Name: TDP-43在斑马鱼幼虫脊髓运动神经元中的光遗传学相变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 了解利用光遗传学技术在斑马鱼脊髓运动神经元中诱导TDP-43相变的方法。该方案通过蓝光照射实现蛋白相变可视化，为研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理机制及开发潜在治疗策略提供新型动物模型。

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本工作由 SERIKA 基金（KA）、KAKENHI 项目基金编号 JP19K06933（KA）和 JP20H05345（KA）支持。

所有鱼类实验均按照日本国家遗传学研究所机构动物照护与使用委员会（批准编号24-2）发布的《实验动物照护与使用指南》进行，该机构已在美国国立卫生研究院（NIH，美国）实验室动物福利办公室备案动物福利保证书（保证书编号A5561-01）。
1. 利用 mnr2b 启动子表达光遗传学 TDP-43 基因的 BAC 构建
<ol>
	<li>BAC 制备
	<ol>
		<li>购买含有斑马鱼基因的斑马鱼BAC克隆 mnr2b 位点（CH211-172N16，BACPAC基因组学）。从5 mL DH10B菌株过夜LB培养物中纯化BAC DNA 大肠杆菌 (E. coli) 携带 CH211-172N16，如 Warming 等所述18.</li>
		<li>将 CH211-172N16 转化至 SW102 中 E. coli 通过电穿孔法将细胞转染，如 Warming 等所述18. 
		注意：从BAC DNA中纯化 E. coli 同一天进行电穿孔通常能获得更高的BAC转化成功率18否则，将纯化的BAC DNA保存在-20 °C直至使用。</li>
		<li>引入 iTol2-amp 插入片段 Tol2 转座子介导的BAC转基因技术19 通过电穿孔将片段插入 CH211-172N16 载体骨架，具体方法如 Asakawa 等人所述。20.
		<ol>
			<li>制备甘油菌种保存液 E. coli 经PCR（Ex Taq）验证引物对Tol2-L-out（5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3'）和pTARBAC-13371r（5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3'）扩增出354 bp的PCR产物，确认通过同源重组介导整合iToI2-amp盒后，获得携带CH211-172N16-iToI2A的细胞克隆。PCR反应条件如下：98 °C变性1 min，随后进行25个循环，每个循环包括95 °C变性10 s、55 °C退火15 s、72 °C延伸1 min。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h 构建
	<ol>
		<li>构建携带人野生型TDP-43表达盒的质粒TARDBP （TDP-43h）在N端标记mRFP1，在C端标记CRY2olig（下文简称opTDP-43h）14. 
		&#8203;注意：opTDP-43h 片段两侧应加上斑马鱼 hsp70l 基因启动子序列（650 bp）和多聚腺苷酸化（polyA）信号序列，其后为一个卡那霉素抗性基因（hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan14.</li>
		<li>扩增 hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan 磷酸盒，使用可退火的引物 hsp70l 以及Kan，包含起始密码子上下游的45 bp序列 mnr2b 使用引物对 mnr2b-hspGFF-Forward（5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3'）和 Km-r（5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aek ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3'），通过 PCR（GXL DNA Polymerase）扩增基因，反应条件如下：98 °C 预变性 1 min，随后进行 30 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 10 s、55 °C 引物退火 15 s 和 68 °C 引物延伸 30 s，扩增得到约 5.7 bp 的 PCR 产物。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳（100 V）分离PCR产物，并纯化 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA 条带与 DNA 载体连接。调整纯化后产物的浓度 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 磷酸化盒溶于含 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 和 1 mM EDTA 的 Tris-EDTA 缓冲液（TE）中，浓度调至 50 ng/µL。</li>
		<li>引入 hsp70l通过电穿孔法将p-opTDP-43h-polyA-Kan表达盒插入CH211-172N16-iTol2A，操作步骤参照Warming等人的方法。18 在LB琼脂平板上筛选氨苄青霉素和卡那霉素抗性的转化子。CH211-172N16-iTol2A携带的 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 突变盒被指定为 mnr2b-hs:opTDP-43h。</li>
