Name: 乳腺上皮和内皮细胞球状体作为乳腺癌研究的潜在功能 体外 模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解乳腺上皮细胞与内皮细胞球状体培养技术，用于研究乳腺癌细胞增殖与转移的分子机制。该三维模型为肿瘤病理生理学和治疗研究提供更可靠的体外实验平台。

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本研究获得了癌症研究基金会/瑞士癌症联盟授予RKD的KFS-4125-02-2017号基金以及美国国立卫生研究院授予EKJ的DK079307号基金的支持。

1. 细胞培养
注意：细胞操作需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>人脐静脉内皮细胞（HUVECs）传代培养
	<ol>
		<li>用胶原蛋白（5 µg/cm2，大鼠尾部来源）在室温下过夜（ON）或在37 °C下孵育2-3小时，对75 cm2培养瓶进行包被处理，然后用水冲洗，并让培养瓶自然干燥。</li>
		<li>在标准组织培养条件下（37 °C，5% CO2），将HUVECs培养于生长培养基（EBM-2，内皮基础培养基-2）中，该培养基需添加谷氨酰胺（1x = 2 mM）、抗生素-抗真菌素溶液（AA；含链霉素100 µg/mL、青霉素100 µg/mL和两性霉素B 0.025 µg/mL）、LSGS（2% v/v FCS、1 µg/mL氢化可的松、10 ng/mL人表皮生长因子、3 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子、10 µg/mL肝素）以及10% FCS（胎牛血清）。每2天更换一次培养基，直至细胞达到70%-80%融合度。</li>
		<li>用5 mL HBSS（不含Ca2+和Mg2+）洗涤未完全融合的细胞培养物，然后加入3 mL胰蛋白酶（0.25%，溶于HBSS，不含Ca2+和Mg2+）。 
		注：HBSS也可用PBS替代。</li>
		<li>在37 °C孵育2分钟（显微镜下检查细胞是否已脱落并变圆），然后加入6 mL含10% FCS的培养基（DMEM-F12或EBM-2，含10% FCS）以终止消化反应。</li>
		<li>在室温下以250 x g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于生长培养基中，接种至75 cm2培养瓶或培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>密歇根癌症基金会-7（MCF-7，人乳腺腺癌细胞）传代培养
	<ol>
		<li>在标准组织培养条件下（37 °C，5% CO2），将人乳腺癌细胞系在75 cm2培养瓶中培养于生长培养基（DMEM/F12培养基，添加商用谷氨酰胺（1x）、抗生素-抗真菌素溶液（AA；含链霉素100 µg/mL、青霉素100 µg/mL和两性霉素B 0.025 µg/mL）以及10% FCS&#160;中。每2-3天更换一次培养基。</li>
		<li>用5 mL HBSS（不含Ca2+和Mg2+）洗涤未完全融合的细胞培养物（70%-80%融合度），然后加入3 mL胰蛋白酶（0.5%，溶于HBSS，不含Ca2+和Mg2+），在37 °C孵育5分钟（显微镜下确认细胞是否已脱落）。 
		注：HBSS也可用PBS替代。</li>
		<li>加入8 mL含10% FCS的培养基以终止消化反应，在室温下以250 x g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于生长培养基中，接种至75 cm2培养瓶或培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 类球体形成
<ol>
	<li>将5 × 105 个细胞/mL（HUVECs和MCF-7）接种于3.5 cm圆形培养皿中，培养48小时。</li>
	<li>对已接种的细胞进行处理或转染，持续24小时或按需进行。</li>
	<li>可选步骤，在96孔U型底板中进行：用1 mL HBSS（含Ca2+和Mg2+）洗涤细胞，然后分别用蓝色染料（0.5 µg/mL）对HUVECs染色，绿色染料（0.5 µM）对MCF-7细胞染色，染料溶于相应的生长培养基中，随后将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30–40分钟。</li>
	<li>用1 mL HBSS（不含Ca2+和Mg2+）洗涤细胞，使用P1000移液器向每个圆形培养皿中加入1 mL酶解解离试剂（HUVECs使用0.25%胰蛋白酶，MCF-7使用0.5%胰蛋白酶），孵育2–5分钟，直至细胞脱落。</li>
	<li>将每种细胞分别收集至5 mL圆底聚苯乙烯管中，使用P1000移液器加入1 mL含10% FCS的培养基以终止酶反应。将细胞悬液在250 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，将细胞重悬于1 mL无类固醇培养基（EBM-2、谷氨酰胺、抗生素-抗真菌剂、0.4%去类固醇FCS（经活性炭处理））中。 
	注：无类固醇培养基可用正常生长培养基替代。</li>
	<li>取每种细胞悬液100 µL，用10 mL稀释液II（见材料表）稀释，用于测定总细胞数，并计算所需处理培养基（EBM-2、谷氨酰胺、抗生素-抗真菌剂、0.4%去类固醇FCS、溶剂/处理剂）的体积，以获得每种细胞浓度为5 × 103 个细胞/mL或3.4 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。
	<ol>
		<li>细胞计数
		<ol>
			<li>打开仪器，将稀释液II加入细胞计数小瓶中，按下功能和启动按钮（设置S3）进行冲洗。</li>
