构建细胞共培养模型以模拟心肌缺血/再灌注 体外

我们的研究结果表明，优化内皮细胞与心肌细胞共培养的空间环境，对于建立一种有利的体外模型十分必要，该模型可用于检测内皮细胞在模拟缺血再灌注损伤中心肌细胞保护作用的功能。细胞共培养模型已被广泛用于研究细胞间相互作用对细胞功能和分化的影响。然而，在混合共培养体系中，对不同类型细胞进行独立处理以及对单一细胞类型进行下游分析往往难以实现。

本研究旨在构建两个具有显著间距的独立细胞层，以便在一个细胞类型上诱导缺氧-复氧损伤，并研究其结果和效应。首先开始准备，解冻两种细胞系。用新鲜培养基洗涤后，将细胞接种于T25培养瓶中。

第二天，用培养基更换细胞培养液，并在细胞达到汇合时使用。将细胞培养箱维持在37摄氏度，含21%氧气、5%二氧化碳和74%氮气的环境中，并保持恒定湿度。

在光学显微镜下评估心肌细胞系的融合度。吸去含有融合细胞培养物的培养瓶中的培养基，每瓶加入3至5毫升胰蛋白酶-EDTA进行消化。轻轻摇动培养瓶，并在37摄氏度下孵育2至5分钟。

此后，在光学显微镜下评估酶解反应的进程。消化完成后，通过将胰蛋白酶或细胞悬液加入含有培养基的50毫升离心管中以终止胰蛋白酶活性，每T25培养瓶加入10毫升培养基。将细胞悬液在120 × g条件下离心2分钟，以获得松散的细胞沉淀。

离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL培养基中。接着进行细胞计数并确认细胞活力。取10 µL重悬细胞与10 µL台盼蓝染料混合后，使用细胞计数仪对活细胞进行计数。

用新鲜的常规培养基稀释细胞，以达到所需的接种密度。取预先包被了细胞外基质的24孔板，将心肌细胞以每孔300,000的密度接种至孔板底部。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。

24小时后，以每孔100,000个细胞的适宜密度将内皮细胞接种至小室中。内皮细胞接种24小时后，将内皮细胞小室放入心肌细胞孔中，开始共培养。共培养12至24小时后，再进行实验。

通过将约 25 毫升培养基倒入 50 毫升锥形管中来制备缺氧培养基。用硅胶膜对管口进行气密封闭，并使用已灭菌的移液枪头在膜上打一个孔。随后，再打第二个孔，并使约 2/3 的移液枪头浸没在培养基中。

以30升/分钟的流速用缺氧气体冲洗培养基5分钟，然后弃去含有贴壁细胞的24孔板或培养小室中的培养基。每孔用100 µL 10% PBS非常轻柔地洗涤一次，随后向每孔板或小室的孔中加入500 µL新鲜配制的缺氧培养基。在常氧对照组中，将原有培养基更换为含葡萄糖和血清的新鲜正常培养基。

将盛有无菌水的培养皿放入缺氧舱中，以湿润舱内环境。随后将含有缺氧组的培养板放入舱内。以每分钟30升的流速向缺氧舱中通入缺氧气体5分钟。

随后，将培养 chamber 置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 24 小时。缺氧处理后，弃去培养板或插入物中的旧培养基，并向每孔加入含葡萄糖和血清的 500 微升正常培养基，然后将培养板置于正常培养条件下孵育 2 小时，以模拟再灌注过程。将 24 孔板中的细胞培养基转移至 96 孔板中，然后从 24 孔板的每个孔中取出 200 微升培养基，均分至 96 孔板的四个孔中。

使用细胞毒性检测试剂盒在96孔板中测定乳酸脱氢酶（LDH）的吸光度，并根据制造商说明确定细胞损伤程度。本研究评估了三种类型的插入式培养小室，所有三种插入式培养小室的孔径均为0.4微米。

它们之间的唯一区别在于插入部分的高度，从而使得共培养的两层细胞之间的距离分别为0.5、1.0和2.0毫米。根据该方案，细胞首先在正常氧条件下培养，然后分为两组：一组为常氧对照组，另一组为低氧组。24小时后，两组细胞均更换培养基，并在正常氧条件下继续培养2小时，随后进行终点检测。

本图展示了在常氧、单纯缺氧以及缺氧-复氧条件下，三种不同类型的培养小室在单独培养心肌细胞、单独培养内皮细胞以及心肌细胞与内皮细胞共培养时，乳酸脱氢酶（LDH）释放量的比较结果。当细胞层间距为0.5毫米时，与常氧条件相比，单独培养心肌细胞在缺氧条件下LDH释放量显著增加。然而，在缺氧-复氧组中，LDH释放量相较于单纯缺氧组仅略有升高。

当内皮细胞与心肌细胞共同培养时，在仅缺氧条件下，乳酸脱氢酶（LDH）的释放增加并未减弱。这表明在仅缺氧条件下，与单独的心肌细胞组相比，内皮细胞并未表现出任何保护作用。然而，在缺氧-复氧（HR）期间，内皮细胞对心肌细胞发挥了轻微但显著的保护作用。当细胞层之间的距离为1毫米时，在仅缺氧条件下，仅心肌细胞组的LDH释放也显著增加。

然而，与0.5毫米插入物不同的是，在心肌细胞中，LDH的增加在低氧再灌注条件下比仅低氧条件更为显著。在2毫米插入物中，这种增加更为明显。在2毫米插入物中接种的内皮细胞浓度分别被滴定为每插入物25,000、50,000和100,000个细胞。

研究发现，在共培养体系中增加内皮细胞密度可呈剂量依赖性地减轻缺氧-复氧（HR）所导致的乳酸脱氢酶（LDH）释放。然而，在常氧条件下未观察到此类效应。该共培养方法不仅限于内皮细胞与心肌细胞。这些方法将有助于研究多种感兴趣器官中不同细胞系之间的特异性细胞间相互作用。