shRNA靶序列分别列于材料表中。MOI定义为感染过程中每个细胞所添加的病毒颗粒数量。 
	<img alt="MOI计算公式；病毒滴度、体积、总细胞数分析；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式1"></li>
	<li>在37 °C下以1,100 × g离心90分钟。 
	注意：感染离心使用摆动桶转子进行。</li>
	<li>将含有感染细胞的培养板置于培养箱中，在37 °C下孵育过夜。 
	注意：若细胞对polybrene敏感，则在离心感染后用不含polybrene的完全培养基更换培养液。</li>
	<li>感染24小时后，用含100 ng/mL FL和1 µM β-雌二醇的完全培养基更换培养液。</li>
	<li>再过24小时后，在培养基中加入6 µg/mL嘌呤霉素以筛选感染细胞。 
	注意：慢病毒载体通常需要48小时才能表达基因，包括嘌呤霉素抗性基因。请确保针对每种细胞系优化嘌呤霉素浓度。</li>
	<li>每3天更换一次含100 ng/mL FL、1 µM β-雌二醇和6 µg/mL嘌呤霉素的筛选培养基，并持续培养至少一周，以扩增稳定转导的iHSPC细胞。 
	​注意：嘌呤霉素筛选通常在48小时后开始起效，筛选持续时间取决于细胞类型。</li>
</ol>
3. 通过逆转录和实时 PCR（RT-PCR）检测敲低效率
<ol>
	<li>从1 x 10⁶细胞中提取总RNA7 shLacZ，shTcf4，以及 shId2 使用商用RNA提取试剂从稳定敲低iHSPC细胞中提取RNA，并用异丙醇沉淀水相中的RNA，随后用75%乙醇洗涤RNA沉淀。</li>
	<li>溶解 RNA（约 5 µg）与 5 µL DEPC 处理的 H2O 并调整浓度至 1 µg/µL.</li>
	<li>取1-3 µg RNA，与经DEPC处理的H2O 至最终体积 17.4 µL，添加 1 µL 1单位/µL RNase-free DNase I 孵育 20 分钟于 37 °C. 
	注意：此步骤用于消化RNA样品中的基因组DNA。</li>
	<li>添加 1 µL 加入20 mM EDTA至RNA样品中，孵育 65 °C 10 分钟以灭活 DNase I，并立即将 RNA 样本置于 4 °C.</li>
	<li>添加 11.6 µL 反应混合物中的 1 µL oligo (dT) 引物的45 µM), 6 µL 5次中的第1次st 链缓冲液， 3 µL dNTP（2 mM） 0.6 µL RNase抑制剂（50单位/μL）µL）和 1 µL 逆转录酶（200 单位/µL) 加入RNA样品中，混匀后置于 40 °C 1小时。</li>
	<li>通过加热终止反应 70 °C 10 分钟，然后用稀释反应混合物 30 µL H的2O.</li>
	<li>取 2 µL 将稀释后的反转录反应体系作为DNA模板，使用针对Tcf4或Id2的引物进行PCR扩增（参见 表1 用于热循环仪条件）。 
	注意：引物序列包含在以下内容中 材料表.</li>
</ol>
4. 体外 稳定敲低iHSPC细胞系的分化
<ol>
	<li>在含有 100 ng/mL FL 和 1 µM β-雌二醇的完全培养基中维持 iHSPCs 中 LacZ (shLacZ)、Tcf4 (shTcf4) 或 Id2 (shId2) 的稳定单基因敲低状态。</li>
	<li>将 shLacZ、shTcf4 和 shId2 未分化的 iHSPCs 收集至 15 mL 离心管中，在 500 x g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，加入 10 mL PBS 洗涤细胞，重复此步骤两次。</li>
	<li>将 iHSPC 细胞重悬，并以 2 x 105 个细胞/mL 的密度接种于 12 孔板中，每孔加入 1 mL 仅含 100 ng/mL FL 的完全培养基。</li>
	<li>三天后，每孔加入 1 mL 新鲜的完全培养基，其中含 100 ng/mL FL。</li>
	<li>再过两天后，通过流式细胞术分析分化后的细胞（shLacZ、shTcf4 和 shId2 iHSPCs）。</li>
</ol>
5. 分化树突状细胞的流式细胞术分析
<ol>
	<li>用移液器在培养板中将细胞上下吹打2-3次，收集至1.5 mL离心管中，在室温（RT）下以500 × g 离心5分钟。 
	注意：体外 分化的树突状细胞（DC）会轻微贴附于培养板上。轻柔吹打有助于从培养板上回收DC细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于50 µL FACS缓冲液中。随后加入50 µL抗CD16/32杂交瘤上清液，置于冰上孵育5-10分钟。 
	注意：Fc受体阻断抗体可防止抗体非特异性结合表达于某些髓系细胞和B细胞上的Fc受体，该抗体可通过多家供应商商业购得。</li>
	<li>直接向细胞中加入荧光染料标记的抗体（每种抗体0.04 µg），避光冰上孵育15分钟。所用抗体包括APC/cy7标记的抗小鼠CD11c、FITC标记的抗小鼠CD11b以及PE标记的抗小鼠B220。 
	注意：浆细胞样树突状细胞（pDCs）定义为CD11c+CD11b-B220+，而经典树突状细胞（cDCs）定义为CD11c+CD11b+B220-。</li>
	<li>用1 mL FACS缓冲液洗涤细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中，通过流式细胞术进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
<li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li>
<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于慢病毒的shRNA载体常用于通过病毒转导实现细胞基因沉默，并可稳定整合到宿主基因组中。然而，不同细胞类型的转导效率存在差异，需予以考虑，目前已有多种方法用于克服这一问题。
Polybrene 是一种多聚阳离子聚合物，能够中和细胞膜上的电荷，从而在转导过程中增强病毒颗粒与细胞的结合20。尽管这是一种提高转导效率的有效方法，但在使用过量时，Polybrene 对某些细胞类型具有毒性。因此，需要检测 Polybrene 的细胞毒性，并在不同细胞中优化其使用浓度。硫酸鱼精蛋白是一种阳离子化合物，可能作为替代方法以提高细胞存活率21。此外，在感染当天更换完全培养基，可改善转导后的细胞存活率。
大多数shRNA递送系统都带有选择性标记，用于清除未成功感染的细胞。我们使用的慢病毒系统含有嘌呤霉素抗性基因，以便在转导后对感染细胞进行筛选。此外，表达GFP的慢病毒也是另一种可选的筛选方法。然而，这两种方法各有优缺点。使用嘌呤霉素作为筛选方法时，除...