			<li>使用设置S4，按下启动按钮，用新鲜稀释液II测定空白值。</li>
			<li>将含100 µL细胞悬液与10 mL稀释液II混合的闪烁瓶替换原瓶，测量样品：设置S4并按下启动按钮。</li>
			<li>记录数字显示屏上的每毫升细胞数量。 
			&#8203;注：细胞计数也可使用其他手动或自动系统进行，如血细胞计数板网格线、光散射细胞计数技术、电阻抗法、基于成像的细胞染色系统（例如台盼蓝染色）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>96孔U型底板
		<ol>
			<li>分别准备5 mL每种细胞悬液（5 × 103 个细胞/mL），按1:1比例混合，最终体积为10 mL。</li>
			<li>使用手动多通道移液器将100 µL细胞悬液加入96孔U型底板的每一孔中。</li>
			<li>将培养板置于标准组织培养条件下培养，48小时后观察类球体形成情况。</li>
			<li>可选步骤：使用荧光体视显微镜拍摄类球体图像（40倍）。 
			注：该方法在48小时后可生成96个类球体（每孔一个类球体，面积1–2像素2），通常用于生长研究。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>悬滴法
		<ol>
			<li>将细胞悬液（3.4 × 105 个细胞/mL）按1:1比例混合，得到最终体积2 mL。</li>
			<li>使用P20移液器将细胞混合液以每滴15 µL的形式滴加至10 cm培养皿倒置的盖子上。</li>
			<li>将带有液滴的盖子倒置，并在培养皿底部加入5 mL基础培养基（EBM-2），以防止液滴蒸发。 
			&#8203;注：该方法在48小时后每滴形成一个类球体。确保液滴之间保持足够间距，以防翻转盖子时发生融合。必要时可使用多个10 cm培养皿。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类球体生长研究
<ol>
	<li>将100 µL HUVECs与MCF-7细胞混合液（每孔5 × 102个细胞）接种至96孔U型底培养板中，并放入培养箱中培养。</li>
	<li>接种48小时后，使用倒置显微镜（明场）观察类球体形成情况。在培养96小时时拍照（每组处理至少拍摄六张图片，放大倍数为40倍）。</li>
	<li>使用图像处理软件打开图片，将图像分辨率调整为300像素/英寸，并以tiff格式保存。</li>
	<li>下载ImageJ软件并打开。点击文件选项，进入打开。</li>
	<li>将感兴趣区域统一转换为饱和的黑色区域，以获得二值化图像（黑白图像）。为此，请选择图像选项，选择类型 | 8位。此时图像即为黑白图像。</li>
	<li>使用自由手绘选择工具勾画出类球体的边界。</li>
	<li>为计算感兴趣区域面积，并将目标或前景像素与背景像素分离，请使用阈值功能：选择图像选项，进入调整，点击阈值。</li>
	<li>此时将弹出“阈值”窗口。顶部滑块表示最小阈值：将数值设为零。底部滑块表示最大阈值：移动滑块直至感兴趣区域完全变为红色。 
	注：若颜色未显示为红色，请在阈值窗口中选择红色。</li>
	<li>进入分析 | 设置测量，选择面积和周长。</li>
	<li>为测量感兴趣区域面积，请选择分析选项，并使用分析颗粒工具。在分析颗粒窗口中，设置待测大小（0.00003-无穷大或3-无穷大，具体取决于类球体的大小），勾选汇总和显示结果，然后点击确定。</li>
	<li>结果将以图表形式显示。将测量数据复制到电子表格中进行数据分析。 
	&#8203;注：面积以总像素数计算；请使用“总面积”进行计算。</li>
</ol>
4. 类球体免疫组织化学研究
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>将 HUVEC 和 MCF-7 的细胞混合物（每孔 5 × 103 个细胞）接种于 96 孔 U 型底培养板中，使用 HUVEC 生长培养基培养 96 小时。</li>
		<li>使用剪去尖端的 P200 µL 移液枪头将约 50 个类球体收集至 1.5 mL 离心管中；静置使其自然沉降至管底，随后弃去上清液。</li>
		<li>用 500 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定类球体 1 小时。</li>
		<li>在磁力搅拌器加热板上煮沸 PBS 中的 2% Nobel 琼脂溶液 3–5 分钟，以完全溶解琼脂糖粉末，随后冷却至约 60 °C。</li>
		<li>用 P1000 移液器吸除 PFA，加入 500 µL PBS 洗涤类球体，并使其沉降，弃去上清液。</li>
		<li>小心地将 600 µL 琼脂糖溶液加入含有类球体的 1.5 mL 离心管中，立即将该管放入水平转子离心机中，在 177 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
		<li>在琼脂糖溶液中间加入一小段细绳，以便于将凝胶块从管中取出。</li>
		<li>将琼脂糖凝胶块置于冰上或 4 °C 冷却使其凝固。向 1.5 mL 离心管中加入 500 µL PBS，防止沉淀干燥。 
		&#8203;注意：样品现已准备好进行后续的脱水、石蜡包埋、切片、转移至载玻片以及免疫组化（IHC）染色（由 Sophistolab 完成）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集与处理
	<ol>
		<li>使用体视显微镜采集类球体切片的图像。</li>
		<li>将每个样品的三张图像保存为 .jpg 文件。</li>
		<li>打开 ImageJ 软件。打开 JPEG 图像，点击 文件，然后点击 打开。</li>
