Name: 生物发光光遗传学2.0:利用生物发光在体外和体内激活光敏蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习生物发光光遗传学技术，利用荧光素酶和荧光素在体外和体内精确调控细胞功能。该方法无需外部光源即可实现非侵入性光刺激，适用于多种实验设计。

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感谢我们的同事提供了以下质粒：A. Ting 提供了 Ca-FLARE 蛋白酶、转录因子和报告基因（Addgene # 92214、92213、92202）；H. Kwon 提供了 TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 和 NES-CRY2PHR-TevC（Addgene # 89878、89877）；C. Tucker 提供了 CRY-GalΔDD（B1013）和 CIB-VP64（B1016）（Addgene # 92035、92037）；M. Walsh 提供了 pGL2-GAL4-UAS-Luc（Addgene #33020）；K. Gardner 提供了 VP-EL222 和 C120-Fluc；A. Cetin 和 H. Zeng 在发表前提供了 iCreV。本研究获得了美国国家科学基金会（NSF，NeuroNex 1707352）、美国国立卫生研究院（NIH，U01NS099709）、W.M. Keck 基金会以及瑞典研究理事会（A.B.，2016-06760）的资助。

本研究中的所有操作均按照密歇根州中央密歇根大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物操作规程进行。
1. 生物发光激活光感受蛋白 体外
<ol>
	<li>构建体
	<ol>
		<li>选择一种荧光素酶序列或荧光素酶-荧光蛋白融合序列，使其表达的发光分子所产生的光的波长与待激活的光感受器相匹配。 
		注意：例如，蓝光发射型荧光素酶，如 Gaussia 荧光素酶变体或NanoLuc可与感蓝光的光感受器（如CRY/Ca）配对使用2+- 以及整合素结合蛋白（CIB）、LOV 或 Vivid（VVD）。</li>
		<li>若其他研究人员或质粒保藏库中尚无该质粒，可采用标准的分子生物学技术将DNA克隆至哺乳动物表达质粒中。 
		注意：启动子的选择取决于需要为发光模块提供强效且组成型的表达，例如 CAG 和 CMV 启动子所提供的表达。</li>
		<li>在初步研究中，使用单独的质粒共转染发光元件和光感应元件。根据需要及后续研究，构建两个组分的融合蛋白。</li>
		<li>根据制造商的说明书，使用质粒小提、中提或大提试剂盒制备高质量的质粒DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养与转染 
	注意：本方案中以 HeLa 细胞和 HEK293 细胞为例。
	<ol>
		<li>根据预期的最终用途，以相应的规格和数量接种细胞。 
		注意：文中给出了具体示例 表2铺板时的细胞密度将决定细胞转染所需的时间。
		<ol>
			<li>为通过荧光显微镜评估生物发光激活的转录，将HEK293细胞接种于置于24孔板中的多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的12 mm盖玻片上。</li>
			<li>为通过使用发光仪测量正交报告荧光素酶的发光来评估生物发光激活的转录，最初将HeLa细胞接种于6孔或12孔板中用于转染，但在转染后需重新铺板（见步骤4）。</li>
			<li>如果将在活细胞成像腔室中进行重复的生物发光刺激，请选择合适尺寸的盖玻片并将其放入相应尺寸的多孔板中（12 mm盖玻片使用24孔板；15 mm和18 mm盖玻片使用12孔板）。按照指定的细胞数量将细胞接种于盖玻片表面 表2如果所选细胞类型在培养表面贴壁效果不佳，应将细胞接种于PDL包被的培养皿中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据制造商的建议通过脂质体转染法进行转染，或选用适合所选细胞类型的任何其他转染方法。 
		注意： 表3 详细介绍了两种不同光感受器EL222和CRY2/CIB及其相应报告质粒的转染实验，此外还包括不同的发光蛋白。各种质粒的比例在所选示例中效果良好，但需针对每种发光蛋白/光感受器配对进行优化。</li>
		<li>转染后，将细胞置于完全避光的培养箱中（图1).</li>
		<li>根据预期的最终用途，可在转染后第二天于原始孔/培养皿中直接对细胞进行生物发光刺激，或在脂质体转染后3-4小时将细胞重新接种。若需使用化学发光仪检测海肾荧光素酶报告基因的转录水平，请将细胞重铺于白色96孔板中。 
		注意：所有操作均须在避光室内进行，并在红光照明的层流罩中完成图2).
