使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

我们建立了一种基于均相微球的检测方法，用于研究分子伴侣与共伴侣之间的相互作用。利用该技术，我们筛选了可抑制Hsp90与FKBP51或FKBP52之间相互作用的小分子，并鉴定出高效且具有选择性的抑制剂。该高通量筛选技术稳定可靠。

结果可在一小时内获得，且仅需少量珠蛋白和化合物。Hsp90 与这些共伴侣蛋白的相互作用与多种人类疾病相关，例如阿尔茨海默病、癌症、自身免疫性疾病。该技术为筛选具有重要医学意义的伴侣蛋白-共伴侣蛋白抑制剂提供了可能。

该检测方法的基本原理如下：当Hsp90 C端肽段与共伴侣蛋白的TPR结构域之间的相互作用使供体微珠和受体微珠彼此靠近时，会产生高度放大的信号。当加入相互作用抑制剂后，供体微珠和受体微珠无法接近，因而不会产生可检测的信号。

首先将Hsp90肽用PBS稀释至1毫克/毫升的浓度。将未偶联的受体珠用PBS稀释后，转移至1.5毫升离心管中。离心稀释后的珠子以进行洗涤，然后小心移除上清液。

进行偶联时，将受体珠与肽按10:1的比例混合。向包被肽的珠中加入磷酸盐缓冲液稀释的肽、Tween 20和氰基硼氢化钠溶液，并在旋转摇床上以翻转振荡方式孵育。为封闭未反应位点，向珠中加入20微升1摩尔pH 8.0的盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）溶液，并在37摄氏度孵育1小时以终止反应。

孵育结束后，通过离心洗涤磁珠，并将磁珠沉淀重悬于1毫升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中。重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于储存缓冲液中，浓度为每毫升1毫克，并将偶联的受体磁珠溶液置于4摄氏度避光保存。

在 PBS 中加入谷胱甘肽供体珠，终浓度为每毫升 10 微克。加入 GSTFKBP51 至终浓度为每毫升 10 微克，并在 25 摄氏度避光孵育反应 10 分钟。用 DMSO 对待测化合物进行系列稀释。

向384孔板每个孔的角落加入0.25 µL测试化合物稀释液，并设三个复孔。阴性对照孔中加入0.25 µL DMSO，阳性对照孔中加入0.25 µL Hsp90 C端肽。向每孔加入22.5 µL含有谷胱甘肽供体珠和GST标记蛋白的溶液。

用手充分振荡酶标板，然后在25摄氏度避光孵育15分钟。将受体珠与附带的Hsp90C端肽混合，用0.5倍PBS稀释至浓度为100微克/毫升。向每孔加入2.25微升稀释后的受体珠溶液。

按照所示方法，将酶标板在避光条件下振荡并孵育15分钟。打开酶标仪，测量酶标板的信号，并按照文本稿件中的描述分析数据。在欢迎对话框中创建一个X-Y数据表，选择X为数值，Y为数据，并在并列的各列中输入三个重复值。

将浓度值导入 X 列，将信号值导入 Y 列。点击“分析”，选择“转换浓度 X”，然后选择“转换为对数”。点击“分析”，在 X-Y 分析中选择非线性回归。

打开剂量-反应抑制选项，选择“对数剂量与反应变量斜率”方程。点击确定，查看包含IC50值及图表的结果。该实验用于筛选能够抑制Hsp90与FKBP51或FKBP52之间相互作用的小分子化合物。

Z 值大于 0.8 且信号与背景比为 13.35，表明该方法适用于高通量筛选，具有良好的稳健性和可靠性。评估了小分子量测试化合物 D10 对分子伴侣-共伴侣相互作用的抑制作用，并计算了 IC50 值，结果显示 D10 呈剂量依赖性抑制。D10 对 Hsp90-GST-FKBP51 相互作用的 IC50 值为 65 纳摩尔。

对于Hsp90与GSTFKBP52的相互作用，即使在最高化合物浓度下也未实现完全抑制，这表明利用小分子选择性抑制蛋白质-蛋白质相互作用是可行的。关键步骤在于添加顺序：我们首先让小分子与其TPR靶标形成复合物。

否则需要更长的孵育时间以及更高的化合物浓度。我们可以利用该技术筛选能够破坏Hsp90与FKB51或Hsp90与FKB52之间相互作用的小分子。该方法还可拓展应用于筛选针对Hsp90、Hsp70与含TPR模体的共伴侣蛋白之间相互作用的特异性抑制剂。