		<li>在 图像 菜单中选择 颜色 和 颜色反卷积。</li>
		<li>在颜色反卷积 1.7 窗口中选择 H DAB 向量，此时将显示三幅图像。 
		注意：这三幅图像分别为：颜色 1 仅表示苏木精染色（蓝色/紫色），颜色 2 仅表示 DAB 染色（棕色）。颜色 3 在双染色图像分析中不需要使用。</li>
		<li>选择 颜色 1 窗口并设置阈值：进入 图像 | 调整，点击 阈值，弹出 阈值 窗口。</li>
		<li>保持最小阈值为零，调整最大阈值以去除背景信号，同时不干扰真实信号。点击 应用。
		<ol>
			<li>面积测量
			<ol>
				<li>点击 分析，选择 设置测量。勾选 面积、平均灰度值 和 最小与最大灰度值，点击 确定 确认。</li>
				<li>使用 分析 菜单中的 测量 功能测量细胞核大小。 
				注意：结果 窗口将显示图像名称（标签）、图像大小（面积）、IHC 图像的平均像素强度（均值）以及最小和最大灰度值（最小值、最大值）。计算时使用均值。</li>
				<li>对 颜色 2（若为双重染色则还包括 颜色 3）窗口重复步骤 4.2.6–4.7.1.2。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>细胞定量
			<ol>
				<li>点击 处理，选择 二值化，然后选择 分水岭 以分离细胞。</li>
				<li>进入 分析 菜单，点击 分析颗粒。在弹出的 分析颗粒 窗口中，设置细胞大小以排除非特异性颗粒。接着在 显示 选项中点击下拉菜单，选择 轮廓，然后点击 确定。</li>
				<li>对 颜色 2（若为双重染色则还包括 颜色 3）窗口重复步骤 4.2.6–4.2.7 及细胞定量步骤（第 4.2.7.2 节）。 
				&#8203;注意：此时将出现三个窗口：1）汇总结果（计数细胞数、总面积、平均大小、面积百分比和均值），2）详细结果（对应被计数的细胞），3）绘图窗口（显示被计数细胞的轮廓图像）。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 类球体中的活/死染色
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，用DMSO配制4 mM的Calcein AM储备液（可将活细胞染成绿色）和2 mM的Ethidium homodimer储备液（可将死细胞染成红色）。</li>
	<li>计算所需溶液量，以便向每孔加入10 µL用EBM-2培养基按1:50稀释的Calcein AM与Ethidium homodimer混合染色液。</li>
	<li>将染色混合液加入类球体样本中，将培养板置于标准组织培养条件下，在培养箱中孵育30–60分钟。</li>
	<li>使用荧光体视显微镜获取图像（40倍）。</li>
</ol>
6. 类球体的蛋白质和RNA提取
<ol>
	<li>将每种细胞类型的细胞悬液调整至 3.4 × 105 个细胞/mL，按 1:1 比例混合，使用 P20 移液器将 15 µL 液滴接种于 10 cm 培养皿的皿盖上。将皿盖倒置后放入培养箱，在标准组织培养条件下孵育 96 小时。</li>
	<li>使用 5 mL 无菌聚苯乙烯移液管，加入 5–6 mL PBS 收集类球体，转移至 15 mL 圆底聚苯乙烯管中。 
	注意：也可使用 15 mL 锥形管。</li>
	<li>将类球体悬液在 250 × g&#160;条件下离心 5 分钟，随后小心吸除上清液。</li>
	<li>加入 500 µL 胰蛋白酶（100%），使用 P1000 移液器吹打 30 秒，使类球体解离，形成单细胞悬液。</li>
	<li>用含 10% 胎牛血清（FCS）的培养基中和胰蛋白酶，将试管在 250 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>根据制造商说明书（特定的无 DNA RNA 提取试剂盒），使用 300 µL RNA 裂解缓冲液裂解细胞沉淀。 
	注意：也可将裂解缓冲液直接加入完整类球体中（无需胰蛋白酶处理步骤）以提取 RNA。向沉淀的类球体中加入 300 µL 裂解缓冲液，将试管置于冰上，使用 P200 移液器吹打 10 次。随后按上述方法进行 RNA 提取。若因基质干扰导致 RNA 回收率较低，则可能需要进行类球体解离。</li>
	<li>或者，使用 70 µL 裂解缓冲液用于蛋白质提取。通过超声处理 2–4 秒进行匀浆，并根据制造商说明书使用 BCA 蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。 
	注意：对于蛋白质提取，可将沉淀的类球体直接加入裂解缓冲液中，随后进行超声处理。取 25 µg 总蛋白进行 Western 印迹分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与二维细胞培养相比，革命性的三维球体培养技术是一种更优且更强大的工具，可在体外重建器官的微环境、细胞间相互作用以及药物反应。in vitro。本方案是首个描述由多细胞（上皮和内皮）细胞系形成球体以用于乳腺癌研究的实验方法。该方案可确保球体在长达5天内维持三维球形生长状态，并可用于石蜡包埋、切片及组织学染色后观察。有趣的是，球体内部的细胞组分仍表达促进细胞生长的受体，并对增殖性和凋亡性刺激具有响应性。所述方案可产生足量的生物材料，用于蛋白质或RNA/DNA分析。上述共培养系统在实验室条件下易于实现且成本较低，可能在未来应用中具有优势，尤其适用于乳腺癌治疗及药物敏感性测试。此外，该方案可应用于不同类型的上皮和内皮细胞。
极难模拟 体外 一种存在的复杂组织 体内。这是因为 体内 组织由多种相互作用的组分构成，包括神经、血管、间充质和免疫细胞30,42本实验方案旨在通过采用包含两种不同类型细胞的三维共培...

