复发性流产中子宫内膜四种免疫细胞类型的多重荧光免疫组织化学染色
2021年8月4日
尽管多重免疫组织化学和多光谱成像技术已取得进展，但同时表征子宫内膜中主要免疫细胞的密度和聚集情况仍具挑战性。本文介绍了一种详细的多重染色方案及成像方法，可同时定位子宫内膜中的四种免疫细胞类型。
当前技术允许使用同一物种产生的抗体来检测多达七种标志物。演示该操作流程的是来自实验室的技术员 Loucia Chan。首先，将载有组织样本的福尔马林固定石蜡包埋玻片水平放入烘箱中，组织面向上，在 60 摄氏度下烘烤，以完成玻片的预处理。
一小时后，按照文稿中所述，依次使用一系列化学试剂对切片进行脱蜡和复水，每步各10分钟。将切片浸入三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）中，随后放入盛有甲醛与甲醇混合液的塑料切片盒中，以固定样本。接着，用去离子水洗涤切片两次，每次两分钟。
将载玻片架放入盛有 pH 6.0 枸橼酸盐缓冲液的耐热盒中，进行抗原修复。然后将盒子置于微波炉中，先以100%功率加热50秒，再以20%功率持续加热20分钟，以维持相同温度。用蒸馏水冲洗载玻片后，再用TBST洗涤，随后将载玻片浸入含有过氧化物阻断液的容器中，孵育10分钟。
孵育后，用蒸馏水冲洗载玻片，并用TBST洗涤，然后使用疏水屏障笔在载玻片上的组织切片周围标记边界。接着将载玻片在TBST中冲洗，用封闭缓冲液覆盖组织切片，并将载玻片置于湿化室中孵育15分钟。为去除封闭试剂，首先将载玻片与目标一抗孵育，然后通过用TBST洗涤三次去除一抗，再进行与辣根过氧化物酶标记的二抗的孵育。
孵育结束后，在应用Opal flora TSA工作液之前洗涤载玻片，然后用抗原修复缓冲液冲洗载玻片。将载玻片置于抗原修复缓冲液中，使用微波炉进行脱片处理：先在100%功率下加热50秒，随后在20%功率下继续加热20分钟（使用可微波的安全容器）。将样本在室温下冷却15分钟后，用蒸馏水和TBST冲洗载玻片，再用dappy溶液孵育5分钟。
然后在使用适当的封片介质封片前将载玻片空气干燥。成像前，在工作站中预设合适的滤光片。在200倍放大下，至少采集10个视野用于分析。
为了计数细胞，单击步骤栏中的“计数对象”按钮，以显示对象计数设置面板。如果组织已被分割，请选择包含待计数对象的组织类别。然后从自动缩放或固定缩放中选择所需的信号缩放方式。
进行对象分割时，从下拉列表中选择主要组分。若要将相互接触的对象识别为独立个体而非合并对象，请勾选“最大尺寸和像素”框，然后选择精细分割。接下来，分别对每张捕获图像中的免疫细胞和间质细胞进行计数，以计算免疫细胞占间质细胞总数的百分比来表示数据。
随后，将所有视野的细胞计数取平均值，报告最终细胞数量。使用视图编辑器对处理后的结果数据表进行检查，然后导出计数数据表。在代表性分析中，对子宫内膜样本中的四种免疫细胞类型进行了区分。
处理后的图像显示了上皮和间质区室的组织分割。对来自一名生育能力正常的对照女性和一名原因不明复发性流产女性的子宫内膜活检样本进行了多重免疫染色，单层图像分别显示了CD3、CD56、CD68和CD20的表达。在确定免疫细胞分布后，进一步进行细胞因子染色有助于阐明这些细胞在胚胎着床成功中的相互作用及其作用机制。
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概述
本研究探讨了利用多重免疫组织化学和多光谱成像技术同时表征子宫内膜中主要免疫细胞密度与聚集状态所面临的挑战。文中详细描述了一种用于同时定位子宫内膜中四种免疫细胞类型的染色方案。
关键研究组成部分
研究领域
- 免疫学
- 子宫内膜生物学
- 多重成像技术
背景
- 免疫细胞表征在生殖生物学中的重要性。
- 传统染色方法面临的挑战。
- 成像技术的进步。
使用的方法
- 多重免疫组织化学
- 甲醛固定石蜡包埋组织样本
- 多光谱成像
主要结果
- 成功鉴定出子宫内膜中的四种免疫细胞类型（CD3、CD56、CD68、CD20）。
- 可视化呈现了免疫细胞的分布与聚集情况。
- 为后续研究提供了实验方案的优化建议。
