Name: 使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学习使用同质珠检测技术研究Hsp90与FKBP51或FKBP52的分子伴侣相互作用，通过高通量筛选快速鉴定小分子抑制剂，为阿尔茨海默病和癌症等疾病的治疗研究提供可靠方法。

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本研究由瑞典研究理事会（2018-02843）、瑞典脑基金会（Fo 2019-0140）、卡罗林斯卡 Institutet 老年疾病基金会、Gunvor 和 Josef Anérs 基金会、Magnus Bergvalls 基金会、Gun 和 Bertil Stohnes 基金会、Tore Nilssons 医学研究基金会、Margaretha af Ugglas 基金会以及老雇员基金会资助。

注意：本方案的概述见图2。
1. GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达与纯化（图 2A）
<ol>
	<li>质粒 
	注意：从 IMAGE 联盟获取人源 FKBP51（克隆编号：5723416）和人源 FKBP52（克隆编号：7474554）的 cDNA 克隆。
	<ol>
		<li>使用引物（正向引物：5`GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3`，反向引物：5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`）通过 PCR 扩增人源 FKBP51 DNA，该引物包含 BamHI 和 XhoI 突出端，随后将其克隆至 pGEX6-1 载体的 BamHI / XhoI 限制性酶切位点。</li>
		<li>使用引物（正向引物：5`-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3`，反向引物：5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`）通过 PCR 扩增人源 FKBP52 DNA，该引物包含 EcoRI 和 XhoI 突出端，随后将其克隆至 pGEX6-2 载体的 EcoRI / XhoI 限制性酶切位点。 
		注意：PCR 反应体系及反应条件见表 1和表 2。</li>
		<li>验证插入序列的正确性，并按照制造商说明书将质粒转化至化学感受态E. coli中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白表达与纯化
	<ol>
		<li>将 25 g LB 培养基基础成分溶于 1 L 去离子水中配制 LB 溶液，121 °C 高压灭菌 15 分钟。冷却后加入 50 µg/mL 氨苄青霉素。</li>
		<li>挑取表达 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 的单菌落，加入 1.5 mL 离心管中的 500 µL LB 溶液中，涡旋混匀。</li>
		<li>将步骤“1.2.2”的混合液转移至铝箔封口的锥形瓶中的 1 L LB 溶液中，37 °C 摇床过夜培养。</li>
		<li>加入 1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，继续孵育 2 小时。</li>
		<li>以 5,000 x g 离心 15 分钟收集菌体沉淀，弃去上清液。 
		注意：菌体沉淀可于 -20 °C 保存。</li>
		<li>将菌体沉淀重悬于 40 mL PBS 中，冰上超声处理 3 次，每次 20 秒。加入 1 mM PMSF、1 mM EDTA 及蛋白酶抑制剂混合物（1 片）以防止蛋白降解。</li>
		<li>将裂解液在 50,000 x g 离心 30 分钟以去除细胞碎片，上清液上样至 5 mL GST-trap 柱。</li>
		<li>用 30 mL PBS 洗涤层析柱后，使用 5 mL 含 10 mM 谷胱甘肽的 PBS 缓冲液洗脱 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52。</li>
		<li>使用 15 mL 10,000 MWCO 离心浓缩装置浓缩蛋白。为去除游离谷胱甘肽，将浓缩液通过以 0.5x PBS 平衡的 PD-10 脱盐柱，并再次使用离心过滤装置浓缩。</li>
		<li>收集含蛋白的洗脱组分，通过 SDS-PAGE 验证蛋白，并将蛋白浓度调整至 1 mg/mL。 
		注意：典型蛋白得率为 2–5 mg/L 培养液。蛋白可于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将 Hsp90 C 端肽段偶联至受体珠（图 2B）
<ol>
	<li>Hsp90 肽段制备
	<ol>
		<li>合成十氨基酸肽 NH2-EDASRMEEVD-COOH，对应人Hsp90β同工型第714-724位氨基酸（UniProt ID: P08238），由多肽合成服务制备。</li>
		<li>将Hsp90肽用PBS稀释至1 mg/mL浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>受体珠制备
	<ol>
		<li>将未结合的受体珠用 PBS 稀释至 1 mg/mL 浓度，并转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>通过离心在 16,000 x g 条件下进行洗涤 g 孵育15分钟。小心移除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合