使用动物进行实验存在局限性。动物研究无法准确模拟人类疾病的发展过程，且动物与人类对病原体的反应并不完全相同。此外，由于对动物痛苦的关切以及伦理问题，动物实验也受到限制。1,2 日益限制研究项目的开展。 体外 已广泛开发出各种系统以避免使用动物；此外，使用人类细胞已使得 体外 更适用于病理生理学和治疗研究的模型。传统的单层（2D）细胞培养因其在一定程度上能够模拟人体组织而被广泛使用。然而，2D单层培养无法模拟人体器官，也不能再现原始器官复杂的微环境，难以准确模拟器官功能 体内 情况3,4,5,6此外，在单层细胞培养中，药物处理可能容易导致所有细胞被破坏或损伤。重要的是，通过转为多层三维（3D）细胞培养，部分上述局限性可得以克服。7,8事实上，三维培养模型能够更好地反映原代组织中细胞的结构、排列方式和功能。这些三维培养物可使用多种细胞系形成，类似于功能性器官。目前主要有两种三维培养模型：一种是形成由细胞聚集并重组为球形结构的类球体（无支架模型）；另一种是生成类器官，其具有更复杂的结构，由多种器官特异性细胞组合而成，被视为器官的微型版本。9,10因此，三维培养系统作为一种创新技术，在生物学和临床领域具有广泛的应用前景。类球体和类器官在疾病建模、再生医学研究、药物筛选以及毒理学研究中具有多种应用。6,11,12,13,14,15. 源自三维技术的致癌性球体可重建相关细胞类型的形态和表型，模拟肿瘤微环境的关键特征 在体 肿瘤微环境，以及建模肿瘤发展过程中发挥作用的细胞通讯和信号通路16,17,18此外，为了加深对癌症生物学的理解，肿瘤类球体/类器官还可用于筛选潜在的个体化抗癌治疗方案（个性化治疗），并评估其疗效、毒性和长期影响。19,20,21,22类器官球已为病理生理学、疾病建模和药物筛选提供了重要研究机遇，因其能够维持细胞及三维组织结构，并可模拟 体内 情况以及细胞间的相互作用。然而，研究者也必须意识到该体系的局限性，例如缺乏血管/系统性组分、功能性免疫或神经系统，且相较于动物模型，该体系属于简化主义的研究方法。事实上，与动物模型相比，三维结构仅能近似模拟人体内的生物学环境。了解三维培养方法的这些局限性，有助于研究者设计出更为精细且有效的类器官生成流程，从而在更大尺度上更好地模拟器官功能。23,24,25.
癌症是全球首要的死亡原因，而乳腺癌是女性中最常见的癌症26,27,28为模拟乳腺癌复杂的微环境，应使用在乳腺肿瘤中起重要作用的细胞（如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和/或免疫细胞）来培养乳腺癌类球体。此外，用于代表乳腺癌的类球体还应考虑其雌激素/孕激素受体的表达情况、保留患者肿瘤组织学特征的能力，以及模拟治疗反应的能力。研究表明，三维共培养系统具有与原发组织相似的细胞排列结构。 体内，能够实时响应刺激，并具有功能性雄激素受体29,30,31,32因此，类似的方法可用于模拟乳腺肿瘤 体外本实验方案旨在建立一种生成乳腺癌球体的新方法。该方法利用雌激素受体阳性MCF-7细胞（一种永生化的人上皮细胞系）与血管内皮细胞（HUVECs）或淋巴管内皮细胞（HMVEC-DNeo）共同培养，构建能够模拟或高度接近肿瘤内这些细胞间相互作用的模型。尽管本研究中采用的是MCF-7（雌激素响应性）细胞和内皮细胞来生成球体，但未来也可加入其他类型的细胞，如成纤维细胞——其约占乳腺肿瘤质量的80%，以更真实地再现和模拟乳腺肿瘤的复杂结构。
形成球状体的方法有多种，例如：1）利用重力的悬滴法33,34；2）使用暴露于外加磁场的磁性纳米颗粒的磁悬浮法35；以及3）通过将细胞接种于低吸附培养板上进行的球状体微孔板法36,37。在仅使用一种细胞类型的现有方法基础上，本实验方案已通过优化采用上皮细胞和内皮细胞共培养，以更好地模拟乳腺癌肿瘤在体内的生长条件in vivo38,39,40,41。该方法可在实验室中以低成本和最少的设备需求轻松实现。根据实验室的具体需求或研究目标，采用了不同的方法来形成球状体，并从中获取相关的细胞材料。在此背景下，若需进行DNA、RNA或蛋白质分析，则采用悬滴法共培养内皮细胞和上皮细胞以生成三维球状体；而对于功能研究，例如在短干扰RNA（siRNA）转染和/或激素处理后监测细胞生长情况，则使用U型底培养板生成球状体。
本技术方案的目的是提供详细的分步操作说明，用于：1）形成乳腺癌多细胞型球体，2）制备组织学染色样品，以及3）收集细胞以提取RNA、DNA和蛋白质。本方案采用成本较低的悬滴法和成本较高的U型底培养板法来形成球体。本文提供了一套用于制备（固定）球体以进行切片，并随后使用标志物进行免疫染色，以评估球体内细胞增殖、细胞凋亡以及上皮细胞和内皮细胞分布的完整方案。此外，本方案还展示了使用ImageJ软件对组织学数据进行完整分步分析的方法。生物学数据的解读因实验类型和所用抗体的不同而有所差异。固定后球体的切片及后续切片染色由常规病理实验室（Sophistolab：info@sophistolab.ch）完成。