		<li>使用BAC纯化试剂盒纯化mnr2b-hs:opTDP-43h，在苯酚/氯仿抽提后以TE缓冲液溶解至250 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z 构建
	<ol>
		<li>构建另一个携带斑马鱼野生型的质粒 tardbp 在其N端标记有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（EGFP-TDP-43z），而非opTDP-43h，其余部分与之完全相同 hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan 载体（hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan）14使用EGFP-TDP-43z作为光刺激opTDP-43h的内参对照。</li>
		<li>构建含有CH211-172N16-iTol2A的质粒 hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan 载体片段 mnr2b 如1.2.1-1.2.5所述的位点。携带CH211-172N16-iTol2A的 hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan 突变体被命名为 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 斑马鱼中由 Tol2 转座子介导的BAC转基因技术
<ol>
	<li>制备注射溶液，其中包含 40 mM KCl、酚红（10% v/v）、25 ng/µL 的 mnr2b-hs:opTDP-43h DNA 以及 25 ng/µL Tol2 转座酶 mRNA19。</li>
	<li>在受精后一细胞期，将 1 nL 注射溶液（在矿物油中校准，液滴直径约为 123 µm）注入野生型斑马鱼胚胎的细胞质中。在受精后 2–3 天，使用荧光体视显微镜观察注射后鱼类在各种胚胎组织（包括脊髓运动神经元）中是否形成红色荧光蛋白（RFP）阳性聚集体。将呈现 RFP 阳性的鱼饲养至成年。</li>
	<li>按照步骤 2.1 和 2.2 所述方法注射 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA。将呈现 EGFP 阳性的鱼饲养至成年。</li>
	<li>数月后，将性成熟的注射鱼与野生型鱼成对放入标准的 2 L 交配笼中，以获得 F1 子代。在受精后 3 天，使用配备 Plan-Neofluar 5x/0.15 物镜的落射荧光显微镜，筛选 F1 子代在脊髓运动神经柱中是否出现 RFP（opTDP-43h）或 EGFP（EGFP-TDP-43z）荧光。通常每 10–20 条注射鱼中可鉴定出一条始祖鱼（生殖系传递率为 5%–10%）。</li>
	<li>从不同的始祖鱼中分离并比较多个 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 和 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 插入株系，因为由于染色体位置效应，不同始祖鱼之间 opTDP-43h 或 EGFP-TDP-43z 的表达强度可能不同，但表达模式保持一致。</li>
	<li>将 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 与 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 鱼系进行杂交，以获得符合孟德尔遗传比例的 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 双转基因子代鱼。</li>
	<li>将鱼饲养在含有 30 mL E3 缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4、10-5% 亚甲蓝）的塑料培养皿中，并在受精后 8–10 小时加入 0.003%（w/v）N-苯基硫脲，以抑制黑色素生成。</li>
	<li>在受精后 30 小时，用铝箔覆盖塑料培养皿。</li>
</ol>
3. 蓝光照射用LED的准备
<ol>
	<li>使用安装在平板电脑或手机上的配套应用程序打开LED面板。将光谱仪的探头插入6孔板的一个空孔中，通过应用程序将LED光源调节至峰值波长约为456 nm。将光功率计的光学传感器置于空孔内，并调节LED光源的功率至约0.61&#160;mW/cm2。LED光源的设置可在应用程序中保存并供后续调用。</li>
	<li>将已设定好的培养板/LED面板组合放入28 °C的培养箱中。此步骤需在鱼胚胎成像开始前（48 hpf之前）完成。</li>
</ol>
表达光遗传学 TDP-43 的斑马鱼幼鱼成像
<ol>
	<li>使用上述荧光显微镜装置，根据脊髓运动神经元柱中RFP（opTDP-43h）或EGFP（EGFP-TDP-43z）的荧光信号，选择至少在47 hpf之前具有荧光的Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼。</li>
	<li>对Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼进行去卵膜处理。</li>
	<li>将含有250 µg/mL乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐的1%低熔点琼脂糖在42 °C下预热。</li>