	<ol>
		<li>将珠子与肽的比例设为10:1。在含有1 mg受体珠沉淀（按上述方法制备）的1.5 mL离心管中，加入1 mL PBS（pH 7.4）和0.1 mg稀释后的肽。 1.25 µL Tween-20， 10 µL 400 mM 氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）溶液3CN) 溶于水中。 
		警告：NaBH3CN 有毒；使用时应佩戴手套，并在通风橱中操作。NaBH3CN溶液应新鲜配制。</li>
		<li>在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时 37 °C 在旋转摇床中以末端对末端的方式振荡（10-20 rpm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应终止与磁珠洗涤
	<ol>
		<li>添加 20 µL 加入1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液以封闭未反应位点，于室温孵育1小时 37 °C.</li>
		<li>以 16,000 x g 离心 g （或最大速度）离心15分钟 4 °C. 弃去上清液，将珠粒沉淀重悬于 1 mL Tris-HCl 溶液（100 mM，pH 8.0）中。</li>
		<li>重复洗涤步骤三次。</li>
		<li>最后一次离心后，用储存缓冲液（含0.01%叠氮化钠作为防腐剂的0.5 × PBS 1 mL）将磁珠重悬至浓度为1 mg/mL。将偶联的受体磁珠溶液储存于 4 °C 避光 
		警告：叠氮化钠具有毒性；需在通风橱中操作并佩戴手套。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 探测 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 与 Hsp90 C 端肽相互作用的实验，以及小分子量化合物的抑制作用（图 2C）
<ol>
	<li>与谷胱甘肽供体珠结合的 GST 标签蛋白
	<ol>
		<li>在 384 孔板中设置反应体系。</li>
		<li>配制含有 10 µg/mL 谷胱甘肽供体珠的溶液，溶剂为 0.5x PBS，pH 7.4。 
		注意：长期储存后珠子会沉降，使用前需涡旋混匀。</li>
		<li>加入 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52，使其终浓度为 10 µg/mL。</li>
		<li>在 25 °C 避光孵育 10 分钟。 
		注意：此步骤中，GST 标签蛋白将与珠子上连接的谷胱甘肽结合。每个孔使用 22.5 µL 该混合液。结合伴侣的浓度需通过实验确定。对 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 进行滴定，选择信号最佳的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物添加
	<ol>
		<li>在 DMSO 中对测试化合物进行系列稀释。 
		注意：通常使用的浓度为 10、30、100、300、1,000 和 3,000 µM。</li>
		<li>向每孔板的孔角加入 0.25 µL DMSO（阴性对照）或 Hsp90 C 端肽（阳性对照，30 µM）或 DMSO 中的化合物。每个化合物浓度设三个重复。</li>
		<li>向每个孔中加入 22.5 µL 含有谷胱甘肽供体珠与 GST 标签蛋白的混合溶液。</li>
		<li>用手轻轻但充分振荡混匀，25 °C 避光孵育 15 分钟。 
		注意：在此期间，化合物将与 Hsp90 C 端肽结合位点处的 TPR 结构域相互作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>受体珠添加
	<ol>
		<li>用 0.5x PBS 将连接有 Hsp90 C 端肽的受体珠稀释至 100 µg/mL。</li>
		<li>向每个孔中加入 2.25 µL 稀释后的受体珠。</li>
		<li>轻轻但充分混匀，25 °C 避光孵育 15 分钟。 
		注意：此步骤中，供体珠和受体珠通过蛋白-肽相互作用靠近。反应体系终体积为 25 µL，因此化合物的终浓度范围为 0.1 至 30 µM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>板读取 
	注意：使用设定为相应模式的酶标仪读取板。
	<ol>
		<li>打开仪器并启动软件</li>
		<li>选择相应的检测程序。</li>
		<li>点击 编辑板图，并选择板中用于检测的孔位。</li>
		<li>点击 下一步 继续，然后点击 运行 所选程序。</li>
		<li>检测完成后，点击 显示结果 查看结果。</li>
		<li>导出数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>Z'因子和信噪比（S/B比值）
	<ol>
		<li>使用以下公式计算该检测的 Z' 因子和 S/B 比值： 
		Z'=1-(3σ阳性+3σ阴性)/│µ阳性-µ阴性│16 
		S/B=µ阴性/µ阳性 
		其中，σ 和 µ repr呈现阳性对照（Hsp90 C末端肽）的标准差和均值 30 µM）和阴性（DMSO）对照。Z' 因子 &gt; 0.5 将确保该检测方法具有足够的稳健性以用于筛选。为监测检测的灵敏度，还计算了S/B比值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剂量-反应曲线和IC 50 
