大规模多组学全基因组关联研究（Mo-GWAS）：样本制备与标准化操作指南

研究较大群体时会伴随机器驱动的变异，这种变异会掩盖源自自然多样性的实际变异。本文展示了一种减少下游整合分析中技术变异的方法。该技术的优势包括基于表面分离的提取，可在相应的分析平台上对多种代谢物进行分析，同时消除系统性误差并保留生物学变异。

获得基因型和表型信息后，该方法可应用于生命任何界中的多样化自然种群。首先取20毫升的采样管，加入两颗直径为5毫米和两颗直径为8毫米的金属珠用于组织匀浆，并对采样管进行标记。然后，用液氮填充杜瓦瓶，在剪取新鲜的叶片和根组织样品后，立即在液氮中通过速冻方式进行冷冻保存。

将收获的生物样品在 -80 摄氏度下保存，以备后续处理。将试管架在液氮中预冷。随后，在 25 赫兹条件下研磨组织 1 分钟，以获得均一的粉末。

若组织未被均匀研磨，则重复冷冻和研磨步骤。取50毫克新鲜植物材料，放入预冷的、已标记的2毫米安全锁微离心管中，确保称量过程中植物材料始终保持冷冻状态。向50毫克样品中加入1毫升预冷的提取液1，短暂涡旋混匀，然后置于冰上。

将样品置于轨道摇床上，在4°C条件下以800 × g离心10分钟，随后在冰浴冷却的超声仪中进行10分钟超声处理。使用多通道移液器向样品中加入500 µL提取混合液，短暂涡旋混匀提取物，然后在4°C条件下以11,200 × g离心5分钟。离心后，将分离出的上层含脂相500 µL转移至预先标记的1.5 mL安全锁微离心管中，并弃去剩余的上层相。

在不同的1.5毫升安全锁微型离心管中，分别转移150 µL下层半极性相用于GC-MS分析，以及300 µL半极性相用于U-HPLC-MS分析。使用真空浓缩仪在不加热的条件下蒸发溶剂，浓缩所有提取组分，并将干燥后的组分在20 °C下保存。为进行超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析，将干燥的半极性组分重新溶解于180 µL甲醇与水的混合液中。

然后将半极性相超声处理2分钟，随后以11,200 ×g离心1分钟。离心后，取90 µL上清液转移至玻璃小瓶中，并将2 µL提取物注入已装入LCMS的样品中。采用C18反相色谱柱进行代谢物分离，柱温维持在40 °C，流速为400 µL/min，并逐步改变流动相A和B的比例。在负离子化模式下采集测试空白样和质量控制样品的质谱数据，质荷比范围为102–1500。

对于半极性代谢物样品，在负离子和正离子化模式下，采用数据依赖型串联质谱法运行混合质控样品。利用获得的质谱数据进行注释。通过检查内标物的分布情况，对数据集进行归一化处理。

通过校正单个或多个内标的信号对数据进行归一化处理。接着，根据样品的精确重量校正色谱图中获得的峰强度。为校正多批次系列中峰强度的漂移，采用基于质控样本（QC）的校正方法，例如使用R语言进行局部加权散点平滑法（LOESS）校正。在进行全基因组关联分析（GWAS）之前，使用TASSEL软件对基因型数据进行过滤，剔除次要等位基因频率低于5%以及缺失率高于10%的位点。

这将避免低频偏差。为消除由环境因素引起的偏差，使用R软件包LME4，对实验重复中每个标准化特征计算最佳线性无偏预测值（BLUPs）。利用每个特征的BLUPs值，单独进行GWAS分析，使用R中的rMVP软件包。基于来自不同批次的两个QC样本的原始基峰色谱图，展示多个常见菜豆物种的脂质组学数据。 关键词：避免低频偏差，环境因素，R软件包LME4，最佳线性无偏预测值（BLUPs），标准化特征，实验重复，GWAS，rMVP软件包，脂质组学数据，常见菜豆物种，基峰色谱图，QC样本，批次差异

某些脂质类别的信号强度存在差异。当对原始数据进行主成分分析时，系统误差更为明显。归一化处理（包括局部加权散点图平滑法）使得质控样本实现了聚类。

在对各个簇进行解析时，第七和第八批次在归一化前的机器驱动误差变得明显，这些误差随后被校正。经过归一化和转换后的个体代谢组学簇被用于全基因组关联分析（GWAS），获得了多个性状标记关联结果。在代表性分析中，不同化合物类别以不同颜色标出，而与多个化合物类别相关的标记则以其最近的基因为指示。

数据标准化与转换是最重要的步骤之一。应确保已进行适当的校正以消除系统误差，并保证数据分布的正态性。通过校正分析变异，可采用多种整合分析方法，例如代谢物相关性分析以及与表型组数据的整合，以揭示复杂性状的潜在机制。