	<li>在含有相同浓度Tricane的E3缓冲液中，短暂麻醉48 hpf的Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43]双转基因鱼。</li>
	<li>在室温下，将预热的1%低熔点琼脂糖滴加至玻璃底培养皿上，琼脂糖液滴在玻璃皿上呈圆顶状，直径为8–10 mm。</li>
	<li>使用巴斯德移液管将麻醉后的鱼加入玻璃底培养皿中的低熔点琼脂糖中，并反复吹打数次使其混合均匀。尽量减少随鱼一同加入琼脂糖中的E3缓冲液体积。</li>
	<li>在琼脂糖凝固过程中（通常约1分钟），使用注射器针头将鱼体固定于侧卧位，以确保脊髓处于适当的水平位置。琼脂糖凝固后，在圆顶状琼脂糖包埋的鱼体上滴加数滴E3缓冲液。</li>
	<li>使用配备数值孔径为1.00的20倍水浸物镜的共聚焦显微镜，以每像素4.0 µs（12位/像素）的扫描速度、每层1.0 µm的步进间距，结合以下激发/发射波长组合，获取脊髓的连续共聚焦z轴断层图像：通道1）EGFP：473/510 nm；通道2）mRFP1：559/583 nm。 
	注意：鱼腹侧的肛门区域应包含在感兴趣区域（ROI）内作为参考，有助于在不同时间点识别和比较脊髓节段（第16–17节段）。</li>
	<li>成像完成后，立即用注射器针头小心敲碎琼脂糖，将鱼取出。尽管琼脂糖包埋时间少于&#60;30分钟不会影响鱼的存活率，但仍应尽可能缩短鱼在琼脂糖中的嵌入时间。</li>
</ol>
5. 通过蓝色发光二极管（LED）光源的场照明对表达opTDP-43h的斑马鱼进行光刺激
<ol>
	<li>向孔中加入7.5 mL E3缓冲液，并将已成像的Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼放入孔中。将六孔板置于LED面板上，使用垫片（例如，堆叠五张载玻片）使六孔板与LED面板保持5 mm间距。</li>
	<li>打开蓝色LED灯。当需要未照射光线的对照组鱼（即处于黑暗条件下）时，将部分Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼置于另一个六孔板中，并用铝箔覆盖以避光。14.</li>
	<li>光照后（例如在72 hpf时持续24小时） 图3），通过重复步骤 4.3 - 4.9 对光照后的斑马鱼脊髓进行成像。</li>
</ol>
6. 光遗传学TDP-43在脊髓运动神经元中胞质重定位的可视化观察
<ol>
	<li>在 ImageJ/Fiji21（版本：2.1.0/1.53c）中打开图像文件，这是一个由 NIH Image 开发的开源 Java 图像处理程序，可从 https://imagej.net/Fiji/Downloads 下载。</li>
	<li>使用 Z 滚动条浏览不同焦平面。通过点击 图像 | 图像栈 | Z 投影 | 最大强度投影，并设置覆盖脊髓运动柱半节段的起始切片和终止切片，生成多个切片的最大强度投影。</li>
	<li>通过点击 图像 | 颜色 | 拆分通道，将多通道图像拆分为两个单通道图像。</li>
	<li>通过点击 图像 | 调整 | 亮度/对比度 并调整 最小值，增强 EGFP-TDP-43z 信号，以确保细胞质中的 EGFP-TDP-43z 清晰可见。</li>
	<li>通过点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 打开 ROI 管理器。根据细胞体的相对位置，找出在 48 hpf 和 72 hpf 两个时间点均可识别的细胞。使用 自由手选区 工具勾勒出由 EGFP-TDP-43z 信号显示的单个脊髓运动神经元细胞体的轮廓，设定感兴趣区域（ROI），然后在 ROI 管理器中点击 添加[t]。</li>
	<li>使用 直线 工具绘制一条直线，定义细胞体的主轴，并对 48 hpf 和 72 hpf 时的 EGFP-TDP-43z（C1）和 opTDP-43h（C2）图像分别点击 分析 | 绘制剖面图。</li>
	<li>通过将每个 EGFP-TDP-43z 和 opTDP-43h 信号的数值除以其最大值，对绘制的剖面图进行归一化处理。使用统计软件中的 XY 图，以 x-y 坐标绘制归一化后的数值，其中 x 和 y 分别代表细胞体的主轴和相对荧光强度。</li>
</ol>
使用 ImageJ/Fiji 对 opTDP-43h 和 EGFP-TDP-43z 信号进行比率比较
<ol>
	<li>在 ImageJ/Fiji 中打开图像文件，并使用 EGFP-TDP-43z 的最大强度投影图像，按照 6.1–6.5 的方法为单个 mnr2b-阳性细胞设置感兴趣区域（ROI）。在腹侧脊髓外（例如脊索）添加一个 ROI，用于代表背景信号（背景 ROI）。</li>
	<li>对于每幅 EGFP-TDP-43z 和 opTDP-43 图像，通过点击 Image | Stacks | Z project | Sum Slices 创建多层图像的投影，并设置起始层（Start slice）和终止层（Stop slice），以覆盖半侧脊髓运动柱区域。</li>
	<li>打开使用最大强度投影图像创建的 ROI 管理器。选择 EGFP-TDP-43z 的图像窗口，然后在 ROI 管理器中点击 Show All，将所有 ROI 显示在 Sum Slices 图像上。在 ROI 管理器中点击 Measure，获取每个 ROI 的平均值。</li>
	<li>按照 7.3 中所述相同步骤，获取 opTDP-43h 的平均值。</li>
	<li>对于每个 ROI，先减去背景 ROI 的平均值，然后将 opTDP-43h 的校正后平均值除以 EGFP-TDP-43z 的校正后平均值，得到比值结果。这些比值可在不同时间点之间进行比较，并使用 Prism 软件以柱状图形式呈现。</li>
</ol>