	注意：使用软件通过非线性回归分析拟合Hsp90-共伴侣蛋白PPI抑制剂的数据。
	<ol>
		<li>在 XY 数据表中创建 欢迎 对话框并选择 X 数字，以及 Y 输入 3 （若设三个重复） 并列列中的重复值.</li>
		<li>将样本的信号数据归一化至阴性对照组。将浓度值导入 X 列，信号值导入 Y 列。</li>
		<li>点击 分析 并选择 转化浓度（X） 在……下方 转换 | 归一化. 选择 转换为对数. 
		注意：这将把浓度转换为对数尺度。如果您的起始浓度为零，请将其设为一个极小的、可视为零的数值（例如 0.1 nM），以避免丢失这些数据，因为零的对数无定义。</li>
		<li>点击 分析 并选择 非线性回归（曲线拟合） 在……下方 XY 分析，打开 剂量-反应抑制 并选择 对数（抑制剂）与反应关系——可变斜率.</li>
		<li>点击 好的 以查看 结果 （含IC50 值）和 图表.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="GST-FKBP 表达纯化过程及 Hsp90 耦合；珠结合实验相互作用示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：本实验方案的示意图。 （A）GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达与纯化。（B）将 Hsp90 C 端肽段耦合至受体珠上。（C）检测 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 与 Hsp90 C 端肽段之间相互作用的实验。小分子化合物的抑制作用。图片由 BioRender.com 制作 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<ol><li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li>
<li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system%3A+lifting+client+proteins+to+new+heights%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li>
<li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li>
<li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li>
<li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li>
<li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes%3A+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li>
<li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li>
<li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay%3A+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li>
<li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions%3A+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li>
<li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li>
<li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen%28R%29+analysis%3A+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720(2020).</li>
<li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种利用该检测方法筛选抑制Hsp90与含TPR基序共伴侣蛋白（特别是FKBP51和FKBP52）相互作用的小分子的实验方案。其具有较高的Z'分数（&gt;0.8）表明该方法在高通量模式下具有良好的稳健性和可靠性。结果可在一小时内获得，且仅需少量磁珠、蛋白质和化合物。此外，本方案可轻松拓展至任何感兴趣的Hsp90/Hsp70与含TPR模体的共伴侣蛋白之间的相互作用研究。已有多种Hsp90的含TPR模体共伴侣蛋白被发现与多种人类疾病相关，包括阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、癌症等。本文所述方案提供了一种 体外 一种用于高通量筛选抑制具有重要医学意义的分子伴侣-共伴侣相互作用的小分子的稳定且经济的检测方法。
此外，在评估靶向 TPR 结构域并抑制其与 Hsp90 相互作用的药物时，不仅需要考察其对靶标的亲和力，还需评估其对其他含 TPR 模体蛋白的选择性。人类基因组编码了&gt; 20 种能够与 Hsp90 C 末端肽段相互作用的 TPR 模体蛋白。本实验利用谷胱甘肽磁珠和 GST 标签蛋白，可评估药物对多个结合型 TPR 靶点的影响。本实验室拥有包含 20 种...

