液相色谱联用折射率或质谱检测用于基于裂解液的无细胞体系中的代谢物分析

本方案采用折射率检测法来测定在基于裂解液的无细胞系统中通常积累的碳代谢副产物。同时利用质谱法检测在具有代谢活性的裂解液中生成的更广泛的中心代谢物谱。本方案所使用的这两种技术能够对基于裂解液的无细胞系统中发生的化学反应进行定量描述，从而可以检测更广泛的代谢物，包括在复杂的裂解液背景中以低浓度存在的代谢物。

演示实验操作的将是来自生物科学分部的研究生 Jaime Lorenzo Dinglasan 和 David Reeves。首先，在 1.5 毫升微量离心管中混合不同组分，制备含有每毫升 4.5 毫克总裂解液蛋白的终反应体系。每个时间点设置三个重复，制备终体积为 50 微升的无细胞代谢工程（CFME）反应体系。

通过向每个样本的终反应体积中加入等体积的5%三氯乙酸，立即在相应时间点终止三份平行反应。然后向每个反应混合物中加入两倍体积的无菌水以稀释各样本。为重现零时间点，可在加入其余反应组分之前，将与总终反应体积相等的5%三氯乙酸与裂解液混合。

此酸化步骤可在裂解液中的酶显著代谢葡萄糖之前将其沉淀。涡旋混匀样品后，在台式微量离心机中以11,600 × g离心5分钟，并将含有有机分析物的上清液转移至洁净的离心管中。若需后续进行高效液相色谱（HPLC）分析，应将样品保存在-20 °C条件下。

请确保在进行下一步操作前将储存的样品置于冰上解冻。使用孔径为0.22微米的滤膜过滤每份上清液。离心后，将每份滤液转移至洁净的HPLC玻璃小瓶中。

将样品瓶装载到已设置好用于分析的高效液相色谱系统自动进样器托盘中。从菜单栏中选择“序列”，然后选择“新建序列模板”，再选择“序列”。

将序列模板另存为序列模板名称 S。选择序列，序列表格。添加与 N 个样品瓶对应的 N 行。然后根据样品瓶在自动进样器托盘上的排列位置，在“Vial”和“Sample Name”下分别输入样品瓶位置和样品名称。

从“方法名称”下拉菜单中选择如文稿所述生成的方法，并在每一行输入每瓶进样量为 50 微升。单击“应用”，然后通过选择“序列”、“保存序列模板”来保存序列模板。通过选择“序列”、“加载序列模板”并选择模板名称 S，确保已加载序列模板。在线图谱基线稳定后，右键单击“RID 模块”面板，“控制”，关闭循环阀，使溶剂流经 RID 检测器并排至废液。

开始数据采集时，从菜单栏中选择“Sequence”，然后选择“Sequence Table, Run”。从“View”菜单中选择“Data Analysis”视图。在屏幕左侧的文件列表中找到序列文件名。

在屏幕的中心面板上，进入信号视图选择，选择 RID 信号以查看样品色谱图。在屏幕顶部面板中选择与任一样品对应的行。在含有所有这些代谢物的样品中，目标分析物对应的峰将沿保留时间轴依次排列，分别为葡萄糖、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇。

判断软件是否对目标峰进行了良好积分。每个峰的基线处应自动绘制一条红线。如果红线偏斜，则表明自动积分失败。

然后从积分工具集中选择“手动积分”按钮，手动绘制峰的基线以积分峰面积。从常用工具集中选择光标工具，点击已正确积分的峰。所选峰的峰面积及其对应的反应时间将以表格行的形式在屏幕下方的面板中高亮显示。

要导出峰面积，请选择 文件、导出、积分结果。在电子表格中绘制峰面积值与样品已知浓度的关系图。右键单击绘图数据，然后选择 添加趋势线、设置趋势线格式、在图表中显示公式。

在另一个电子表格中，使用标准曲线趋势线的方程将每个样本中各分析物的峰面积值转换为浓度。计算三个重复样本的平均峰面积及标准误，用于数据可视化。除零时间点外，按照文中的描述，在冰上为每个时间点设置三个重复反应。

