乳腺上皮和内皮细胞球体作为乳腺癌研究潜在的功能性体外模型
2021年7月12日
乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在乳腺癌进展、肿瘤生长及转移中起着重要作用。本研究利用乳腺癌细胞与血管和/或淋巴管内皮细胞共同构建球状体，并验证其作为研究模型的适用性 体外 乳腺癌研究系统
本文所述的乳腺癌细胞球体将使研究人员能够探究参与癌细胞增殖和转移过程中的癌细胞与内皮细胞相互作用的分子机制。该三维模型的主要优势在于其提供了更为真实的细胞排列方式，从而提高了关于乳腺癌病理生理学及治疗研究推论的可靠性。本实验操作将由我实验室的博士生 Giovanna Azzarito 进行示范。
首先将接种的细胞处理或转染24小时，或根据需要进行相应处理。为鉴定类球体中的细胞分布，使用含钙和镁的一毫升汉克斯平衡盐溶液（Hanks' Balanced Salt Solution，HBSS）洗涤细胞，并在HUVECs中加入0.5微克/毫升的蓝色染料，在MCF-7细胞中加入0.5微摩尔的绿色染料，绿色染料用相应的生长培养基稀释。
将培养板放入37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育30至40分钟。用1毫升不含钙和镁的HBSS洗涤细胞。然后使用P1000移液器向每孔棕色培养皿中加入1毫升酶解解离试剂，HUVEC细胞使用0.25%胰蛋白酶，MCF-7细胞使用0.5%胰蛋白酶。
使用P1000移液器，在5毫升圆底聚苯乙烯管中分别收集每种细胞类型，并加入1毫升含10%胎牛血清（Fetal Calf Serum，FCS）的培养基以终止酶反应。随后，以250 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并将细胞重悬于1毫升无类固醇培养基中。
使用100微升每种细胞悬液，用10毫升稀释液2稀释后，测定总细胞数。打开仪器，将稀释液2加入细胞计数仪样品瓶中，按下功能键和启动键进行冲洗。设置参数为4，加入新鲜的稀释液2溶液后按下启动键测定空白值。
将闪烁瓶更换为含有100微升细胞悬液的10毫升稀释液2溶液。采用设置四并按下启动键以测量样品。记录数字显示屏上每毫升的细胞数量，然后分别准备5毫升的每种细胞悬液，并按1:1比例混合，得到最终体积为10毫升的混合液，使用手动多通道移液器将100微升细胞悬液移入96孔U型底板的每个孔中。
将培养板置于标准组织培养条件下孵育，并在48小时后检查球状体形成情况。使用相差或荧光体视显微镜在40倍放大倍数下拍摄这些球状体的图像。为制备悬滴培养，将细胞悬液按1:1比例混合，以获得终体积为2毫升的混合液。
使用 P20 移液器将细胞混合物以 15 微升液滴的形式滴加到直径 10 厘米培养皿的倒置皿盖上。将带有液滴的皿盖倒置，并在培养皿底部加入 5 毫升 EBM-2 基础培养基，以防止液滴蒸发。使用 P200 微升移液器的吸头，将约 50 个球状体收集至 1.5 毫升离心管中。
让其依靠重力沉降至管底，然后弃去上清液。用500微升4%多聚甲醛在室温下固定这些球状体1小时。将2% Nobl agar溶液加入PBS中，使用带磁力搅拌的加热板煮沸3至5分钟，以完全溶解琼脂粉，随后冷却至约60摄氏度。
用 P1000 移液器移除 PFA，加入 500 微升 PBS 洗涤类球体，并使其沉降。沉降完成后，小心弃去上清液，用移液器向含有类球体的 1.5 毫升离心管中加入 600 微升 Agora 溶液，并立即将离心管放入水平转子离心机中，在 177 × g 条件下离心 2 分钟。在 Agro 溶液中间加入一小段细绳，以便于将凝胶塞从离心管中取出。
将Agros凝胶在冰上固化，或在4摄氏度条件下向1.5毫升离心管中加入500微升PBS，以防止沉淀物干燥。使用体视显微镜获取球状体切片的图像。计算所需溶液的量，以便向每孔加入10微升染料混合液，该混合液由钙黄绿素AAM和碘化乙啶同型二聚体用EBM-2培养基按1:50比例稀释而成。
将染色混合物加入类球体中，将培养板置于标准组织培养条件下孵育30至60分钟。使用荧光体视显微镜以40倍放大倍数采集图像。在U型底培养板中，接种MCF seven细胞48小时后可观察到类球体的形成。
然而，内皮细胞或淋巴管细胞并未观察到球体形成。将MCF7细胞与内皮细胞或MCF7细胞与淋巴管细胞以1:1比例共接种，也可形成球体。记录了MCF7球体从24至120小时的时间依赖性顺序生长过程。
在五天内，类球体的大小从约100微米增加到约200微米。使用生长刺激剂处理的类球体观察到生长速率加快。在脂质体存在下转染对照寡核苷酸后，类球体的结构及其细胞形态未出现异常。
表达增殖标志物 Ki-67 的细胞在该类球状体中呈均匀分布。对该类球状体进行 caspase-3 染色显示，培养四天后出现无活性细胞。通过 CD-31 和 Ki-67 对该类球状体中的细胞进行研究发现，55% 的细胞为上皮细胞，45% 为内皮细胞，其中 25% 的细胞处于增殖状态。
为了评估活细胞和死细胞的比例，使用钙黄绿素AAM和碘化丙啶同型二聚体对培养四天的球状体进行染色。对新鲜制备的球状体进行活/死细胞染色的结果显示，球状体对冻存条件非常敏感。在执行本方案时，务必使用健康的细胞来制备球状体。另外需要注意的是，在DP帽过程中应避免损伤球状体，以获得良好的切片，同时在凝胶聚合前确保将球状体摆放至合适位置。