分子伴侣参与蛋白质稳态，包括蛋白质折叠、转运和降解。它们调控多种细胞过程，并与癌症和神经退行性疾病等多种疾病相关联1热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的一类分子伴侣，其功能依赖于由ATP水解驱动的构象变化，以及通过其共伴侣蛋白介导的与客户蛋白的结合。2尽管Hsp90作为治疗靶点具有明显的潜力，但对其功能进行精细调控仍面临巨大挑战。目前已有多款靶向N端ATP结合区的Hsp90抑制剂进入临床试验阶段，但尚无任何一种获得上市批准。3由于缺乏明确的配体结合口袋4，靶向Hsp90的C端区域收效有限4近年来，小分子干扰Hsp90与共伴侣蛋白相互作用已被研究作为一种替代策略5靶向Hsp90与共伴侣蛋白之间的相互作用不会引发普遍的细胞应激反应，且提供了特异性调控多种细胞内过程的可能性。Hsp90羧基末端保守的MEEVD五肽是其与共伴侣蛋白中四肽重复（TPR）基序相互作用的关键结构。6在人类蛋白质数据库注释的736种含有TPR模体的蛋白质中，约有20种不同的蛋白质通过该肽段与Hsp90相互作用7竞争MEEVD肽结合位点的分子会破坏Hsp90与含有TPR结构域的共伴侣蛋白之间的相互作用。该肽结合位点具有相似的三级结构，但不同TPR模体结构域之间的整体同源性相对较低7，为鉴定能够特异性阻断Hsp90与特定TPR基序共伴侣蛋白之间相互作用的分子提供了机会。在这些TPR基序共伴侣蛋白中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号通路的调控因子，参与多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、应激相关疾病、代谢性疾病和阿尔茨海默病8尽管FKBP51和FKBP52具有相似性 &gt; 序列相似性达80%，但其功能不同：FKBP52通常是SHR活性的正向调节因子，而FKBP51在大多数情况下是负向调节因子8因此，鉴定出特异性阻断Hsp90与FKBP51或FKBP52相互作用的分子，为相关疾病的治疗提供了有前景的治疗潜力。
A扩增的 L发光的 P邻近性 H均一的 AAlphaScreen 检测法最初由 Ullman EF 等人于 1994 年开发。9。如今，它被广泛用于检测多种类型的生物相互作用，例如肽10蛋白质11，DNA12，RNA13，以及糖14该技术使用两种微珠（直径200 nm），一种为供体微珠，另一种为受体微珠。生物分子被固定在这些微珠上，其生物相互作用使供体与受体微珠相互靠近。在680 nm激发下，供体微珠中的光敏剂被激活，将氧气转化为单线态氧。由于单线态氧寿命较短，其扩散距离不超过200 nm。若受体微珠处于邻近位置，其含有的硫代蒽衍生物将与单线态氧反应，产生370 nm的化学发光。该能量进一步激活同一受体微珠中的荧光基团，使其发射520–620 nm的光信号。15如果生物相互作用被破坏，受体微珠与供体微珠无法接近，导致单线态氧衰变，信号产生降低。
本文介绍了一种利用该技术筛选抑制Hsp90与TPR结构域共伴侣蛋白（特别是FKBP51和FKBP52）相互作用的小分子的实验方案。将对应于Hsp90极端C末端的10个氨基酸长的肽段连接至受体微珠上，纯化的GST标签TPR结构域共伴侣蛋白则与谷胱甘肽偶联的供体微珠结合。当Hsp90来源的肽段与TPR结构域共伴侣蛋白相互作用使两种微珠靠近时，会产生放大信号（图1A）。若待测小分子能够抑制Hsp90与TPR结构域共伴侣蛋白之间的相互作用，则该放大信号会减弱（图1B）。通过定量检测可计算其IC50值。本方案可推广至其他感兴趣的分子伴侣与TPR结构域共伴侣蛋白之间的相互作用研究，在开发特异性阻断Hsp90与FKBP51或FKBP52相互作用的新型分子方面具有重要意义。
<img alt="单线态氧生成示意图，显示在 680 nm 处激发并在 520-620 nm 处发射。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：本检测的基本原理。（A）纯化的 GST-FKBP51 与谷胱甘肽连接的供体微珠结合。与 Hsp90 极端 C 末端对应的 10 个氨基酸长的肽段连接至受体微珠。Hsp90 来源的肽段与 FKBP51 的 TPR 结构域之间的相互作用使供体和受体微珠彼此靠近。在 680 nm 激发下，供体微珠中的光敏剂被激活，将氧气转化为单线态氧。受体微珠上的噻吨衍生物与单线态氧反应，并在 370 nm 处产生化学发光。该能量进一步激活同一受体微珠中的荧光团，使其在 520-620 nm 发射光信号。（B）当小分子抑制 Hsp90 与 FKBP51 之间的相互作用时，供体和受体微珠无法接近。此时具有短寿命的单线态氧发生衰变，不产生可检测的信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>384孔板</td><td>Perkin Elmer</td><td>6008350</td><td>检测体积 25 ml</td></tr><tr><td>Amicon 10,000 MWCO 离心浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td>浓缩蛋白</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>细菌摇床 Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td></td><td>培养细菌</td></tr><tr><td>人 FKBP51 的 cDNA 克隆</td><td>Source BioScience</td><td>克隆编号：5723416</td><td>pCMV-SPORT6 载体</td></tr><tr><td>人 FKBP52 的 cDNA 克隆</td><td>Source BioScience</td><td>克隆编号：7474554</td><td>pCMV-SPORT6 载体</td></tr><tr><td>化学感受态 E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C602003</td><td>One Shot BL21 Star (DE3)</td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>GraphPad Prism</td><td>9.0.0</td><td>分析数据并制图</td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Excel</td><td></td><td>分析数据</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Supelco</td><td>1.02952.1000</td><td>稀释化合物</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>配制溶液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Calbiochem</td><td>344504</td><td>超声过程中防止蛋白降解</td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma</td><td>G-4251</td><td>洗脱 GST 标签蛋白</td></tr><tr><td>谷胱甘肽供体微珠</td><td>Perkin Elmer</td><td>6765300</td><td>供体微珠</td></tr><tr><td>GST-trap 柱</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>17528201</td><td>纯化 GST 标签蛋白</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0392</td><td>诱导蛋白表达</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller）</td><td>Sigma</td><td>L3522</td><td>微生物培养基</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>BIO-RAD</td><td>S1000 Thermal Cycler</td><td>扩增/PCR</td></tr><tr><td>PD-10 柱</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>17085101</td><td>溶液置换</td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 载体</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>28954648</td><td>质粒</td></tr><tr><td>pGEX-6P-2 载体</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>28954650</td><td>质粒</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Perkin Elmer</td><td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td><td>读取 Alpha 检测板</td></tr><tr><td>酶标仪软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>EnSpire Manager</td><td>酶标仪软件</td></tr><tr><td>酶标仪软件程序</td><td>Perkin Elmer</td><td>Alpha 384-well Low volume</td><td>使用该程序读取检测板</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>超声过程中防止蛋白降解</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td>超声过程中防止蛋白降解</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>用作防腐剂</td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠 (NaBH3CN)</td><td>Sigma</td><td>156159</td><td>活化基质用于偶联</td></tr><tr><td>对应人 Hsp90 β 亚型第 714-724 位氨基酸的十肽 NH2-EDASRMEEVD-COOH</td><td>Peptide 2.0 inc</td><td></td><td>合成 Hsp90 C 末端肽</td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td>LABINCO</td><td></td><td>实现翻转式振荡</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td>封闭受体微珠上的未反应位点</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>防止微珠聚集</td></tr><tr><td>超速离心机 Avanti J-20 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>离心收集细菌细胞沉淀</td></tr><tr><td>超声细胞破碎仪</td><td>Microson</td><td></td><td>超声破碎细胞以释放蛋白</td></tr><tr><td>未偶联受体微珠</td><td>Perkin Elmer</td><td>6762003</td><td>受体微珠</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell 和 XCell II 转印模块</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