<table><tbody><tr><td>100 mm &amp;times; 20 mm 组织培养处理培养皿</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>149MULTI0C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管，聚苯乙烯材质，独立包装，无菌</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td></td><td></td><td>版本：13.0.1 (64位)</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌溶液（100&amp;times;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>CD31（分化簇31）</td><td>Cell Marque</td><td>131M-95</td><td>单克隆小鼠抗体，克隆号 JC70</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CK8/18（细胞角蛋白8和18）</td><td>DBS</td><td>Mob189-05</td><td>单克隆小鼠抗体，克隆号 5D3</td></tr><tr><td>CKX41 倒置显微镜</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td>Olympus DP27 数码相机</td></tr><tr><td>裂解型 Caspase 3</td><td>Cell Signaling</td><td>9661L</td><td>多克隆兔抗体</td></tr><tr><td>胶原蛋白（大鼠尾来源）</td><td>Roche</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>Coulter ISOTON II 稀释液</td><td>Beckman Coulter</td><td>844 80 11</td><td>Diluent II</td></tr><tr><td>Coulter Z1 细胞计数器</td><td>Coulter Electronics, Luton, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱水培养基： Noble 琼脂</td><td>BD Difco</td><td>BD 214220</td><td></td></tr><tr><td>真皮微血管内皮细胞，新生儿，混合供体（HMVEC-DNeo）</td><td>Lonza</td><td>CC-2516</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基/F-12 Ham 营养混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6434</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 内皮细胞生长基础培养基-2</td><td>Lonza</td><td>190860</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙啶同聚体（Ethidium homodimer）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>活性炭处理胎牛血清（FCS sf）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3006803</td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FA 荧光体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂（100×）</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙、无镁、无酚红</td><td>Gibco</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC &amp;ndash; 人脐静脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td>Wayne Rasband&lt;br/&gt; 版本：1.52a (64位)</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Cell Marque</td><td>275R-16</td><td>单克隆兔抗体，克隆号 SP6</td></tr><tr><td>Leica 全自动荧光体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Leica Histocore Multicut 旋转式切片机</td><td></td><td>149MULTI0C1</td><td></td></tr><tr><td>低血清生长补充剂试剂盒（LSGS 试剂盒）</td><td>Gibco</td><td>S003K</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 细胞 &amp;ndash; 人乳腺腺癌细胞系</td><td>苏黎世大学医院妇产科诊所</td><td></td><td>由 Andr&amp;egrave; Fedier 博士提供，源自 ATCC</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96U 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174925</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）1×</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>蛋白裂解缓冲液</td><td>Cell Signaling, Danvers, USA</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA 小量提取试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>RNA 裂解缓冲液</td><td>Zymo Research</td><td>R1060-1-100</td><td>Quick-RNA 小量提取试剂盒组分</td></tr><tr><td>Rotina 46R 离心机</td><td>Hettich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯管，5 mL</td><td>Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 系列 M200 酶标仪</td><td>Tecan, Salzburg, AU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶 75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr></tbody></table>