		<ol>
			<li>用杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤转染细胞一次。</li>
			<li>向孔中加入最小体积的消化试剂（24孔板：100 µL；12孔板：150 µL；6孔板：300 µL），于37 °C孵育3分钟。</li>
			<li>加入培养基，调整细胞浓度，以获得适合下一步铺板的细胞密度（例如，将转染后来自24孔板的细胞重悬于终体积1.2 mL培养基中，用于接种至96孔板的10个孔；将来自12孔板的细胞重悬于终体积2.4 mL培养基中，用于接种至96孔板的20个孔）。根据最终所需的孔数，合并多个孔中的转染细胞。</li>
			<li>将转染后的细胞以最终所需格式接种，并将培养板放回避光培养箱中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物发光激活 体外
	<ol>
		<li>制备荧光素酶底物（荧光素）。
		<ol>
			<li>通过将5 mg冻干腔肠素（CTZ）溶解于250 µL专用溶剂中，配制50 mM的储存液。使用移液或涡旋确保小瓶壁上的所有CTZ完全溶解。避免小瓶暴露于直射光下。</li>
			<li>在0.5 mL黑色微量离心管中分装成50 µL每份，于-80 °C保存以备后续使用。 
			注意：CTZ 溶于溶剂后在 -80 °C 下不会冻结。只要尽量减少光照和室温暴露，可多次从超低温冰箱中取出和放回分装样品，用于配制工作液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单次生物发光光刺激 
		注意：所有操作均在红光照明的层流罩内的避光环境中进行（图2).
		<ol>
			<li>在细胞培养基（DMEM 或 NeuroBasal）中配制荧光素的工作液，调整荧光素浓度，使终浓度为 100 µM。在即将加入细胞前，用培养基新鲜配制所有浓度的 CTZ 溶液，因为 CTZ 会随时间发生氧化。 
			注意：如果完全更换培养基，则工作液浓度为 100 µM。如果将含荧光素的培养基添加到细胞中，则终浓度将根据稀释倍数相应提高（例如，将 50 µL 含 300 µM 荧光素的培养基加入到孔中已有的 100 µL 培养基中，稀释倍数为 1:3，因此荧光素的终浓度为 100 µM）。</li>
			<li>向细胞中加入含荧光素的培养基，并孵育所需时长的光刺激。 
			注意：时间可短至1分钟，长至15分钟，甚至更短或更长。荧光素酶-荧光素组合的半衰期和动力学特性决定了含荧光素培养基作用于细胞的时间长短。</li>
			<li>在红光关闭后，通过肉眼观察终浓度为100 µM的荧光素酶底物条件下的发光情况；等待数秒，直至眼睛适应完全黑暗环境。通过拍照记录发光现象（即使使用手机拍摄亦可）。</li>
			<li>通过移除含荧光素的培养基并替换为普通培养基来终止光照刺激。根据实验的敏感程度，在移除含荧光素的培养基后，可用培养基洗涤细胞一至两次，以彻底清除残留的荧光素。若细胞在培养表面贴壁不牢，可将其接种于多聚赖氨酸（PDL）包被的培养皿中，以避免洗涤过程中细胞脱落。</li>
			<li>将细胞放回避光的培养箱中孵育16-24小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重复的生物发光光刺激 
		注意：所有操作均在可避光并以红光照明的房间内进行。
		<ol>
			<li>设置活细胞成像室。使用盒子和黑色塑料板或黑色遮光布在活细胞成像显微镜周围构建一个避光的密闭空间。图3). 遮蔽光密室内部及房间内所有存在的光源（例如显微镜或仪器上的LED指示灯）。</li>
			<li>将灌流系统的进液端连接至所需溶液，出液端通向废液容器。 
			注意：例如，成像溶液可以是Tyrode's溶液（氯化钠（124 mM）、氯化钾（3 mM）、HEPES（10 mM）、二水氯化钙（2 mM）、六水氯化镁（1 mM）、D-葡萄糖（20 mM））。</li>
			<li>在成像溶液中配制荧光素的工作液。根据重复刺激的次数，分装至相应数量的微量离心管中。调整荧光素浓度，使成像室中的终浓度为 100 µM。</li>
			<li>将转染细胞的盖玻片放入培养腔中。</li>
			<li>在保持泵运行的同时，将泵的进液管从进液烧杯中取出，并迅速浸入荧光素溶液中，尽量缩短转移时间，以避免管路中产生任何气泡。</li>
			<li>一旦荧光素溶液被完全吸入，即将进样管放回进样烧杯中。根据细胞所需暴露的生理模式，每隔数分钟至数小时重复此过程，直至达到所需次数。</li>
			<li>将细胞放回避光培养箱中孵育16-24小时以进行转录，或根据需要评估光刺激效应的时间长度进行孵育。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 光敏蛋白的生物发光激活 体内
<ol>
	<li>构建体
	<ol>
		<li>选择一种荧光素酶序列或荧光素酶-荧光蛋白融合序列，使其表达的发光物质所产生的光的波长与待激活的光感受器相匹配。</li>
		<li>若无法从其他研究者或质粒库中获得，可采用标准的分子生物学技术将DNA克隆至pAAV质粒中。</li>
		<li>为发光模块的表达选择强启动子，例如 CAG 或 CMV。</li>
		<li>使用标准方法制备高滴度病毒储备液6 或使用商业制备的病毒载体。</li>
		<li>在初步研究中，应使用不同的病毒载体分别进行光发射器和光传感器的共转导，以便在需要时调整各组分之间的比例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AAV 转导