靶向热休克蛋白90（Hsp90）与共伴侣蛋白之间的相互作用，为特异性调控依赖Hsp90的细胞内过程提供了可能。Hsp90 C末端保守的MEEVD五肽是其与共伴侣蛋白中四肽重复（TPR）结构域相互作用的关键区域。FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是两种结构相似但功能不同的含TPR结构域的共伴侣蛋白，参与类固醇激素相关疾病的发生发展。因此，发现能够特异性阻断Hsp90与FKBP51或FKBP52相互作用的小分子化合物，为多种人类疾病的治疗提供了有前景的策略。本文描述了一种放大发光 proximity 均相检测方法的实验方案，用于检测Hsp90与其伴侣蛋白FKBP51和FKBP52之间的相互作用。首先，我们纯化了带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的含TPR结构域的FKBP51和FKBP52蛋白。利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠捕获GST融合的TPR结构域蛋白，并使用与Hsp90 C末端10个氨基酸肽段偶联的受体微珠，在均相体系中检测蛋白质-蛋白质相互作用。我们应用该检测方法筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并成功鉴定出高效且具有选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。

在我们的检测中，Z' 因子和 S/B 比值分别为 0.82 和 13.35（图3A)，表明我们的检测方法稳定可靠，适用于高通量筛选。随后，我们利用该方法对小分子量化合物进行了筛选。 图3B 呈现小分子（D10）对分子伴侣-共伴侣相互作用的剂量依赖性抑制。D10 的剂量-反应曲线通过非线性回归分析生成，并据此计算 IC50 计算得出。D10 对 Hsp90 - GST-FKBP51 和 Hsp90 - GST-FKBP52 蛋白相互作用均表现出剂量依赖性抑制，但其 IC50 是不同的：其IC50 Hsp90与GST-FKBP51相互作用的IC50为65 nM，而Hsp90与GST-FKBP52相互作用在最高化合物浓度下也未达到完全抑制100 µM），其IC50 估计为 &gt; 30 µM这些结果表明，利用小分子选择性抑制Hsp90-HKBP51或Hsp90-FKBP52蛋白-蛋白相互作用是可行的（FKBP51和FKBP52的TPR结...