树突状细胞（DCs）是天然免疫和适应性免疫的关键调节因子1。DCs主要分为两种功能上不同的细胞群，即浆细胞样DCs（pDCs）和经典DCs（cDCs）。此外，cDCs又包含两个亚群，分别为I型和II型cDCs，或分别称为cDC1s和cDC2s2。pDCs在小鼠中表达BST2、Siglec-H以及中等水平的CD11c3,4，是能够在炎症和病毒感染期间分泌大量I型干扰素（IFN-I）的细胞5。由于其强大的IFN-I产生能力，pDCs还被认为在包括系统性红斑狼疮（SLE）在内的自身免疫性疾病进展中发挥关键作用6。cDC1s在小鼠中以表面表达XCR1、CD8a、CLEC9A和CD103为特征7，擅长通过抗原交叉提呈激活和极化细胞毒性CD8+ T细胞（CTLs），从而在应对胞内病原体和癌症时启动I型免疫应答8,9。另一方面，cDC2s在人和小鼠中均表达CD11b和CD172α（也称为Sirpα），能够激活CD4+ T细胞，促进针对过敏原和寄生虫的II型免疫应答10，并在识别胞外细菌和微生物群后调节III型免疫应答11,12。
树突状细胞（DCs）的分化由骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的一组转录因子（TFs）决定。E2-2（由Tcf4编码）是浆细胞样DCs（pDCs）分化与功能的关键调控因子13,14。相反，DNA结合抑制因子2（ID2）通过阻断E蛋白活性促进经典DCs（cDCs）的特化，并抑制pDC的发育15。此外，cDC1的发育依赖于IRF8和BATF3，而cDC2的分化则高度依赖于IRF416。近期研究已探索了pDCs17和cDCs的异质性及其转录调控机制18。由于DC网络的复杂性，目前迫切需要建立一个平台，以鉴定其他调控DC发育和功能的转录因子。
此处，我们使用了一种通过在骨髓细胞中表达可被雌激素调控的Hoxb8核转位而产生的诱导型造血干细胞/祖细胞（iHSPC）（也称为Hoxb8-FL细胞）。19iHSPCs 在 β-雌二醇和 Flt3 配体（FL）存在下可增殖并保持未分化状态，而在撤除 β-雌二醇后，仅在 FL 存在下即开始分化为不同类型的树突状细胞19基于这一特性，我们可以在前体阶段敲低目标基因，随后检测其对 体外 pDCs 和 cDCs 的分化。因此，该方法是发现调控 DCs 发育和功能基因的有力工具。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td>(克隆号: N418)</td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠/人 CD11b 抗体</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>(克隆号: M1/70)</td></tr><tr><td>PE 抗小鼠/人 B220 抗体</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>(克隆号: RA3-6B2)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>&amp;nbsp;ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养处理板</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇 (&amp;beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>配方: 1×PBS + 0.5% FBS + 0.1% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Flt3 配体 (FL)</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA（靶序列/克隆编号）</td><td>公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&amp;nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>RNAi 联合体 (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>RNAi 联合体 (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>RNAi 联合体 (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过短发夹rna介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