	<ol>
		<li>向实验动物的目标器官注射光发射体、光感受器和报告基因的病毒载体，其浓度比例参照用于 体外 转染（表3).</li>
		<li>将动物放回其饲养笼中至少2周，以确保所有组分得到充分表达。 
		注意：如果靶器官位于体内且不受环境光影响，动物可饲养在正常光照条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物发光激活 体内
	<ol>
		<li>制备荧光素酶底物（荧光素）。
		<ol>
			<li>从-80 °C冰箱中取出一管水溶性CTZ，置于室温下使其升温。避光保存。</li>
			<li>每500 µg小瓶，加入250 µL无菌水，可使用注射器，或打开小瓶后用移液器加水，再将橡胶塞重新盖回玻璃小瓶上。</li>
			<li>将重组后的玻璃小瓶置于55 °C水浴中孵育数分钟，以彻底溶解粉末。</li>
			<li>将溶液转移至黑色微量离心管中。冲洗玻璃小瓶内壁，以回收全部CTZ。</li>
			<li>移取当日所需量的溶液。将剩余溶液于4 °C保存，供次日使用。切勿冷冻！</li>
			<li>对一份载体样品执行相同的步骤（2.3.1.1–2.3.1.5）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生物发光光刺激
		<ol>
			<li>根据所选动物大小和给药途径，移取所需体积的荧光素酶底物/载体溶剂表4).</li>
			<li>向动物注射荧光素或对照溶剂。根据实验设计重复进行生物发光光刺激。例如，若需在特定行为范式期间激活重组酶，则在行为学检测前立即对动物进行注射；若目标是实现某分子的时相性转录，则需在数天内对动物进行多次注射。</li>
			<li>按照设计收集经生物发光刺激的动物的数据。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+%28and+using%29+the+light%3A+Recent+developments+in+bioluminescence+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li>
<li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

存在一系列荧光素酶和荧光素，其发光波长可覆盖从蓝光到红光的光敏蛋白激活光谱范围14,29除了校准发射波长和激发波长外，没有可靠的方法来确定 先验的 因此，需要通过实验确定荧光素-荧光素酶配对在细胞和生物体中驱动光感受系统的效果。
本演示文稿中概述的方案描述了如何制备荧光素以及如何使用它 体外 和 体内，以及利用生物发光进行实验时设置实验房间、组织培养罩、培养箱和显微镜的指导规范。在代表性实验中，使用了不同的荧光素酶（NanoLuc， Gaussia 荧光素酶）与多种光感受蛋白（CRY/CIB、EL222、VVD、LOV）联用，展示了生物发光与物理光照、共转染与融合蛋白、信噪比比较以及不同检测方法的效果。多个研究团队已在发表文献中描述了生物发光激活光感受蛋白的更多应用，除转录调控外，还包括诱导细胞死亡、cAMP合成以及蛋白质转运等过程表1).
简单地共转染发光组分和感光组分是一个良好的起点。变量包括发光体与传感器的摩尔比；未知因素则包括黑暗条件下传感器活性的本底水平、传感器活性与光强及光照时间的关系，以及在比较物理光与生物光时传感器激活的效率。虽然融合构建体具有保持发光体与传感器摩尔比为1:1，并将发光元件靠近感光结构域的优势，但还需考虑其他因素，例如锚定位点的选择（N端或C端）、连接方式（连接子的长度和组成），同时需确保不影响光感受效应分子的功能表现。
对于实验而言，两者均 体外 和 体内，可通过改变荧光素的浓度和/或改变荧光素对相应传感器的供给时间，实现对生物发光光发射的多种调控方式。最低用量和作用时间由光激活所预期效应的有无来确定；相反，相应的最大值主要取决于细胞对长时间高浓度荧光素的耐受能力。上述示例中选用的CTZ浓度（100 µM）已接近多种细胞类型的耐受上限，包括HEK293细胞和神经元。理想目标是以尽可能低的浓度和尽可能短的时间实现对目标光感应结构域的激活。使用发光强度高的荧光素酶和光敏感性高的光感受器将更易实现这一目标。
利用生物发光驱动光感受蛋白已在表达光敏蛋白的啮齿类动物（小鼠、大鼠）中实现，这些蛋白表达于肝脏、肌肉、脊髓和脑组织中，也可通过皮下或腹腔移植表达光感受蛋白的细胞来实现。理论上，该方法可应用于不同物种，从非人灵长类动物到鱼类或果蝇，无本质限制。根据生物体对荧光素的通透性，其应用可能极为简便，例如将荧光素直接加入周围水中（如鱼 larvae30）。在任何新物种中使用BL-OG之前，必须开展预实验，以确保荧光素能够通过所选给药途径到达靶部位。
实验设计的关键方面包括各种对照，这些对照对于结果的解释至关重要。应将表达由驱动荧光素酶作用于光感受蛋白的报告基因的细胞，与缺乏荧光素酶或缺乏光感受蛋白的细胞进行比较。此外，还应比较暴露于荧光素、载体处理或保持在黑暗条件下的细胞。同时，必须认识到不同检测方法在评估生物发光驱动的光感受器激活效应时的局限性。例如，生物发光激活转录的效率可通过不同方式检测，具体取决于报告基因是正交荧光素酶（使用发光仪或IVIS系统）还是荧光蛋白（使用荧光激活细胞分选或显微镜图像分析）。尽管基本效应应在不同检测平台上可重复，但效应的定量特征可能存在显著差异。
