使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究
2021年7月21日
该协议提出了一种利用谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 共同伴奏和接受珠以及 Hsp90 衍生肽来探索蛋白质- 蛋白质相互作用的技术。我们使用此技术筛选小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。
我们建立了一个同质的基于珠子的检测来研究伴奏-科查佩龙的相互作用。使用此技术，我们筛选抑制 Hsp90 和 FKDP51 或 FKBP52 之间相互作用的小分子，并识别有效和选择性的抑制剂。这种高通量筛选技术是强大和可靠的。
结果可以在一小时内获得，它只需要少量的珠子蛋白和化合物。Hsp90 与这种共茶酮的相互作用与人类疾病有关， 如阿尔茨海默氏症， 癌症， 自身免疫性疾病.该技术提供了筛选具有高度医学重要性的伴郎-可可酮抑制剂的机会。
以下是此检测的基本原则。当 Hsp90C-终端肽和可可酮 TPR 域之间的相互作用使供体和接受者珠子接近时，就会生成高度放大的信号。添加相互作用抑制剂时，供体和接受珠无法接近，也不会产生可检测信号。
首先以每毫升浓度一毫克稀释PBS中的Hsp90肽。稀释 PBS 中未合并的接受珠，并将珠子转移到 1.5 毫升管中。将稀释的珠子离心清洗，然后小心地取出超高那。
对于结合，将接受珠设定为肽中的接受珠，比例为 10 比 1。对PBS稀释肽、Tween 20和氰化钠溶液中的古肽珠，在旋转摇床上孵育末端搅拌。为了阻挡未激活的部位，在珠子中加入20微升pH 8.0的盐酸摩尔三酯溶液，并在37摄氏度下孵育一小时，以抑制反应。
在孵化结束时，通过离心清洗珠子，并将珠粒重新悬浮在一毫升盐酸三酯溶液中。再重复洗两次。最后一次洗涤后，将珠子以每毫升浓度一毫克重新悬挂在存储缓冲器中，并将结合的接受珠溶液存放在 4 摄氏度的光线下。
在 PBS 中加入谷胱甘肽捐赠者珠，每毫升浓度为 10 微克。将 GSTFKBP51 添加到每毫升 10 微克的最终浓度中，并在黑暗中在 25 摄氏度下孵育反应 10 分钟。对 DMSO 中的测试化合物进行串行稀释。
在 384 井板的每口井的一角加入 0.25 微升的测试复合稀释剂和三重。对于负控制，在井中加入0.25微升DMSO和正控制，在井中加入0.25微升Hsp90 C-终端肽。在每口油井中加入含有谷胱甘肽供体珠的22.5微升含有GST标记蛋白的溶液。
用手彻底摇动盘子，在25摄氏度的黑暗中孵育15分钟。将附着的 Hsp90C-终端肽稀释接收珠，每毫升浓度为 100 微克，是 PBS 的 0.5 倍。在每口井中加入2.25微升稀释的接受珠。
如前所示，在黑暗中摇动并孵育盘子15分钟。打开板读取器仪器，测量板的信号并分析文本手稿中描述的数据。在欢迎对话中创建 X-Y 数据表，选择 X 数字、Y 并在并排列中输入三个复制值。
将浓度值导入 X 列，将信号值导入 Y 列。单击分析，选择转换浓度 X，然后选择转换为对数。单击 X-Y 分析下的单击分析并选择非线性回归。
打开剂量响应抑制选项，选择日志与响应可变坡度方程。单击"可以"查看包含 IC50 值和图形的结果。此检测用于筛选小分子，抑制 Hsp90 和 FKBP51 或 FKBP52 之间的相互作用。
Z 分数超过 0.8，信号与背景比为 13.35，显示了高吞吐量筛选的稳健性和可靠性。小分子量测试化合物D10对伴奏-协茶酮相互作用的抑制作用进行了评估，并计算了IC50值，其中D10显示剂量依赖抑制。Hsp90 GSTFKBP51 相互作用的 IC50 值为 65 纳米摩尔。
而对于Hsp90，GSTFKBP52相互作用，完全抑制没有达到最高的化合物浓度表明，蛋白质与小分子相互作用的选择性抑制可以实现。关键步骤是添加顺序。我们首先在小分子和TPR目标之间形成一个复合体。
否则需要更长的孵化和更高的复合浓度。我们可以使用这种技术来筛选破坏Hsp90和FKB51或Hsp90和FKB52之间的相互作用的小分子。它也可以扩展到 Hsp90， Hsp70 和包含可可龙筛选选择性抑制剂的 TPR 主题之间的任何相互作用。
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概述
本协议描述了一种基于均质珠的检测方法，用于研究伴侣蛋白-辅伴侣蛋白的相互作用，特别是Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用。该技术允许对小分子进行高通量筛选，以识别这些相互作用的有效抑制剂，这些相互作用与各种人类疾病相关。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 药理学
背景
- Hsp90是一种伴侣蛋白，参与折叠其他蛋白质。
- FKBP51和FKBP52是与Hsp90相互作用的辅伴侣蛋白。
- 破坏这些相互作用可能具有治疗意义。
- 这些相互作用与阿尔茨海默病、癌症和自身免疫疾病等疾病有关。
研究目的
- 开发一种可靠的检测方法，用于筛选Hsp90-辅伴侣蛋白相互作用的抑制剂。
- 识别选择性破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子。
- 提供一种高通量筛选方法，样品需求量最小。
使用的方法
- 使用谷胱甘肽连接的供体珠的均质珠基检测方法。
- GST融合的TPR基序辅伴侣蛋白和带有Hsp90衍生肽的受体珠。
- 小分子的高通量筛选。
- 可在一小时内获得快速结果。
主要结果
- 识别Hsp90-FKBP51相互作用的有效和选择性抑制剂。
- 展示检测方法的稳健性和可靠性。
- 筛选具有高医学相关性的化合物的潜力。
- 结果支持进一步研究其治疗应用。
结论
- 开发的检测方法可有效用于研究伴侣蛋白-辅伴侣蛋白的相互作用。
- 它能够识别具有潜在临床意义的小分子抑制剂。
- 这种技术可以推进与Hsp90相互作用相关疾病的治疗研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Targeting Hsp90-cochaperone interactions enables selective modulation of disease-relevant signaling pathways, offering a precision strategy for therapeutic intervention in oncology, neurodegeneration, and autoimmune disorders. The homogeneous bead-based assay provides a robust, scalable platform for early-stage target validation and lead identification by quantifying protein-protein disruption in a homogeneous environment. This supports mechanistic de-risking and predictive confidence in prioritizing chemical series with selective Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 inhibitory profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Hsp90-FKBP51 and Hsp90-FKBP52 binary interactions to validate target engagement and pathway specificity.
- Operational Value: Requires minimal protein and compound input, supporting early-stage screening with limited material availability.