乳腺上皮和内皮细胞球体作为乳腺癌研究潜在的功能性体外模型

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

乳腺癌是导致女性死亡的主要原因。乳腺癌细胞的生长及其后续转移是疾病进展的关键因素。尽管已有大量研究采用MCF-7细胞等乳腺癌细胞的单层培养体系来探讨促进乳腺癌生长的相关机制，但对于其他与肿瘤生长密切相关细胞类型（如血管和淋巴管内皮细胞）的作用，尚缺乏深入研究。细胞间的相互作用在肿瘤生长和进展过程中发挥着关键作用。新生血管形成（即血管生成）对肿瘤生长至关重要，而淋巴系统则为癌细胞迁移及后续转移提供了通路。近期研究表明，血管和淋巴管内皮细胞可显著影响癌细胞的生长。这些发现提示有必要开发 体外 更真实地反映乳腺癌生长过程的模型 体内此外，动物研究中的限制要求开发出 离体 模型以更清楚地阐明所涉及的机制。
本文描述了由乳腺癌细胞（雌激素受体阳性的MCF-7细胞）和血管及/或淋巴内皮细胞共同组成的乳腺癌类球体的构建方法。该实验方案详细阐述了两种构建双细胞类球体的方法：悬滴法（金标准且成本较低）和96孔U型底板法（成本较高），并提供了逐步操作指南。文中还详细说明了如何精细地挑取已形成的类球体，通过显微测量监测其生长情况，并利用死/活细胞染色评估其活力。此外，本文还列出了固定类球体以进行切片处理，以及使用特异性生长抗体染色以区分类球体中不同生长模式的操作步骤。同时，提供了构建转染细胞类球体的具体方法，以及提取RNA用于分子分析的技术细节。总之，本文为乳腺癌研究中多细胞类球体的制备提供了详尽的操作指导。