树突状细胞（DCs）是重要的抗原呈递细胞，能够连接先天性免疫与适应性免疫应答。DCs具有异质性，可分为传统树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。cDCs擅长将抗原呈递给初始T细胞并激活其反应；而pDCs在病毒感染期间可大量产生I型干扰素（IFN-I）。DCs的特化过程始于骨髓（BM）中DC前体细胞的早期阶段，并由一系列转录因子（TFs）构成的调控网络决定。例如，cDCs高表达ID2，而pDCs高表达E2-2。随着越来越多DC亚群被鉴定，研究者对调控DC发育的关键TFs日益关注。本文建立了一种用于筛选调控DC分化关键转录因子的方法

树突状细胞，抗原呈递细胞，先天性免疫，适应性免疫，传统树突状细胞，浆细胞样树突状细胞，I型干扰素，骨髓，前体细胞，转录因子，ID2，E2-2，细胞分化，筛选方法 体外 通过将携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒导入永生化造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）系。经过筛选和 体外 通过流式细胞术分析稳定敲低细胞系的分化能力及其向cDC和pDC分化的潜能。该方法为鉴定可能调控树突状细胞从祖细胞发育命运的基因提供了平台 体外.

pLKO.1-Puro 慢病毒载体图谱如下所示（图1）。在递送表达针对 shRNA 的慢病毒后 LacZ （非靶向对照）， Tcf4，以及 Id2 在iHSPCs中，通过RT-qPCR验证的敲低效率显示，基因表达水平 Tcf4 在 sh 中减少Tcf4 iHSPCs 与 sh 相比LacZ iHSPCs（诱导型造血干细胞样细胞）图2A）。另一方面，表达降低的 Id2 在sh中也观察到Id2 iHSPCs 与 sh 相比LacZ iHSPCs 对照组（图2B）。shLacZ,shTcf4，以及 shId2 iHSPCs 细胞系被分化为 pDCs 和 cDCs 体外 与FL共培养五天后LacZ iHSPCs中CD11...