- Predictive Value: Identifies selective inhibitors (e.g., D10 with 65 nM IC50 for FKBP51) to de-risk off-target effects and improve target hypothesis confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, homogeneous readouts (Z’ > 0.8, S/B = 13.35) suitable for high-throughput screening campaigns.
- Operational Value: Results obtained within one hour, enabling rapid iteration and timely go/no-go decisions in hit-to-lead progression.
- Reproducibility Value: Standardized bead conjugation and blocking steps ensure assay consistency across runs and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports screening for compounds that disrupt Hsp90-cochaperone interactions implicated in Alzheimer’s disease, cancer, and autoimmune disorders.
- Predictive Value: Enables early assessment of target selectivity, aiding in the selection of candidates with favorable mechanistic profiles for preclinical advancement.
- Continuity Value: Assay outputs (IC50, dose response) translate directly into downstream efficacy and safety evaluation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through biochemical confirmation of Hsp90-cochaperone disruption, and enabling lead identification via high-throughput screening of small molecule libraries.
- Discovery Biology: Validates target engagement by measuring disruption of Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions, clarifying mechanism of action.
- Screening: Provides assay readiness with robust Z’ score and signal-to-background ratio, ensuring reliable compound evaluation in 384-well format.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values through nonlinear regression, enabling quantitative comparison of inhibitor potency and selectivity.
- Translational Research: Connects to disease-relevant systems by screening inhibitors of interactions linked to human disorders, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Platform can be extended to other Hsp70/Hsp90-TPR cochaperone interactions, increasing ROI across multiple target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective inhibition of Hsp90-FKBP51 over Hsp90-FKBP52, reducing ambiguity in target modulation.
- Operational Value: Low sample consumption (beads, protein, compounds) and fast time-to-result (<1 hour) increase screening efficiency.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions based on target selectivity, improving capital efficiency and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of chemical series with validated target engagement and selectivity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification (GST-tagged TPR domains) and bead-based assay conjugation chemistry.
- Dependent on access to plate reader capable of luminescence detection and compatible with 384-well formats.
- Necessitates standardization of peptide-bead conjugation ratios (10:1) and blocking conditions (1 M Tris, pH 8.0) for batch-to-batch consistency.
- Adaptation to alternative cochaperones requires re-validation of bead conjugation and interaction kinetics.
- Practical limitation: assay sensitivity may be affected by compound auto-fluorescence or luminescence quenching, requiring orthogonal counterscreening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:28
Coupling of Hsp90 C-Terminal Peptide to the Acceptor Beads
2:49
Assay for Interaction Between GST-FKBP51 or GST-FKBP52 and Hsp90 C-Terminal Peptide and Inhibition with Small Molecular Mass Compounds
4:14
Dose-Response Curve Generation and IC50 Calculation
4:58
Results: Inhibitory Effect of Small Molecular Weight Test Compound D10
5:59
Conclusion