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<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
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KA 和 KK 是本论文所述知识产权的发明人，相关临时专利已由日本遗传学研究所提交。

利用 mnr2b-BAC 介导在斑马鱼中表达 opTDP-43h 和 EGFP-TDP-43z，为在脊髓运动神经元中实时成像 TDP-43 相变过程提供了独特的机会。斑马鱼幼体组织的光学透明性使得对 opTDP-43h 进行简单且非侵入性的光遗传学刺激成为可能。随时间对单个脊髓运动神经元进行比较表明，opTDP-43h 的光依赖性寡聚化会引发其在细胞质中的聚集，这一现象类似于肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理特征。
决定内在无序蛋白相行为的关键参数之一是细胞内浓度。opTDP-43h 的高水平表达可能引发不依赖光照的 opTDP-43h 寡聚化、相变及聚集。因此，在脊髓运动神经元中诱导稳定且无毒性的 opTDP-43h 表达水平，是成功评估 opTDP-43 相变对脊髓运动神经元生理与病理影响的关键。由 mnr2b-BAC 介导的 opTDP-43h 表达似乎适用于此目的，因为 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 转基因鱼主要表现为核内表达 opTDP-43h，能够自由游动并具有充气的 swim bladder，即使在 1–5 dpf 期...

核糖核蛋白（RNP）颗粒通过液-液相分离（LLPS）形成无膜区室，调控细胞核和细胞质中的多种细胞活动，该现象指均一液体分离为两种不同液相的过程1,2RNA结合蛋白通常作为核糖核蛋白颗粒组分发挥作用，其液-液相分离（LLPS）的失调会促进异常的相变，导致蛋白质聚集。该过程已被证实在神经发育和神经退行性疾病中起重要作用。3,4,5异常RNA结合蛋白的液-液相分离与疾病发病机制之间因果关系的精确评估，对于确定液-液相分离能否以及如何作为有效的治疗靶点至关重要。RNA结合蛋白的液-液相分离相对易于研究 体外 在单细胞模型中较为可行，但在多细胞生物尤其是脊椎动物中则较为困难。在组织环境中分析此类液-液相分离（LLPS）的一个关键要求是，能够在易受疾病影响的特定细胞类型中稳定表达一种用于LLPS成像与操控的探针。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种最终致命的神经系统疾病，其特征是由于变性导致脑和脊髓中的运动神经元被选择性且进行性地丧失。迄今为止，已发现超过25个基因的突变与遗传性（即家族性）ALS相关，该类型占所有ALS病例的5%–10%，其中一些致病基因编码含有核糖核蛋白（RNP）的RNA结合蛋白，例如hnRNPA1、TDP-43和FUS6,7。 此外，散发性ALS占所有ALS病例的90%–95%，其特征是在变性的运动神经元中出现TDP-43的胞质聚集。这些与ALS相关的RNA结合蛋白的一个主要特征是其内在无序区（IDRs）或低复杂度结构域，这些区域缺乏有序的三维结构，并可介导与多种不同蛋白质之间的弱相互作用，从而驱动液-液相分离（LLPS）7,8。由于ALS致病突变常发生在IDRs中，这提示这些ALS相关蛋白的异常液-液相分离及相变过程可能构成了ALS发病机制的基础9,10。
最近，一种基于隐花色素2（Cryptochrome 2）的光遗传学技术——optoDroplet方法被开发出来，该方法可通过光调控含有内在无序区（IDRs）蛋白的蛋白-蛋白相互作用，从而诱导其发生相变11。由于该技术已成功应用于TDP-43，目前正逐步揭示TDP-43病理性相变及其相关细胞毒性的潜在机制12,13,14,15。在本实验方案中，我们描述了一种基因递送方法，利用编码运动神经元特异性同源结构域蛋白的mnr2b/mnx2b基因BAC，将光遗传学改造的TDP-43靶向递送至对肌萎缩侧索硬化症（ALS）易感的细胞类型，即斑马鱼的脊髓运动神经元16,17。斑马鱼幼体高度透明，可实现对光遗传学TDP-43的简单、非侵入性光刺激，从而触发其在脊髓运动神经元中的相变。我们还提供了一个基本的工作流程，介绍如何利用免费开源的Fiji/ImageJ软件对斑马鱼脊髓运动神经元进行活体成像及图像分析，以表征光遗传学TDP-43对光刺激的响应。这些方法可在对ALS易感的细胞环境中研究TDP-43的相变过程，并有助于在细胞和行为水平上进一步探索其病理学后果。