通过纳入其他细胞（如参与肿瘤进展的成纤维细胞）并利用该模型评估靶向癌症生长的治疗剂的有效性，可进一步改进该模型。
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概述
本研究探讨了乳腺癌进展过程中乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的相互作用。通过乳腺癌细胞和内皮细胞构建球状体，该研究提供了一种研究癌症机制的新型体外模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 乳腺癌研究
- 细胞相互作用
- 体外建模
背景
- 上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在癌症发生发展中起着关键作用。
- 深入理解这些相互作用有助于开发更有效的治疗策略。
- 与传统的二维培养相比，三维细胞培养模型能更准确地模拟肿瘤微环境。
- 本研究重点探讨类球体在乳腺癌研究中的应用价值。
研究目的
- 研究癌细胞与内皮细胞相互作用的分子机制。
- 加深对癌细胞增殖和转移过程的理解。
- 建立一种可靠的体外乳腺癌研究体系。
使用的方法
- 使用乳腺癌细胞和内皮细胞生成球状体。
- 在分析前对细胞进行24小时的处理或转染。
- 使用Hanks' Balanced Salt Solution洗涤细胞。
- 应用特异性染料以鉴定球状体内的细胞类型。
主要结果
- 球状体模型可用于深入研究细胞间的相互作用。
- 加深了对内皮细胞在肿瘤生长中作用的理解。
- 证明了该模型用于未来研究的可行性。
- 为乳腺癌的病理生理学提供了新的认识。
结论
- 三维球状模型是乳腺癌研究中的重要工具。
- 它可提高与癌症机制相关研究结果的可靠性。
- 未来的研究可利用该模型探索治疗方案。
常见问题
行业重要性概述
这种三维球体模型通过促进对驱动肿瘤生长和转移的上皮-内皮细胞相互作用的研究，弥补了乳腺癌研究中的一个关键空白。该模型提供了一个更具生理相关性的体外系统，提高了临床前研究结果的可预测性，并支持靶点验证工作。在早期发现阶段，该模型有助于进行机制性风险评估，使研究人员能够评估血管和淋巴管内皮细胞对癌细胞增殖和迁移行为的影响。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究涉及乳腺癌中癌细胞与基质相互作用的治疗假设。
- 操作价值：通过模拟对肿瘤进展至关重要的细胞间通讯通路，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：通过反映肿瘤微环境的多细胞复杂性，提高靶点选择的可信度。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成标准化且可重复的类球体结构，适用于化合物筛选工作流程。
- 定量输出：能够测量类球体的大小、活力及增殖标志物，用于剂量-反应分析。
- 可扩展性：兼容悬滴法和96孔圆底板格式，支持中通量应用。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟乳腺癌特异性间质相互作用，涉及内皮细胞，这些相互作用在临床上与血管生成和转移相关。
- 转化连续性：通过维持在患者来源样本中观察到的细胞表型，将发现结果与临床前验证衔接起来。
- 风险调整的进展评估：揭示内皮细胞共培养如何调节药物敏感性和耐药机制，从而为决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，通过为评估治疗候选物提供具有生物学相关性的背景，支持靶点验证和先导化合物的鉴定。
- Discovery Biology：支持对内皮介导的肿瘤生长及转移潜能进行假设验证。
- Screening：实现类球体生长和活力检测的标准化与可重复性，用于评估化合物的作用效果。
- Analytics：提供定量读数，如类球体大小、活/死细胞比率和增殖指数，以比较不同实验条件。
- Translational Research：通过保留与人类乳腺癌病理相关的上皮-内皮细胞间相互作用，与临床前模型保持一致。
- Enterprise Reuse：作为一个可扩展且适应性强的平台，适用于多种乳腺癌亚型及治疗方式。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低癌症-基质相互作用中的机制模糊性，提高预测可信度。
- 操作价值：在不同实验室和实验批次间提供标准化、可重复的三维培养结果。
- 战略价值：通过更早识别具有生物活性的化合物，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于靶点在多细胞环境中的作用，支持经风险调整的靶点优先排序。
实施注意事项
- 需要具备3D细胞培养技术和类球体操作的专业知识。
- 依赖相差显微镜和荧光显微镜的使用，用于监测和分析。
- 需要标准化的细胞标记、固定和切片操作流程，以确保结果的可比性。
- 在适配不同内皮细胞或癌细胞系时，需考虑优化条件。
- 受限于类球体回收过程需谨慎操作，以避免在后续处理中造成机械损伤。