使用上皮细胞和内皮细胞共培养的类球体模型，可更紧密地模拟 体内 乳腺肿瘤的条件 体外 实验。图示方案在 图1 展示了一种利用乳腺癌上皮细胞与血管或淋巴管内皮细胞形成球状体的实验方案图1）。每种细胞类型分别接种于3.5 cm圆形培养皿中，并使用Lipofectamine转染寡核苷酸或加入生长刺激剂/抑制剂进行处理。上皮或内皮细胞经胰蛋白酶消化后收集融合的单层细胞，洗涤并按1:1比例混合。随后将细胞接种至96孔U型底培养板中（图1A）或置于直径10 cm圆形培养皿倒置的皿盖上，以利于悬滴培养（图1B接种后不久，细胞会呈现为每个孔或液滴底部扁平且致密的单层细胞，随后随时间推移（24–48 小时）逐渐聚集，于 48 小时形成完整的球状体。为防止对松散形成的细胞聚集体造成损伤，培养板在至少 24 小时内不得扰动。
在U型...

乳腺上皮细胞与内皮细胞之间的串扰在乳腺癌进展、肿瘤生长及转移中起着重要作用。本研究利用乳腺癌细胞与血管和/或淋巴管内皮细胞共同构建球状体，并验证其作为研究模型的适用性 体外 乳腺癌研究系统

乳腺癌是导致女性死亡的首要原因。乳腺癌细胞的生长及其随后的转移是其……

本文所述的乳腺癌细胞球体将使研究人员能够探究参与癌细胞增殖和转移过程中的癌细胞与内皮细胞相互作用的分子机制。该三维模型的主要优势在于其提供了更为真实的细胞排列方式，从而提高了关于乳腺癌病理生理学及治疗研究推论的可靠性。本实验操作将由我实验室的博士生 Giovanna Azzarito 进行示范。首先将接种的细胞处理或转染24小时，或根据需要进行相应处理。为鉴定类球体中的细胞分布，使用含钙和镁的一毫升汉克斯平衡盐溶液（Hanks' Balanced Salt Solution，HBSS）洗涤细胞，并在HUVECs中加入0.5微克/毫升的蓝色染料，在MCF-7细胞中加入0.5微摩尔的绿色染料，绿色染料用相应的生长培养基稀释。将培养板放入37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育30至40分钟。用1毫升不含钙和镁的HBSS洗涤细胞。然后使用P1000移液器向每孔棕色培养皿中加入1毫升酶解解离试剂，HUVEC细胞使用0.25%胰蛋白酶，MCF-7细胞使用0.5%胰蛋白酶。使用P1000移液器，在5毫升圆底聚苯乙烯管中分别收集每种细胞类型，并加入1毫升含10%胎牛血清（Fetal Calf Serum，FCS）的培养基以终止酶反应。随后，以250 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并将细胞重悬于1毫升无类固醇培养基中。使用100微升每种细胞悬液，用10毫升稀释液2稀释后，测定总细胞数。打开仪器，将稀释液2加入细胞计数仪样品瓶中，按下功能键和启动键进行冲洗。设置参数为4，加入新鲜的稀释液2溶液后按下启动键测定空白值。将闪烁瓶更换为含有100微升细胞悬液的10毫升稀释液2溶液。采用设置四并按下启动键以测量样品。记录数字显示屏上每毫升的细胞数量，然后分别准备5毫升的每种细胞悬液，并按1:1比例混合，得到最终体积为10毫升的混合液，使用手动多通道移液器将100微升细胞悬液移入96孔U型底板的每个孔中。将培养板置于标准组织培养条件下孵育，并在48小时后检查球状体形成情况。使用相差或荧光体视显微镜在40倍放大倍数下拍摄这些球状体的图像。为制备悬滴培养，将细胞悬液按1:1比例混合，以获得终体积为2毫升的混合液。使用 P20 移液器将细胞混合物以 15 微升液滴的形式滴加到直径 10 厘米培养皿的倒置皿盖上。将带有液滴的皿盖倒置，并在培养皿底部加入 5 毫升 EBM-2 基础培养基，以防止液滴蒸发。使用 P200 微升移液器的吸头，将约 50 个球状体收集至 1.5 毫升离心管中。让其依靠重力沉降至管底，然后弃去上清液。用500微升4%多聚甲醛在室温下固定这些球状体1小时。将2% Nobl agar溶液加入PBS中，使用带磁力搅拌的加热板煮沸3至5分钟，以完全溶解琼脂粉，随后冷却至约60摄氏度。用 P1000 移液器移除 PFA，加入 500 微升 PBS 洗涤类球体，并使其沉降。沉降完成后，小心弃去上清液，用移液器向含有类球体的 1.5 毫升离心管中加入 600 微升 Agora 溶液，并立即将离心管放入水平转子离心机中，在 177 × g 条件下离心 2 分钟。在 Agro 溶液中间加入一小段细绳，以便于将凝胶塞从离心管中取出。将Agros凝胶在冰上固化，或在4摄氏度条件下向1.5毫升离心管中加入500微升PBS，以防止沉淀物干燥。使用体视显微镜获取球状体切片的图像。计算所需溶液的量，以便向每孔加入10微升染料混合液，该混合液由钙黄绿素AAM和碘化乙啶同型二聚体用EBM-2培养基按1:50比例稀释而成。将染色混合物加入类球体中，将培养板置于标准组织培养条件下孵育30至60分钟。使用荧光体视显微镜以40倍放大倍数采集图像。在U型底培养板中，接种MCF seven细胞48小时后可观察到类球体的形成。然而，内皮细胞或淋巴管细胞并未观察到球体形成。将MCF7细胞与内皮细胞或MCF7细胞与淋巴管细胞以1:1比例共接种，也可形成球体。记录了MCF7球体从24至120小时的时间依赖性顺序生长过程。在五天内，类球体的大小从约100微米增加到约200微米。使用生长刺激剂处理的类球体观察到生长速率加快。在脂质体存在下转染对照寡核苷酸后，类球体的结构及其细胞形态未出现异常。表达增殖标志物 Ki-67 的细胞在该类球状体中呈均匀分布。对该类球状体进行 caspase-3 染色显示，培养四天后出现无活性细胞。通过 CD-31 和 Ki-67 对该类球状体中的细胞进行研究发现，55% 的细胞为上皮细胞，45% 为内皮细胞，其中 25% 的细胞处于增殖状态。为了评估活细胞和死细胞的比例，使用钙黄绿素AAM和碘化丙啶同型二聚体对培养四天的球状体进行染色。对新鲜制备的球状体进行活/死细胞染色的结果显示，球状体对冻存条件非常敏感。在执行本方案时，务必使用健康的细胞来制备球状体。另外需要注意的是，在DP帽过程中应避免损伤球状体，以获得良好的切片，同时在凝胶聚合前确保将球状体摆放至合适位置。通过纳入其他细胞（如参与肿瘤进展的成纤维细胞）并利用该模型评估靶向癌症生长的治疗剂的有效性，可进一步改进该模型。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