迄今为止，光感受器的生物发光激活仅在少数几种荧光素酶和光感应蛋白中得到证实，两者均 体外 和 体内可将其拓展至光感受器的大家族，以激活更多生物学过程。这一方法的扩展得益于新型荧光素酶及荧光素酶-荧光蛋白配对系统的持续开发，这些系统比天然荧光素酶具有更高的发光强度，且其动力学特性可根据不同应用进行调节。与此同时，新型荧光素的不断开发也进一步提升了发光亮度并丰富了发光颜色谱系29该工具平台可应用于操控和研究活细胞、组织及生物体内的细胞内动态过程和细胞间相互作用。

光敏蛋白可通过物理光源或在底物荧光素存在下由荧光素酶催化产生的生物发光来激活。对于需要毫秒甚至飞秒时间尺度和/或单细胞空间分辨率的应用，只有物理光源（如激光和发光二极管（LED））能够调节至这些尺度。例如，在发育过程中利用光刺激细胞相对两极时，可采用空间受限的光照方式 黑腹果蝇 具有毫秒级时间控制的幼虫1 或对线粒体小管等单个亚细胞结构进行精确刺激2然而，光学开关的许多其他应用具有不同的优先需求，包括实现扩展的空间控制、以非侵入方式重复使用、避免光损伤，同时在分钟级时间尺度上具备精确的时间控制以及可调节的光强度。在此背景下，使用荧光素酶作为激活光感应结构域的替代光源具有多项优势。与光纤光源激活相比，生物发光的光源为基因编码，能够到达目标细胞群体中表达的所有光感应结构域。利用生物发光可避免因光纤和长时间物理光照所引起的组织与细胞损伤问题。通过添加荧光素酶底物即可启动发光，其启动即时发生 体外 和 体内 根据给药途径的不同，效果持续约15-30分钟；通过使用不同的荧光素或对底物进行额外或重复给药，可实现更长时间的存在或光的阶段性刺激3最后，通过改变荧光素的浓度可以调节生物发光的发射强度。
利用生物发光激活离子移动型光感受器（即光遗传学元件），例如通道视紫红质或泵，已有大量研究报道4,5,6,7,8。这种生物发光光遗传学（BL-OG）方法已在小鼠和大鼠的体内实验中得到应用5,6,7,9,10,11,12。研究发现，视蛋白的BL-OG激活需要至少约33 µW/mm2的生物发光强度，且激活效率随光发射强度的增加而提高6,9。离子移动型感觉光感受器是自然界中存在的众多非离子移动型感觉光感受器中的一个亚类13,14。已有报告指出，非离子移动型光感受器（如来自植物或细菌的感光结构域）对光的敏感性显著高于通道视紫红质15,16，这促使人们将生物发光进一步拓展应用于激活此类非离子移动型光感受器，有望实现比现有离子移动型光遗传学元件更高效的光传感器驱动。最近，多项研究报道了利用生物发光作为光源来激活多种光感受器，包括光-氧-电压感光（LOV）结构域、依赖黄素的蓝光感光（BLUF）结构域以及隐花色素（CRYs）3,17,18,19,20,21,22（表1）。由生物发光驱动的光控开关应用已涵盖多种细胞内过程，包括活性氧诱导的细胞死亡、cAMP合成、蛋白质招募与解离、基因组重组以及转录激活等。
本方案概述了由生物发光驱动的光遗传学工具的一般设计，并详细说明了在细胞和生物体中实施生物发光激活的实验操作步骤。内容包括如何设置用于生物发光实验的房间、组织培养超净台、培养箱和显微镜，以及从荧光素的准备到应用的完整操作流程。本方案为研究人员提供了体外（in vitro）和体内（in vivo）开展生物发光光遗传学（BL-OG）研究的基本操作方法。所述方法可进一步拓展并根据不同的实验范式进行个性化调整。我们预期本方案将促进生物发光技术在光遗传学生物学研究中的广泛应用。

<table><tbody><tr><td>ABI 25W 深红 660 nm LED 灯泡</td><td>Amazon</td><td></td><td>可与任意灯架配合使用</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;黑色微量离心管，0.5 mL，Argos Technologies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-166</td><td></td></tr><tr><td>黑色微量离心管，1.5 mL，Argos Technologies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-161</td><td></td></tr><tr><td>黑色尼龙聚氨酯涂层织物（1.5 m × 2.7 m）× 0.12 mm（厚度）</td><td>THOR LABS</td><td>BK-5</td><td></td></tr><tr><td>C120-Fluc</td><td></td><td></td><td>K. Gardner</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C8106; CAS: 10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Ca-FLARE 蛋白酶、转录因子及报告基因</td><td></td><td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td><td>A. Ting</td></tr><tr><td>CIB-VP64 (B1016)</td><td></td><td>Addgene # 92037</td><td>C. Tucker</td></tr><tr><td>CRY-Gal&amp;Delta;DD (B1013)</td><td></td><td>Addgene # 92035</td><td>C. Tucker</td></tr><tr><td>CTZ</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>303</td><td>用于体外 Gaussia 