结论
- 该研究展示了一种用于分析子宫内膜中免疫细胞的可靠方法。
- 这对理解生殖健康及胚胎着床成功率具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
多重荧光免疫组织化学染色技术能够在单个组织切片中同时定量多种免疫细胞群体，填补了生殖免疫学研究中的关键空白。该方法通过直接从患者来源样本获取具有空间分辨能力的多重免疫谱型数据，支持对子宫内膜微环境假设进行机制性风险排除。该技术通过实现生育正常与病理状态之间免疫细胞密度及聚集特征的直接比较，提高了与胚胎植入失败和复发性流产相关的靶点验证研究的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过同时检测 CD3、CD56、CD68 和 CD20 标记物，可探究涉及子宫内膜免疫细胞相互作用的治疗假设。
- 操作价值：减少了连续切片和染色的需求，在节约珍贵临床样本的同时，提高了每张组织切片的数据密度。
- 预测可信度：提供定量的、具有空间分辨能力的免疫细胞指标，有助于在胚胎着床过程中对参与子宫内膜-免疫互作的靶点进行生物学风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成标准化、可重复的荧光读数，适用于高内涵成像平台和自动化图像分析工作流程。
- 可扩展性：兼容福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织生物样本库，能够对大规模队列样本进行回顾性分析，用于生物标志物的发现。
- 多重检测优化：通过顺序染色与脱色循环消除荧光染料间的干扰，确保每种免疫细胞标志物信号的特异性。
转化与临床前研究
- 疾病相关系统：可直接应用于人子宫内膜活检样本，为研究复发性流产中的免疫失调提供具有临床相关性的模型。
- 转化连续性：通过在不同类型样本中实现一致的免疫表型分析，连接发现阶段的免疫谱型研究与临床前验证。
- 机制层面的风险降低：在初步鉴定细胞类型后，支持对细胞因子介导的免疫细胞相互作用进行深入研究，有助于通路水平上的靶点验证。
流程与工作流整合
该方法适用于发现生物学阶段，特别支持生殖免疫学项目中的免疫靶点验证和表型筛选工作。
- 发现生物学：能够在胚胎着床窗口期对子宫内膜中免疫细胞的组成及其空间分布进行假设验证。
- 筛选：生成定量的免疫荧光输出结果，可用于比较不同实验条件下免疫细胞的密度及聚类模式。
- 分析：提供多重荧光强度及共定位数据，用于免疫细胞表型鉴定及功能状态推断。
- 转化研究：通过提供经验证的免疫细胞标志物，支持从人类样本分析向下游功能实验的机制性后续研究的衔接。
- 企业级复用：建立一个可重复使用的免疫染色平台，适用于子宫内膜及其他组织的多种免疫谱型研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在疾病组织与对照组织中直接进行多重比较免疫细胞群，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过在单张切片上优化连续染色与脱色流程，提高试剂使用效率并减少实验变异性。
- 战略价值：通过阐明免疫微环境对胚胎着床成功或失败的贡献，为生殖治疗领域的立项或终止决策提供依据。
- 项目组合影响：基于免疫细胞密度、聚集特征及其与上皮或间质区域的空间相关性，实现对靶点的风险校正后优先级排序。
实施注意事项
- 准确检测和定量信号需要具备免疫组织化学、荧光显微镜和多光谱图像分析方面的专业知识。
- 依赖于微波介导的抗原修复系统、具备荧光功能的切片扫描仪，以及经过验证的Opal荧光染料试剂盒，以实现多重循环染色。
- 为确保多重检测结果的可重复性，需在不同实验室之间标准化封闭、抗体孵育和抗体剥离条件。
- 当将该方法应用于CD3、CD56、CD68和CD20以外的不同组织类型或免疫细胞标志物时，需要调整抗体组合并进行相应的验证步骤。
- 实际限制包括可能存在的荧光染料串色问题，以及成像过程中对精确光谱分离的需求，这些问题可通过连续剥离步骤和经过验证的滤光片设置加以解决。