乳腺上皮和内皮细胞球状体作为乳腺癌研究的潜在功能 体外 模型

本文描述了一种在三维胶原凝胶中定量检测转化生长因子（TGF）-β诱导侵袭的实验方法。该方法利用代表乳腺癌不同发展阶段的MCF10A系列细胞系，也可适用于其他细胞系，并可用于研究其他潜在的侵袭激活剂或抑制剂。...

用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

本文描述了一种分析组织成纤维细胞对相关上皮细胞影响的简单方法。该方法与三维组织培养相结合，可促进从三维结构中分离后细胞的分析。该技术适用于具有不同恶性潜能的细胞，有助于系统研究肿瘤相关间质对肿瘤细胞的影响。...

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我们描述了一种适用于研究激素作用的人类乳腺上皮三维培养模型。...

一种激素响应性的人类乳腺上皮三维培养模型

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。...

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

本方案提供了用于评估人乳腺细胞转化的体外实验工具。文中详细描述了检测细胞增殖速率、非贴壁依赖性生长能力，以及在含有基底膜基质的三维培养中细胞谱系分布的实验步骤。...

人乳腺上皮细胞中癌基因转化的体外评估

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

全面的 体外 缺乏能够真实再现相关人类疾病的模型。本研究介绍了三维（3D）肿瘤球体的构建与培养，一种可靠的 体外...

一种用于研究肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的三维球状模型

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。...

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。...

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

了解乳腺上皮细胞与内皮细胞球状体培养技术，用于研究乳腺癌细胞增殖与转移的分子机制。该三维模型为肿瘤病理生理学和治疗研究提供更可靠的体外实验平台。

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