荧光素酶实验的配方</td></tr><tr><td>CTZ（水溶性天然腔肠素）</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>3031</td><td>用于体内 Gaussia 荧光素酶实验的配方</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270; CAS: 50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS，无钙，无镁</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>hCTZ</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>301</td><td>用于体外 Oplophorus 荧光素酶实验的配方</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375; CAS: 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>iCreV</td><td></td><td></td><td>A. Cetin 和 H. Zeng</td></tr><tr><td>活体成像系统（IVIS）</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Lumina LT</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405; CAS: 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>LED 阵列驱动器</td><td>Amuza</td><td>LAD-1</td><td></td></tr><tr><td>多孔板用 LED 阵列</td><td>Amuza</td><td>LEDA-x</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>发光仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 六水合物</td><td>Sigma</td><td>M2670; CAS: 7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653; CAS: 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NanoFuel 溶剂</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>399</td><td>用于溶解供体外使用的 CTZ 制剂</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465; CAS: 1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>NES-CRY2PHR-TevC</td><td></td><td>Addgene # 89877</td><td>H. Kwon</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>转染培养基</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（PDL）包被的盖玻片（12 mm、15 mm、18 mm）</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL</td><td></td></tr><tr><td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td><td></td><td>Addgene #33020</td><td>M. Walsh</td></tr><tr><td>Prizmatix USB 脉冲发生器 TTL 信号发生器（用于光遗传学）</td><td>Goldstone Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td><td></td><td>Addgene # 89878</td><td>H. Kwon</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>载体（不含 CTZ 的水溶性载体）</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>3031C</td><td>体内 CTZ 实验的对照</td></tr><tr><td>VP-EL222</td><td></td><td></td><td>K. Gardner</td></tr></tbody></table>

生物发光光遗传学2.0：利用生物发光激活光感受蛋白 体外 和 体内

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

生物发光——由荧光素酶氧化小分子底物荧光素而产生的光——已被用于体外（in vitro）和体内（in vivo）激活神经元中的光门控离子通道和泵。尽管这种生物发光光遗传学（BL-OG）方法为光遗传学工具引入了化学遗传学组分，但其应用并不局限于神经科学领域。实际上，生物发光可用于激活任何光感受蛋白，从而实现对细胞中多种光介导功能的操控。多种荧光素酶-荧光素组合可与需要不同光波长和光强度的光感受蛋白相匹配。