<table><tbody><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>LED 面板</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG 琼脂糖</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&amp;times;/1.00</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td><td></td></tr><tr><td>光功率计</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>光学传感器</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 酚红溶液</td><td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>六孔板</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪探头 BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼 BAC 克隆 CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomics</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼幼体脊髓运动神经元中tdp-43的光遗传相变

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

异常蛋白质聚集和选择性神经元易损性是神经退行性疾病的两大主要特征。尽管目前此类实验方法仍受限，但通过在易损细胞类型中调控致病相关蛋白的相变过程，可探究这些特征之间的因果关系。本文介绍了一种在斑马鱼幼鱼脊髓运动神经元中诱导RNA/DNA结合蛋白TDP-43发生相变的实验方案，用于模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）中变性运动神经元内TDP-43的胞质聚集现象。我们描述了一种基于细菌人工染色体（BAC）的遗传学方法，可将光遗传学TDP-43变体特异性地递送至斑马鱼的脊髓运动神经元。由于斑马鱼幼鱼具有高度透明的特性，因此仅需使用发光二极管（LED）对自由活动的斑马鱼进行外部光照，即可诱导其脊髓运动神经元中光遗传学TDP-43的相变。此外，我们还提供了对斑马鱼脊髓运动神经元进行活体成像以及利用免费开源软件Fiji/ImageJ进行图像分析的基本工作流程，以表征光遗传学TDP-43对光照的响应特性。该方案能够在ALS易损的细胞环境中表征TDP-43的相变过程及聚集体形成，有助于进一步研究其细胞层面和行为学层面的后果。

光遗传学与非光遗传学TDP-43蛋白的活体成像 mnr2b+ 斑马鱼幼虫的脊髓运动神经元 
为了在斑马鱼脊髓运动神经元中诱导TDP-43相变，使用带有mRFP1和CRY2olig标记的人源TDP-43h22 分别在N端和C端构建了opTDP-43h，并予以命名14 (图1A）。将 opTDP-43h 基因片段导入含有一个 BAC 的 mnr2b 位点（图1B）。将由此获得的BAC命名为mnr2b-hs:opTDP-43h，并通过以下方式导入斑马鱼基因组中 Tol2 转座子介导的BAC转基因技术19为了监测非光遗传学TDP-43在脊髓运动神经元中的定位，一种由斑马鱼编码的TDP-43 tardbp 基因...