在反应中使用终浓度为100毫摩尔的葡萄糖-13C6，而非葡萄糖。将反应体系在37摄氏度下分别孵育一小时、两小时和三小时。开始分析时，向每个样品中加入等体积的提取溶剂，用移液器混匀。

如果样品已冷冻，请在样品完全解冻前加入提取溶剂，以防止葡萄糖代谢重新激活。所有样品处理步骤均需在冰上进行。为重现零时点，将提取溶剂的最终体积加入适量的裂解液中，使反应体系为50 µL时，目标终浓度为4.5 毫克/毫升。

按照之前所述添加其余反应组分。此酸化步骤可在裂解液中的酶显著代谢葡萄糖之前将其沉淀。将样品置于冰上，在提取溶剂中孵育30分钟，并轻轻振荡。

然后在 4 °C 条件下以 21,000 × g 离心 15 分钟，以分离上清液与沉淀的蛋白质。将 50 µL 上清液转移至自动进样瓶中，并将进样瓶放入 4 °C 自动进样器的样品盘内。在完成仪器分析前准备后，使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统的数据采集与分析软件设置运行序列。

在 Roadmap 的“序列设置”中，右键单击表格以插入与样品数量相同的行。对于每一行，将进样体积设置为 5 微升，并将位置设置为样品瓶在自动进样器托盘上的相应位置。使用文件名作为样品名称，并设置运行结果的目标文件路径。

开始运行时，先在序列中选中所有文件名。从菜单栏中选择“操作”（Actions），然后选择“运行序列”（Run Sequence）。打开 MZmine 软件，导入之前获得的原始输出文件。

从菜单栏中选择原始数据方法（Raw Data Methods），导入原始数据（Raw Data Import），并选择与样品对应的文件。按照文稿中描述的步骤完成 MZmine 分析。在 MZmine 分析结束时，将原始峰面积导出为 CSV 文件。

打开一个电子表格，用于计算葡萄糖代谢产生的¹³C标记代谢物的质量，以进行靶向搜索。利用计算得到的¹³C标记代谢物质量，在MZmine结果中搜索并注释质荷比特征。在质量浏览器中手动检查假定注释的质谱图，以确认注释的准确性。

打开路线图，定性浏览器。从工具栏中打开原始文件，以导入每个样品的原始质谱数据。在总离子色谱图上，于与假定注释相对应的保留时间范围内下方划线，以查看质谱图。

在HPLC-RID实验中，葡萄糖在反应开始后的前三个小时内被消耗，并主要发酵生成乳酸。乙醇的积累也主要发生在反应的前三个小时内，之后即停止。乙酸最初作为S30缓冲液的组分存在于反应体系中，仅在六小时后因代谢作用开始积累，此时葡萄糖的消耗已减缓。

因此，乳酸和乙醇可被视为基于裂解物的无细胞葡萄糖代谢中的主要发酵终产物。观察到甲酸和琥珀酸作为次要发酵产物被合成。通过糖酵解途径明显消耗了葡萄糖-13C6，糖酵解中间产物的波动情况证实了这一点。

与HPLC折光指数检测数据一致，葡萄糖在反应开始的前三小时内积累为乳酸-13C3，并被发酵生成琥珀酸-13C3。同时观察到葡萄糖-13C6来源的碳原子掺入到糖磷酸酯6-磷酸葡萄糖酸内酯、6-磷酸葡萄糖酸、核酮糖-5-磷酸和景天庚酮糖-7-磷酸中，证实了磷酸戊糖途径参与了裂解液中的葡萄糖代谢。裂解液中的葡萄糖代谢还被发现可促进酪氨酸-13C9的合成，同时为组氨酸-13C5的生成提供前体物质。

对照样品必须精确代表零时间点。因此，在将裂解液中的蛋白质与含能源物质的溶液混合之前，应确保蛋白质已完全失活。同时，还需确保对测试样品、对照样品和标准品的色谱峰自动积分方式保持一致，以便所提取的峰面积具有可比性。