根据具体应用的不同，可通过使用荧光素酶-光感受器融合蛋白或简单的共转染来实现高效的光传递。基于光依赖性二聚化或构象变化的光感应蛋白可由生物发光驱动，从而调控从蛋白质定位、细胞内信号通路调节到转录等多种细胞过程。以下方案详细描述了在细胞和生物体中实施生物发光激活的实验操作，并展示了利用生物发光驱动的重组酶和转录因子所获得的结果。本方案为研究人员提供了开展生物发光光遗传学研究的基本操作流程。 体外 和 体内所述方法可进一步拓展并针对多种不同的实验范式进行个性化调整。

有许多细胞内事件可以通过响应光的效应器进行操控，并且适用于物理光源与生物光源的双模激活。以下是利用光感应钙离子（Ca2+）整合系统、光诱导蛋白转位、光感应转录因子以及光敏感重组酶的一些实例。这些实例说明了利用生物发光激活多种类型光感受器的可行性。所展示的实验并未针对发光二极管（LED）的应用、所选荧光素酶的种类，或荧光素添加的浓度与时间进行专门优化。
快速光和活动调控表达（FLARE）是一种光遗传学系统，可在细胞内 Ca2+ 浓度升高与光照同时发生时，启动报告基因的转录23（图 4A）。Ca2+ 的存在可使蛋白酶接近仅在光照刺激下才可接触的蛋白酶切割位点，从而释放转录因子。将 HEK293 细胞共转染原始 FLARE 组件、双报告基因构建体（Firefly 荧光素酶 [FLuc]-dTomato）以及膜锚定的Gaussia荧光素酶变体 sbGLuc6。当细胞暴露于 2 µM 离子霉素和 5 mM 氯化钙（CaCl2）以提高细胞内 Ca2+ 浓度时，施加蓝光 LED 照射后，荧光报告基因的表达显著高于避光培养的细胞；同时，通过加入 FLuc 底物 D-荧光素检测发光信号，也观察到 FLuc 的表达显著增强。在加入 sbGLuc 底物（CTZ）的同时施加离子霉素和 CaCl2，sbGLuc 发出的生物发光也可诱导达到相似水平的 FLuc 表达。需要注意的是，用于光激活的荧光素酶（sbGLuc）和用于报告光激活效应的荧光素酶（FLuc 转录）仅在其各自对应的荧光素底物（CTZ 与 D-荧光素）存在时才会发光，二者不会发生交叉反应。
不同组分被组合以构建基于隐花色素异源二聚化的光诱导转录系统23,24 (图4B）。CRY2与蛋白酶融合，而膜结合型CIB则与蛋白酶切割位点及转录因子融合。光诱导的蛋白质转位释放了转录因子，从而引发FLuc和dTomato的表达，如图所示 图 4A尽管仅存在转录因子组分时可能由于自发性蛋白水解而产生较强的背景信号，但物理光源（LED）和生物发光（CTZ）均显著增强了FLuc的表达水平，该结果通过检测得出 体内 成像系统（IVIS） 
在另一组实验中，采用 NanoLuc（荧光素：furimazine 或 hCTZ）通过 CRY/CIB 的二聚化以及光敏转录因子 EL222 实现转录的光遗传学调控25,26,27。图 5A、B 展示了在黑暗和光照状态下各组分的示意图，以及与光感受器共转染或融合的荧光素酶。图 5C 展示了多种条件的比较结果。在表达相应构建体的 HEK293 细胞中加入 hCTZ 诱导生物发光，并在 15 分钟后去除，其驱动报告基因转录的效率高于 LED 光照 20 分钟，该结果在 CRY/CIB 和 EL222 两个系统中均成立。对于 CRY/CIB 系统，1 小时的 LED 光照即可达到与 15 分钟生物发光相当的转录水平；而相比之下，对于 EL222 系统，即使进行 60 分钟的 LED 光照，其效果也仅为短暂生物发光的约一半。当采用共转染方式时，两种系统在转录效率上无显著差异，但 CRY/CIB 的融合蛋白比 EL222 的融合蛋白更有效。对于两个系统，融合蛋白均比共转染组分显著提高了转录水平。与 EL222 相比，CRY/CIB 在仅加入载体（vehicle）时表现出持续更高的本底水平，而 EL222 的本底转录可忽略不计。单独增加 hCTZ 浓度对报告基因的转录无显著影响。
光可激活重组酶为光遗传学操作提供了多功能工具。我们测试了基于Vivid LOV蛋白的光敏型分裂Cre重组酶iCreV28的生物发光激活效果。图6A展示了不同组分在加入CTZ前后的示意图，包括sbGLuc、iCreV以及lox-stop-lox荧光报告系统（tdTomato）。图6B显示了加入CTZ后相对于对照组（未加CTZ或LED照射）的结果。即使在黑暗条件下（未加CTZ），也存在一定的本底表达；然而，在CTZ存在时，表达水平显著高于本底，且与LED照射诱导的表达水平相当。
<img alt="对光敏感实验的实验室设置；盒子和不透光材料覆盖的面板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：避光培养箱。 纸箱翻盖遮挡光照控制面板的光线（上箭头）。覆盖在培养箱玻璃门上的不透光罩（下箭头），用于保护细胞免受光照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于紫外线防护的红色灯光实验室设置，包括紫外灯和科研设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：在红光照射下的层流罩。 示意图显示一个标准的组织培养用层流罩在红光照射下工作。箭头指示一个带有红色灯泡的标准台灯。所有在红光下的操作均在一个完全黑暗且避光的房间内进行。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡显微镜装置；显微镜遮光与未遮光状态；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：活细胞成像显微镜周围的避光隔室。 