本方案介绍了一种利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠和GST融合的TPR基序共伴侣蛋白，以及与Hsp90来源肽段偶联的受体微珠来检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。我们已应用该技术筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并鉴定出高效且选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。

靶向热休克蛋白90（Hsp90）与共伴侣蛋白的相互作用，为特异性调控Hsp90依赖性细胞内过程提供了可能……

我们建立了一种基于均相微球的检测方法，用于研究分子伴侣与共伴侣之间的相互作用。利用该技术，我们筛选了可抑制Hsp90与FKBP51或FKBP52之间相互作用的小分子，并鉴定出高效且具有选择性的抑制剂。该高通量筛选技术稳定可靠。结果可在一小时内获得，且仅需少量珠蛋白和化合物。Hsp90 与这些共伴侣蛋白的相互作用与多种人类疾病相关，例如阿尔茨海默病、癌症、自身免疫性疾病。该技术为筛选具有重要医学意义的伴侣蛋白-共伴侣蛋白抑制剂提供了可能。该检测方法的基本原理如下：当Hsp90 C端肽段与共伴侣蛋白的TPR结构域之间的相互作用使供体微珠和受体微珠彼此靠近时，会产生高度放大的信号。当加入相互作用抑制剂后，供体微珠和受体微珠无法接近，因而不会产生可检测的信号。首先将Hsp90肽用PBS稀释至1毫克/毫升的浓度。将未偶联的受体珠用PBS稀释后，转移至1.5毫升离心管中。离心稀释后的珠子以进行洗涤，然后小心移除上清液。进行偶联时，将受体珠与肽按10:1的比例混合。向包被肽的珠中加入磷酸盐缓冲液稀释的肽、Tween 20和氰基硼氢化钠溶液，并在旋转摇床上以翻转振荡方式孵育。为封闭未反应位点，向珠中加入20微升1摩尔pH 8.0的盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）溶液，并在37摄氏度孵育1小时以终止反应。孵育结束后，通过离心洗涤磁珠，并将磁珠沉淀重悬于1毫升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中。重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于储存缓冲液中，浓度为每毫升1毫克，并将偶联的受体磁珠溶液置于4摄氏度避光保存。在 PBS 中加入谷胱甘肽供体珠，终浓度为每毫升 10 微克。加入 GSTFKBP51 至终浓度为每毫升 10 微克，并在 25 摄氏度避光孵育反应 10 分钟。用 DMSO 对待测化合物进行系列稀释。向384孔板每个孔的角落加入0.25 µL测试化合物稀释液，并设三个复孔。阴性对照孔中加入0.25 µL DMSO，阳性对照孔中加入0.25 µL Hsp90 C端肽。向每孔加入22.5 µL含有谷胱甘肽供体珠和GST标记蛋白的溶液。用手充分振荡酶标板，然后在25摄氏度避光孵育15分钟。将受体珠与附带的Hsp90C端肽混合，用0.5倍PBS稀释至浓度为100微克/毫升。向每孔加入2.25微升稀释后的受体珠溶液。按照所示方法，将酶标板在避光条件下振荡并孵育15分钟。打开酶标仪，测量酶标板的信号，并按照文本稿件中的描述分析数据。在欢迎对话框中创建一个X-Y数据表，选择X为数值，Y为数据，并在并列的各列中输入三个重复值。将浓度值导入 X 列，将信号值导入 Y 列。点击“分析”，选择“转换浓度 X”，然后选择“转换为对数”。点击“分析”，在 X-Y 分析中选择非线性回归。打开剂量-反应抑制选项，选择“对数剂量与反应变量斜率”方程。点击确定，查看包含IC50值及图表的结果。该实验用于筛选能够抑制Hsp90与FKBP51或FKBP52之间相互作用的小分子化合物。Z 值大于 0.8 且信号与背景比为 13.35，表明该方法适用于高通量筛选，具有良好的稳健性和可靠性。评估了小分子量测试化合物 D10 对分子伴侣-共伴侣相互作用的抑制作用，并计算了 IC50 值，结果显示 D10 呈剂量依赖性抑制。D10 对 Hsp90-GST-FKBP51 相互作用的 IC50 值为 65 纳摩尔。对于Hsp90与GSTFKBP52的相互作用，即使在最高化合物浓度下也未实现完全抑制，这表明利用小分子选择性抑制蛋白质-蛋白质相互作用是可行的。关键步骤在于添加顺序：我们首先让小分子与其TPR靶标形成复合物。否则需要更长的孵育时间以及更高的化合物浓度。我们可以利用该技术筛选能够破坏Hsp90与FKB51或Hsp90与FKB52之间相互作用的小分子。该方法还可拓展应用于筛选针对Hsp90、Hsp70与含TPR模体的共伴侣蛋白之间相互作用的特异性抑制剂。

studies-chaperone-cochaperone-interactions-using-homogenous-bead

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究

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增强型发光均相邻近分析：一种基于微珠的邻近分析方法用于筛选抑制蛋白质-蛋白质相互作用的小分子

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利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

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体外利用分析、下拉及分子伴侣实验对组蛋白伴侣蛋白的表征

本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.

细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

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绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

学习使用同质珠检测技术研究Hsp90与FKBP51或FKBP52的分子伴侣相互作用，通过高通量筛选快速鉴定小分子抑制剂，为阿尔茨海默病和癌症等疾病的治疗研究提供可靠方法。

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