我们描述了一种利用斑马鱼作为模型，在脊髓运动神经元中通过光照诱导 TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）发生相变的实验方案。

斑马鱼幼体脊髓运动神经元中TDP-43的光遗传相变

异常蛋白质聚集和选择性神经元易损性是神经退行性疾病的两大主要特征。……之间的因果关系

因此，该实验方案使我们能够诱导TDP-43发生病理性相变，并研究其在体内的脊髓运动神经元中的细胞效应，这对于理解肌萎缩侧索硬化症（ALS）中运动神经元为何退化具有重要意义。由于斑马鱼幼体具有高度透明的特性，脊髓中的运动神经元可直接被观察到，因此可以在单个脊髓运动神经元中可视化TDP-43发生相变时的动态行为。该方法提供了一种新型的肌萎缩侧索硬化症（ALS）动物模型。我们认为，任何能够防止该ALS模型中光诱导TDP-43相变及聚集的方法，均可能成为ALS治疗的潜在候选方案。此外，可表达其他含有内在无序区域的ALS相关蛋白，以探索与异常相变相关的神经毒性。该方法成功的关键在于，在非毒性水平下于脊髓运动神经元中表达光遗传学TDP-43。BAC转基因步骤耗时较长，但一旦构建出合适的转基因鱼，后续步骤则相对简单直接。首先，使用安装在平板电脑或手机上的配套应用程序打开发光二极管（LED）面板。接下来，将光谱仪探头放入6孔板的一个空孔中。然后使用应用程序将LED光源调节至峰值波长为456 nm。将光学功率计的光学传感器置于空孔中，并调节LED光源的功率。然后将培养皿连同LED面板一起放入28 °C的培养箱中。对于表达光遗传学TDP-43的斑马鱼幼鱼成像，需对双转基因鱼进行去卵膜处理，并用含有250 µg/mL Tricaine的E3缓冲液将其麻醉。接着，将含有250 µg/mL甲磺酸乙酰氨基苯甲酸乙酯的1%低熔点琼脂糖在42 °C预热。然后在玻璃底培养皿上滴加一滴琼脂糖，玻璃皿上呈圆顶状的琼脂糖液滴直径应为8至10 mm。接下来，使用巴斯德移液管将麻醉后的斑马鱼加入玻璃培养皿中的琼脂糖内。尽量减少随鱼一同加入琼脂糖中的E3缓冲液量。然后，通过反复吹打混合数次。在琼脂糖凝固过程中，使用注射器针头将鱼体保持在侧卧位置，使脊髓处于适当的水平位置。琼脂糖完全凝固后，在呈圆顶状的琼脂糖包埋鱼体上滴加数滴 E3 缓冲液。使用配备 20 倍水浸物镜的共聚焦显微镜，对脊髓进行连续的共聚焦 z 轴断层扫描。将鱼腹侧的泄殖腔纳入感兴趣区域，作为参考以识别和比较不同时间点的脊髓节段。成像一旦完成，立即使用注射器针头小心敲碎琼脂糖，将鱼从琼脂糖中取出。应尽量缩短鱼在琼脂糖中的包埋时间，尽管少于30分钟的琼脂糖包埋不会影响鱼的存活能力。向6孔板的一个孔中加入7.5 mL E3缓冲液，并将已成像的双转基因鱼放入该孔中。然后将6孔板放置在LED面板上，使用垫片保持6孔板与LED面板之间相距5 mm，并打开蓝色LED光源。另取部分双转基因鱼置于另一个用铝箔包裹的6孔板中，作为未照射光的对照组。在完成所需的光照时间后，按照之前的方法对光照过的鱼的脊髓进行成像。通过将受精后48小时和72小时获取的z轴层析图像分别分离为EGFP-TDP-43z和opTDP-43h通道，可观察到单个脊髓运动神经元中opTDP-43h的胞质转位。从EGFP-TDP-43z的最大强度投影图像中，选取了一个在受精后48小时和72小时均可识别的单个孤立脊髓神经元。通过勾画48小时时EGFP信号的边缘，划定覆盖运动神经元胞体的兴趣区域。受精后48小时和72小时。沿胞体主轴的标准化荧光强度被绘制成图。在受精后48小时，两种信号的分布模式大部分相互重叠。相比之下，在受精后72小时，opTDP-43h信号的峰值出现在EGFP-TDP-43z信号较低的区域，表明opTDP-43h发生了细胞质重定位。为了定量分析蓝光刺激前后opTDP-43h和EGFP-TDP-43z信号的变化，对同一z序列图像中各通道在受精后48小时和72小时的部分切片投影图像进行了处理。在研究的四个 mnr2b+ 细胞中，细胞1明显表现出饱和的EGFP-TDP-43z信号。通过将RFP值除以GFP值，计算出opTDP-43h相对于EGFP-TDP-43z的相对含量。细胞2至细胞4在蓝光照射后表现出opTDP-43h水平逐渐降低。将鱼类包埋在琼脂糖中的时间应尽量缩短，以保持其健康状态。通过调节LED光照的强度和持续时间，可对TDP-43的相变过程进行临时性调控，从而有助于解析运动神经元中病理性TDP-43相变的进展过程。