两个活细胞成像显微镜装置的示例，分别显示使用仅在前侧带有塑料帘的封闭箱体（左图：上、下）或在成像装置四周均使用黑色遮帘（右图：上、下）。在不使用时，两个示例的前侧均保持打开并卷起状态（上图：左、右）。在进行活细胞生物发光刺激和/或成像时，将前侧黑色遮帘放下，以防止室内任何光源（如计算机屏幕）进入成像区域（下图：左、右）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物发光成像示意图，显示LED与CTZ激活用于转录分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：利用生物发光整合细胞内信号转导事件。 (A) FLARE组分与sbGLuc共转染的示意图。在Ca²⁺存在的情况下2+ 蛋白酶与其切割位点的接近程度决定了结果：无论是生物发光还是LED照射，都会导致LOV结构域解折叠，暴露出切割位点，并释放转录因子。细胞接受LED照射（占空比33%，开启2秒/关闭4秒，持续40分钟；光功率3.5 mW，光强4.72 mW/cm²）2 辐照度）或生物发光（100 µM 15分钟）或置于黑暗中。经处理以升高Ca后，表达上述组分的HEK293细胞的显微图像2+ 水平及LED照射（左）。在光度计中测量FLuc发光强度，比较LED照射、生物发光（CTZ）及避光条件下的情况（右）。B) 非Ca的示意图2+依赖型转录系统与sbGLuc共转染。在4孔板中的HEK293细胞被转染四种不同组合的组分，如示意图所示。将培养板分别暴露于LED光照（占空比33%，开启2秒/关闭4秒，持续40分钟；光功率3.5 mW，光强4.72 mW/cm²）或黑暗条件下。转染40小时后，收集细胞并使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性。2 辐照度）或生物发光（100 µM 通过添加CTZ并孵育15分钟，使CTZ终浓度达到设定值；对照组平板置于黑暗中。使用IVIS检测FLuc报告基因的转录水平。左侧显示代表性培养皿的IVIS图像；右侧显示多个重复样本经暗对照基线校正后的辐射值测量结果。比例尺 = 100 µm缩写：FLARE = 快速光和活性调节表达（Fast light- and activity-regulated expression）；LOV = 光-氧-电压感应（light-oxygen-voltage-sensing）；LED = 发光二极管（light-emitting diode）；CTZ = 海肾素（coelenterazine）；FLuc = 萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）；dTom = dTomato；CRY2 = 隐花色素2（cryptochrome 2）；CRY2PHR = CRY2 光解酶同源区（CRY2 photolyase homology region）；CIB1 = Ca2+- 和整合素结合蛋白1；CIBN = CIB1的N端；IVIS = 在体 成像系统 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光遗传学控制示意图，包含CRY/CIB蛋白相互作用、光照与黑暗状态、生物发光数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5利用生物发光驱动转录 (A两种光激活转录系统在暗态和光态下的示意图。BNanoLuc 要么与感光部分共转染，要么与其融合，如图所示（N-NanoLuc-CRY-GalDD-C；N-NanoLuc-VP16-EL222-C）。C) 关于光源、构建设计及信噪比的两种系统比较。细胞暴露于LED光下（占空比33%，开启2秒/关闭4秒，持续40分钟；光功率3.5 mW，光强4.72 mW/cm²）2 辐照度）或进行生物发光处理 15 分钟（100 µM hCTZ 终浓度；除非另有注明不同浓度。暗组：在质粒转染后至荧光素酶（FLuc）检测前，培养板在培养箱中保持静置不受干扰；VEH 组：处理方式与给予 hCTZ 的培养板相同，但给予的是溶剂对照（vehicle）。转录水平差异：hCTZ 条件下，共转染 CRY 与 EL222 — 无显著差异；hCTZ 条件下，荧光素酶—光蛋白融合体 CRY 与 EL222 — p &lt; 0.005；hCTZ，CRY 共转染与融合比较 - p &lt; 0.005；hCTZ，EL222 共转染与融合体比较 - p &lt; 0.01；对照，CRY 对比 EL222 - p &lt; 0.05. 缩略语：UAS = 上游激活序列；LED = 发光二极管；CTZ = 腔肠素；FLuc = 萤火虫荧光素酶；CRY = 隐花色素；CIB = Ca2+- 和整合素结合蛋白；VEH = 对照溶剂。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="sbGLuc激活的Cre-lox重组示意图；CTZ和LED条件下的荧光结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：用于光遗传学操控的生物发光。（A）使用sbGLuc、分裂的iCreV组分以及LSL报告基因盒，在光照处理前后由生物发光驱动的光遗传学操控示意图。（B）HEK293细胞转染质粒后置于黑暗环境中。24小时后，细胞分别接受仅培养基（无CTZ）、CTZ（终浓度100 µM）或LED（占空比25%，开5秒/关15秒，持续5分钟；光功率14.81 mW，辐照度20 mW/cm2）处理，后者作为阳性对照。显微镜下观察tdTomato荧光，条件如图所示。比例尺 = 100 µm。