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外 树突状细胞分化

通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

树突状细胞（DCs）是重要的抗原呈递细胞，能够连接先天免疫与适应性免疫应答。DCs具有异质性，可被分为……

树突状细胞（DC）是连接先天免疫系统与适应性免疫系统的关键免疫细胞。尽管树突状细胞具有异质性，该方法有助于我们了解哪些基因（包括转录因子）可能调控树突状细胞的发育。该技术提供了一种简单快速的方法，可在体外鉴定调控树突状细胞从其前体细胞发育的基因。首先，将永生化的造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）维持在完全RPMI 1640培养基中，培养基中添加100 纳克/毫升 FLT3配体和1 微摩尔 β-雌二醇。进行慢病毒转导时，将iHSPCs以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入含FLT3配体、β-雌二醇和polybrene的1 毫升完全培养基。随后，向每孔加入携带短发夹RNA的慢病毒，感染复数（MOI）为100。接下来，在37°C条件下以1100 × g离心90分钟，然后将感染的细胞在37°C下孵育过夜。次日，通过离心将细胞收集至15 mL离心管中以去除聚凝胺，随后更换为含有FLT3配体和β-雌二醇的新鲜完全培养基。再培养24小时后，向培养基中加入6 µg/mL嘌呤霉素以筛选感染的细胞。每三天更换一次筛选培养基，持续培养细胞至少一周，以扩增稳定转导的iHSPCs。在添加FLT3配体和β-雌二醇的完全培养基中，建立并维持LacZ、Tcf4和Id2稳定敲低的iHSPCs。为启动体外分化，将未分化的iHSPCs收集至15毫升离心管中，通过离心形成细胞沉淀。离心后，弃去上清液，并用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于仅含有 FLT3 配体的完全培养基中，然后以每毫升 2 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 12 孔板中。三天后，加入 1 毫升含有 FLT3 配体的新鲜完全培养基。再经过两天后，通过流式细胞术分析分化后的细胞。进行流式细胞术分析时，先在培养板中将细胞轻轻吹打 2 至 3 次，然后收集细胞至 1.5 毫升离心管中。离心后弃去上清液，再将细胞重悬于 50 微升 fax 缓冲液中。接下来，加入50 µL由32杂交瘤上清液提供的抗CD16抗体，冰上孵育5至10分钟。然后，将荧光染料偶联抗体直接加入细胞中，避光冰上孵育15分钟。孵育结束后，用1 mL fax缓冲液洗涤细胞，并对样本进行离心。离心后，将细胞重悬于100 µL fax缓冲液中，并通过流式细胞术分析样品。在iHSPC中通过短发夹RNA介导的LacZ、Tcf4和Id2敲低后，RTQ-PCR对敲低效率的验证显示，Tcf4敲低的iHSPC中Tcf4的表达量较LacZ敲低的iHSPC降低。Id2敲低的iHSPC中Id2的表达也观察到类似结果。在培养LacZ敲低的iHSPCs五天后，代表树突状细胞群体的CD11c阳性细胞频率约为95%。然而，敲低Tcf4或Id2会轻微减少CD11c阳性树突状细胞的生成。进一步分析来自LacZ敲低iHSPCs的CD11c阳性树突状细胞发现，其中70%为经典树突状细胞，22%为浆细胞样树突状细胞。与LacZ敲低对照组相比，Tcf4敲低的iHSPCs生成的浆细胞样树突状细胞比例显著降低。相比之下，Id2基因敲低的iHSPC产生的传统树突状细胞比例显著低于LacZ基因敲低的对照组，但产生浆细胞样树突状细胞的比例更高。旋转感染可提高携带shRNA的慢病毒对iHSPC的转导效率。该技术有助于研究转录因子的作用，并促进对细胞因子信号转导或代谢相关基因在树突状细胞发育过程中功能的探讨。

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免疫学与感染

短发夹RNA介导的基因敲低在造血干和祖细胞系体外发育的树突状细胞发育研究

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。...

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

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慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。...

骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

在本视频中，我们演示一种方法，通过将 shRNA...

体外短发夹RNA介导的iHSPCs基因敲低：基于慢病毒的shRNA表达系统递送用于iHSPCs中特定基因表达的敲低

从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

本方案描述了利用FACS介导的细胞分离、水动力基因转移以及Peyer氏斑中免疫细胞亚群的流式分析等技术，评估浆细胞样树突状细胞由共同树突状细胞前体在Peyer氏斑中分化过程的实验步骤。...

采用造血祖细胞过继转移法评估派伊尔集合淋巴结中鼠源浆细胞样树突状细胞的发育

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

本研究中，我们介绍了一种 体外 可高效生成浆细胞样树突状细胞的培养系统 由 在Flt3配体存在下，将普通淋巴样祖细胞与AC-6饲养细胞共培养。...

体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

学习利用短发夹RNA介导的基因敲低技术，在永生化造血干和祖细胞系中研究树突状细胞发育机制。该方法通过慢病毒转导建立稳定敲低细胞系，助力识别调控免疫细胞分化的关键转录因子。

通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育体外

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