肌萎缩性侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光测量

这些方法可以快速评估实验操作，致病蛋白或RNA是否可以影响突触过程，以及治疗化合物是否可以恢复功能。与电生理学相比，这些技术在相对较短的时间内提供了一组神经元突触功能的可靠读数。该协议可应用于任何神经元发育或变性疾病。

这适用于原代啮齿动物神经元培养物，以及来自诱导多能干细胞的神经元。首先，使用共聚焦成像采集软件优化图像采集设置。在所有样品中保持激励功率曝光时间、检测器增益和帧速率恒定。

对于延时成像，请选择 512 x 512 的纵横比和每秒两张图像的帧速率，以最大程度地减少染料漂白。然后选择荧光激发，二向色性和发射滤光片组合，用于GCaMP六M / GCaMP三与Fitzy和硬脂酰染料与Trixi。为避免延时成像过程中的Z漂移，请使用共聚焦成像采集软件的完美对焦功能。

接下来，在图像采集面板中选择时间选项卡。对于第一阶段，将间隔设置为 500 毫秒，持续时间为 3 到 5 分钟。对于第二阶段，将间隔设置为500毫秒，持续时间为5分钟。

然后组装用于人工脑脊液或ACSF的重力灌注装置，将高氯化钾ACSF缓冲液装入装置顶部的50毫升注射器中，并将流速设置为每分钟一毫升。然后，将含有神经元的35毫升玻璃培养皿加载到共聚焦成像台上，并将灌注管的末端放置在培养皿边缘并选择成像场。转染后48小时，将原发性皮质或运动神经元在低氯化钾ACSF缓冲液中孵育10分钟，温度为37摄氏度。

然后通过抽吸并使用移液管除去缓冲液，将黑暗中的神经元加载到充满ACSF的玻璃底培养皿中，其中含有50毫摩尔氯化钾和10微摩尔苯乙烯染料。五分钟后，取出上样溶液，并将神经元在37摄氏度的低氯化钾ACSF缓冲液中浸泡10分钟，以消除非特异性染料上样。然后将培养皿置于倒置共聚焦显微镜的成像台上，并在20倍空气物镜或40倍油浸物镜下观察细胞。

使用546纳米激光激发钢染料，并使用570至620纳米带通滤光片收集发射。选择成像场并进行完美对焦后，拍摄具有明场，Trixi和荧光标记通道的单个静止图像，以标记神经元边界。然后在采集软件中启动"立即运行"，并进行基础记录三到五分钟，以排除染料强度的变化。

在切换到第二阶段时，触发灌注系统的开启按钮，并不断将50毫摩尔氯化钾灌注到神经元，以促进染料卸载。进行五分钟的录音，然后触发灌注系统的关闭开关。保存实验，以便以后使用共聚焦软件进行数据分析。

用GCaMP转染6 M后48小时，用低氯化钾ACSF孵育原代啮齿动物皮质神经元15分钟。然后将培养皿安装在成像平台上，并使用Fitzy滤光片和20次或40倍物镜可视化GCaMP六M荧光。选择成像场并进行完美对焦后，拍摄具有明场，Fitzy和荧光标记通道的单个静止图像以标记神经元边界。

接下来，在采集软件中启动"立即运行"，并进行三到五分钟的基础记录。然后如前所述将含有50毫摩尔氯化钾的ACSF灌注到神经元中并记录五分钟。当图像采集停止时，保存实验并使用共聚焦软件进行数据分析。

对于图像分析，请在共聚焦软件中打开延时图像，然后单击"图像"对齐图像，然后进行处理，然后对齐当前文档，然后选择"对齐到第一帧"来对齐图像。使用ROI选择工具沿神经突选择感兴趣的区域，并标记表示背景荧光强度的ROI。接下来，从时间测量面板启动测量功能，以测量所选投资回报率随时间变化的原始荧光。

测量后，将原始荧光强度导出到电子表格软件。这里显示了用苯乙烯基染料加载的大鼠初级皮质神经元。染料上样量的特异性是通过与突触囊泡标记突触蛋白共标记来确定的，并且大多数无菌染料阳性点数对该标记物具有共阳性。

对整个成像期间原始强度值的分析表明，突触素和强度保持不变，而苯乙烯染料强度在刺激后降低。对于绿色荧光蛋白转染的对照神经元，突触囊泡的成功释放导致高氯化钾去极化时染料荧光的显着损失。这个具有代表性的视频显示，神经元在刺激后选择性地在新的右侧区域卸载苯乙烯染料。

相反，在转染有C九ORF 72的神经元中，与染料肽重复构建体相连接的GA 50，突触传递受损，即使在高氯化钾去极化后，染色体荧光仍保留。这里显示了氯化钾去极化之前和之后转染了GCaMP 6 M的皮质神经元的代表性荧光图像。荧光值增加，转染GCaMP 6 M的皮质神经元表明氯化钾诱导去极化后钙进入神经突起。

在基线记录期结束时，神经元以低荧光表达GCaMP 6 M。然后在刺激开始时观察到显着的荧光增加。确保苯乙烯基染料和GCaMP的荧光基线记录稳定。

始终使用完美对焦以避免图像漂移，这将使后期图像数据处理具有挑战性。不建议进一步培养神经元，因为培养皿在大量进一步播过程中暴露在空气中。然而，免疫染色或提取蛋白质或RNA可以评估突触改变的潜在原因。