缩写：LSL = lox-stop-lox；CTZ = coelenterazine；LED = light-emitting diode；VVD = Vivid。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：光感受器的生物发光激活。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%201_revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：在不同规格中铺板和转染细胞的指南。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%202_revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：转染所用各种质粒的比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：荧光素的注射途径、注射体积和浓度 体内 应用（25 g 小鼠）. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

生物发光是指荧光素酶氧化小分子底物（荧光素）所发出的光，可用于激活光感应蛋白，从而为光刺激增加一个新的维度，并能够在时间和空间尺度上调控细胞中多种由光介导的功能。

生物发光——由荧光素酶氧化小分子底物荧光素所产生的光——已被用于体外和体内激活……

1（电子音调）生物发光光遗传学是一种平台技术，其中基因编码的光源可用于可视化并控制细胞内及细胞间的生物学功能与网络。生物发光无需光纤和长时间物理光照，即可无创地到达靶向细胞群中表达的每一个感光结构域。首先，开始制备荧光素储备液：将五毫克冻干的腔肠素（CTZ）溶解于250微升相应的溶剂中。用移液器吹打，确保腔肠素（CTZ）沿管壁完全溶解。避光操作，将50微升分装至0.5毫升黑色微量离心管中，于-80°C保存备用。后续所有操作均须在避光环境中进行，并在红光照明的超净工作台内完成。进行单次生物发光光刺激时，需在添加至细胞前短时间内，用细胞培养基配制荧光素工作液，使其终浓度为100微摩尔。将含荧光素的培养基加入细胞中，并孵育所需的光刺激时间。关闭红光。等待数秒，直至眼睛适应完全黑暗环境，随后用肉眼观察发光情况。通过拍摄照片记录发光现象。终止光照刺激的方法是：将含荧光素（Luciferin）的培养基替换为普通培养基，然后用培养基洗涤细胞一至两次，具体次数取决于实验的灵敏度，以彻底清除所有荧光素。为避免细胞丢失，将细胞接种于PDL包被的培养皿中并进行培养。为进行重复的生物发光光刺激，使用盒子和黑色遮光片在活细胞成像显微镜周围构建一个避光密闭空间，以搭建活细胞成像腔室。确保遮蔽实验室内所有存在的光源。使用所需的灌注液设置灌注系统，将流入液连接至灌流液容器， chamber 的流出液则导入废液容器。根据重复刺激的次数，将制备好的工作浓度荧光素成像溶液分装至微量离心管中。将带有转染细胞的盖玻片放入灌流 chamber 中。在保持泵运行的同时，将泵的进液管从进液烧杯中取出。迅速将进液管浸入荧光素溶液中，尽量缩短转移时间，以避免管路中产生气泡。一旦吸入荧光素溶液，立即将进液管放回进液烧杯中。根据细胞应暴露的生理模式，每隔数分钟至数小时，重复取出和浸入进样管至荧光素中，直至满足所需次数。随后将细胞置于避光环境中孵育16至24小时以进行转录，或孵育至光刺激效应被评估的所需时长。为进行体内生物发光激活，取出一支CTZ小瓶，从-80摄氏度取出后，在避光区域中使其升至室温，以此制备荧光素。对于每个含有 500 微克 CTZ 的小瓶，使用移液器加入 250 微升无菌水，并重新盖上橡胶塞。将重悬后的小瓶置于 55 摄氏度的水浴中孵育数分钟，以彻底溶解粉末。将溶液转移至黑色微量离心管中，并冲洗瓶壁以回收全部 CTZ。取出所需体积的溶液后，将剩余溶液保存在 4°C。在以类似方式配制、重悬和分装载体后，根据所选动物大小和给药途径，取出所需体积的荧光素或载体，进行生物发光光刺激。按照实验设计，向动物注射荧光素或载体。若需在特定行为范式期间实现目标重组酶的激活，应在行为学检测前立即对动物进行注射。对于阶段性转录，应在数天内对动物进行重复注射，并按实验设计采集生物发光刺激动物的数据。该快速光和活动调控表达系统可在细胞内钙离子浓度升高和光照条件下，启动报告基因的转录。蓝色LED诱导了强烈的报告荧光，加入荧光素后通过发光检测确定FLuc的表达水平。在活体成像系统中，LED和CTZ均显著增强了FLuc的表达，而仅存在转录因子组分时则产生明显的背景信号，可能是由于自发性蛋白水解所致。NanoLuc被用于通过CRY/CIB二聚化以及光敏转录因子EL222实现光遗传学调控。向HEK-293细胞中添加hCTZ所诱导的生物发光，以及15分钟后将其去除的效果，优于CRY/CIB和EL222系统接受20分钟LED照射的效果。当共转染hCTZ时，两种系统在转录效率上未观察到显著差异，尽管CRY/CIB的融合蛋白比EL222更有效。无论hCTZ浓度如何，CRY/CIB的背景水平始终高于EL222。基于VVD LOV蛋白iCreV的光敏型分裂Cre重组酶的生物发光特性进行了测试。CTZ应用结果显示，CTZ的存在显著增强了相对于背景的表达水平，效果与LED照射相当。利用生物发光不仅可激活铁转运光感受器，还可激活任何光感应结构域，从而为光刺激增添了新的维度，进一步拓展了在时间和空间尺度上对细胞功能的操控能力。生物发光光遗传学已应用于细胞和模式生物中。这些方案可根据需要进行定制，用于在体外和体内测试广泛的定向假设。

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