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

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TDP-43在斑马鱼幼虫脊髓运动神经元中的光遗传学相变

本视频介绍了通过激活基因改造的体感神经元，并使用高速摄像机记录所引发的行为反应的光遗传学技术。...

斑马鱼光遗传学：激活基因改造的体感神经元以研究幼鱼行为反应

在本视频中，我们介绍了一种相分离检测方法，该方法通过诱导含有内在无序区域并与光敏寡聚化结构域融合的细胞内蛋白质发生相分离 通过...

蛋白质相分离检测：一种用于斑马鱼幼虫脊髓运动神经元中突变RNA结合蛋白相分离的光遗传学方法

本视频展示了一种非侵入性检测方法，用于研究斑马鱼胚胎中运动神经元的电生理特性。通过测量胚胎尾部因脊髓运动神经元自发去极化而产生的卷曲活动，随后施加钠通道阻断剂以降低卷曲频率。接着，将胚胎固定在琼脂糖中，并置于荧光显微镜下观察。经基因工程改造的运动神经元表达一种带有供体和受体荧光团的电压感应生物传感器。受体荧光团发射信号的减弱表明，由于钠通道阻断剂的作用，运动神经元的自发去极化活动减少。...

一种非侵入性研究斑马鱼胚胎运动神经元电生理学的方法

光遗传学技术使得研究特定神经元对行为的贡献成为可能。本文描述了一种在幼年斑马鱼中激活表达通道视紫红质变体（ChEF）的单个躯体感觉神经元的方法，该方法采用半导体泵浦固体（DPSS）激光器进行激活，并使用高速摄像机记录所引发的行为反应。...

使用ChEF-tdTomato对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活

此处描述的实验方案通过采用斑马鱼胚胎，能够在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究可兴奋细胞的电学特性。 体内...

在活体斑马鱼胚胎中检测运动神经元膜电位

本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。...

斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

本文介绍了一种通过紫外光照射活体动物中表达荧光蛋白Eos的特定区域，实现细胞光转化的实验方案。...

活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

光遗传学是一种具有广泛应用的强大工具。本方案展示了如何利用对蓝光响应的TAEL/C120系统，在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。...

利用光遗传学TAEL/C120系统在斑马鱼胚胎中诱导GFP表达

利用光遗传学手段调控信号通路，是研究发育、再生、稳态及疾病过程中信号如何被解码的一种强有力策略。本方案提供了在早期斑马鱼胚胎中使用基于光-氧-电压感应结构域的 Nodal...

斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

本方案建立了一种在MPTP处理的斑马鱼幼虫中进行行为表型分析的范式，用于评估类似帕金森病的运动和非运动功能缺陷。...

基于行为学实验的MPTP诱导斑马鱼幼鱼帕金森病样行为表型分析

了解利用光遗传学技术在斑马鱼脊髓运动神经元中诱导TDP-43相变的方法。该方案通过蓝光照射实现蛋白相变可视化，为研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理机制及开发潜在治疗策略提供新型动物模型。

斑马鱼幼体脊髓运动神经元中TDP-43的光遗传相变

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